Methodenartikel

Hochpräzisions-FRET auf Einzelmolekül-Niveau für die Bestimmung der Biomolekülstruktur

DOI:

10.3791/55623

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13. Mai 2017

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1Department of Chemistry, Clemson University, 2Department of Physics and Astronomy, Clemson University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center for Membrane Biology, Graduate School for Biomedical Sciences, University of Texas Health Science Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Ein Protokoll für hochpräzise FRET-Experimente auf der Ebene der einzelnen Moleküle wird hier vorgestellt. Zusätzlich kann diese Methodik verwendet werden, um drei Konformationszustände in der Ligandenbindungsdomäne des N-Methyl-D-aspartat (NMDA) -Rezeptors zu identifizieren. Die Bestimmung von präzisen Abständen ist der erste Schritt zum Aufbau von Strukturmodellen auf der Basis von FRET-Experimenten.

Zusammenfassung

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Ein Protokoll zur Durchführung von hochpräzisen Interdye-Distanzmessungen mit Förster-Resonanz-Energietransfer (FRET) auf der Einzelmolekül-Ebene im Multiplex-Fluoreszenz-Nachweis (MFD) -Modus wird hier vorgestellt. MFD maximiert die Nutzung aller "Dimensionen" der Fluoreszenz, um photophysikalische und experimentelle Artefakte zu reduzieren und ermöglicht die Messung der Interdye-Distanz mit einer Genauigkeit bis zu ~ 1 Å in starren Biomolekülen. Diese Methode wurde verwendet, um drei Konformationszustände der Ligandenbindungsdomäne des N-Methyl-D-aspartat (NMDA) -Rezeptors zu identifizieren, um die Aktivierung des Rezeptors bei der Ligandenbindung zu erklären. Beim Vergleich der bekannten kristallographischen Strukturen mit experimentellen Messungen stimmten sie innerhalb von weniger als 3 Å für mehr dynamische Biomoleküle zu. Das Sammeln eines Satzes von Abstandsbeschränkungen, die die gesamte Dimensionalität der Biomoleküle abdecken, würde es ermöglichen, ein Strukturmodell eines dynamischen Biomoleküls bereitzustellenEs

Einleitung

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Ein wesentliches Ziel der strukturellen Biologie ist es, die Beziehung zwischen Struktur und Funktion von biomolekularen Maschinen zu entschlüsseln. Der erste visuelle Eindruck von Biomolekülen ( zB Proteine ​​und Nukleinsäuren) trat in den 1950er Jahren durch die Entwicklung der Röntgenkristallographie 1 , 2 auf . Die Röntgenkristallographie liefert hochauflösende, statische Strukturinformationen, die durch die Kristallpackung eingeschränkt werden. Daher scheut die inhärente Unbeweglichkeit von Röntgenstrukturmodellen die dynamische Natur von Biomolekülen, ein Faktor, der die meisten biologischen Funktionen 3 , 4 , 5 beeinflusst. Kernmagnetische Resonanz (NMR) 6 , 7 , 8 lieferte eine alternative Lösung für das Problem durch die Lösung von Strukturmodellen in wässrigen Lösungen. Ein großer VorteilVon NMR ist seine Fähigkeit, die intrinsische Dynamik von Biomolekülen und Konformationsensembles wiederherzustellen, was hilft, die intrinsischen Beziehungen zwischen Struktur, Dynamik und Funktion 3 , 4 , 5 zu klären. Trotzdem erfordert NMR, begrenzt durch Stichprobengröße und große Probenmengen, komplexe Etikettierungsstrategien für größere Systeme. Daher besteht ein dringender Bedarf, alternative Methoden in der Strukturbiologie zu entwickeln.

Historisch gesehen hat die Förster-Resonanz-Energieübertragung (FRET) 9 in der Strukturbiologie keine wichtige Rolle gehabt, weil das FRÜSSE, dass FRET mit einer geringen Genauigkeitsmessung ausgestattet ist. Es ist der Zweck dieses Protokolls, die Fähigkeit von FRET zu überprüfen, um Entfernungen auf der Nanometer-Skala zu bestimmen, so dass diese Abstände für den Aufbau von Strukturmodellen von Biomolekülen verwendet werden können. Die erste experimentelle VerifikationDie Abweichung von der R - 6 - Abhängigkeit von der FRET - Effizienz wurde von Stryer im Jahre 1967 10 durch Messung von Polyprolinen verschiedener Längen als "spektroskopisches Lineal" durchgeführt. Ein ähnliches Experiment wurde auf der Einzelmolekül-Ebene im Jahr 2005 erreicht 11 . Polyprolin-Moleküle erwiesen sich als nicht-ideal, und so wurden doppelsträngige DNA-Moleküle später verwendet 12 . Dies öffnete das Fenster für präzise Abstandsmessungen und die Idee, FRET zu verwenden, um strukturelle Eigenschaften von Biomolekülen zu identifizieren.

FRET ist optimal, wenn der Interdye-Distanzbereich von ~ 0.6-1.3 R 0 liegt , wobei R 0 der Förster-Abstand ist. Für typische Fluorophore, die in Einzelmolekül-FRET-Experimenten verwendet werden, beträgt R & sub0 ; ~ 50 Å. Typischerweise bietet FRET viele Vorteile gegenüber anderen Methoden in seiner Fähigkeit, die Strukturen und Dynamiken zu lösen und zu differenzierenHeterogene Systeme: (i) Aufgrund der ultimativen Empfindlichkeit der Fluoreszenz können einzelne Molekül-FRET-Experimente 13 , 14 , 15 , 16 heterogene Ensembles durch direktes Zählen und gleichzeitiges Charakterisieren der Strukturen ihrer einzelnen Mitglieder lösen. (Ii) Komplexe Reaktionswege können in Einzelmolekül-FRET-Studien direkt entschlüsselt werden, da keine Synchronisation eines Ensembles erforderlich ist. (Iii) FRET kann auf eine breite Palette von zeitlichen Domänen zugreifen, die sich über 10 Jahrzehnte erstrecken und eine Vielzahl von biologisch relevanten Dynamiken abdecken. (Iv) FRET-Experimente können in beliebigen Lösungsbedingungen sowohl in vitro als auch in vivo durchgeführt werden. Die Kombination von FRET mit Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht die Untersuchung molekularer Strukturen und Wechselwirkungen direkt in lebenden Zellen 15 , 16 , Sup> 17 , 18 , 19 , auch mit hoher Präzision 20 . (V) FRET kann auf Systeme von nahezu jeder Grße angewendet werden ( z. B. Polyprolin-Oligomere 21 , 22 , 23 , 24 , Hsp90 25 , HIV-Reverse-Transkriptase 26 und Ribosomen 27 ). (Vi) Schließlich könnte ein Netzwerk von Abständen, das alle Dimensionalitäten von Biomolekülen enthält, verwendet werden, um strukturelle Modelle von statischen oder dynamischen Molekülen 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,Ref "> 35 , 36 , 37 .

Daher kann die Einzelmolekül-FRET-Spektroskopie verwendet werden, um Abstände abzuleiten, die präzise genug sind, um für die Distanz-zurückhaltende Strukturmodellierung verwendet zu werden 26 . Dies ist möglich, indem man die Multiparameter-Fluoreszenzdetektion (MFD) 28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , die acht Dimensionen von Fluoreszenzinformationen verwendet ( dh Anregungsspektrum, Fluoreszenzspektrum, Anisotropie, Fluoreszenzlebensdauer, Fluoreszenzquantenausbeute, Makroskopische Zeit, die Fluoreszenzintensitäten und der Abstand zwischen den Fluorophoren), um genau und präzise Abstandsbeschränkungen zu liefern. Zusätzlich wird die gepulste verschachtelte Erregung (PIE) mit MFD kombiniert(PIE-MFD) 42, um die direkte Anregungsakzeptorfluoreszenz zu überwachen und Einzelmolekülereignisse auszuwählen, die aus Proben resultieren, die eine 1: 1-Donor-zu-Akzeptor-Stöchiometrie enthalten. Ein typischer PIE-MFD-Aufbau verwendet zwei gepulste verschachtelte Anregungslaser, die mit einem konfokalen Mikroskopkörper verbunden sind, wobei die Photonendetektion in vier verschiedene Kanäle in verschiedenen Spektralfenstern und Polarisationseigenschaften aufgeteilt wird. Weitere Details finden Sie in Abbildung 1 .

Es ist wichtig zu beachten, dass FRET mit rechnerischen Methoden kombiniert werden muss, um atomistische Strukturmodelle zu erreichen, die mit den FRET-Ergebnissen 26 , 30 übereinstimmen. Es ist nicht das Ziel des vorliegenden Protokolls, über die damit verbundene Methodik zu gehen, um Strukturmodelle mit FRET-abgeleiteten Abständen zu erstellen. Diese Ansätze wurden jedoch in Kombination mit anderen Techniken ( z. B. Kleinwinkel-Röntgenstreuung) angewendetOder Elektronen-paramagnetische Resonanz), die Geburten des Feldes der integrativen Strukturbiologie 43 , 44 , 45 , 46 . Das aktuelle Ziel ist es, den Weg für FRET als quantitatives Werkzeug in der Strukturbiologie zu ebnen. Als Beispiel wurde diese Methode verwendet, um drei Konformationszustände in der Ligandenbindungsdomäne (LBD) des N-Methyl-D-aspartat (NMDA) -Rezeptors zu identifizieren. Ziel ist es, die vorgenannten Einschränkungen zu überwinden und FRET zu den integrativen Methoden zu bringen, die für die strukturelle Bestimmung von Biomolekülen verwendet werden, indem gemessene Distanzen mit hoher Präzision bereitgestellt werden.

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Protokoll

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1. PBS-Puffer-Vorbereitung und Kammerbehandlung

HINWEIS: Bei der Durchführung von nasschemischen Experimenten einen Laborkittel und Einweghandschuhe tragen. Verwenden Sie den Augenschutz beim Ausrichten des Lasers.

  1. PBS-Pufferzubereitung
    1. Man löst 4,5 g Na 2 HPO 4 , 0,44 g NaH 2 PO 4 und 3,5 g NaCl in 400 ml destilliertem Wasser. Sicherstellen eines pH-Werts von 7,5 und Sterilisieren der Lösung durch Autoklavieren auf einem Flüssigkeitszyklus für 1 h (abhängig vom Autoklaven-System).
    2. Nehmen Sie 15 ml der PBS-Lösung und mischen Sie sie mit 0,1 g Holzkohle. Filtriere die Mischung unter Verwendung eines regelmäßigen 20-ml-Spritzenfilters mit einer Porengröße von 0,2 μm . Den PBS-Puffer bei Raumtemperatur abdichten und lagern.
  2. Mikroskop-Kammer-Deckglas-Behandlung
    1. Fügen Sie 500 μl destilliertes Wasser und 5 μl Polysorbat 20 nichtionisches Tensid hinzu (siehe Materialliste)Zu einem Kammerdeckel-Glas-System (siehe Materialliste) und gut mischen. Lassen Sie es für 30 min einweichen. Entfernen Sie die Polysorbat-20-Lösung und waschen Sie die Kammer zweimal mit destilliertem Wasser. Lass es trocknen.
      HINWEIS: Die Kammer ist jetzt gebrauchsfertig.

2. DNA-Probenvorbereitung

HINWEIS: Für die Erstellung von doppelsträngigen DNA (dsDNA) Standardproben verwenden Sie entworfene markierte DNA-Stränge (siehe Materialliste). Entworfene Oligos dürfen keine Farbstoffe am Ende eines Polymers haben, um Artefakte zu vermeiden, die den bestimmten Abstand beeinträchtigen können. Die DNA-Sequenz sollte so gewählt werden, dass sie sich als starrer Körper verhält.

  1. Füge 1,5 μl eines Donor-markierten DNA-Strangs und 4,5 μl eines komplementären (Akzeptor-markierten oder nicht markierten) DNA-Strangs in ein Mikrofugenröhrchen ein und vermische sie mit 24 μl nukleasefreiem Wasser.
    HINWEIS: Abhängig von der Mischung der ausgewählten Oligonukleotide werden die folgenden Proben erzeugt: no-FRET, loW-FRET oder hoch-FRET dsDNAs.
  2. Hybridisierung der DNA unter Verwendung eines thermischen Mischers und des folgenden Verfahrens: 95 ° C für 10 min, 90 ° C für 10 min, 80 ° C für 10 min, 70 ° C für 10 min, 60 ° C für 10 min, 50 ° C Für 10 min, 40 ° C für 10 min, 30 ° C für 10 min, 20 ° C für 10 min, 10 ° C für 10 min und Halten bei 5 ° C.
    HINWEIS: Die erzeugten dsDNA-Standards können in einem -20 ° C Gefrierschrank für Langzeitlagerung gehalten werden oder können sofort verwendet werden.

3. Proteinprobenvorbereitung

Anmerkung: Ausgehend von rekombinanter DNA für die Expression des Proteins von Interesse an bakteriellen Systemen ist es möglich, die Reste zu mutieren, aus denen die Abstände in Cysteine ​​gemessen werden sollen. Um dies zu tun, verwenden Sie standard site-gerichtete Mutagenesetechniken 47 . Um die Proteinreinigung zu erleichtern, klonieren Sie die rekombinante und mutierte DNA in einen Vektor, der ein Reinigungsetikett enthält ( z.Ein His-Tag). Die Glutamat-Untereinheit 1 Ligand-bindende Domäne (LBD) aus dem NMDA-Glutamat-ionotropen Rezeptor (GluN1) LBD ( dh NMDA GluN1 LBD, kloniert in den pET-22b (+) - Vektor) wurde verwendet.

  1. Proteinausdruck
    1. Transformieren Sie das Konstrukt-DNA-Plasmid in das Expressions-System der Wahl 48 .
      HINWEIS: Die folgenden Schritte gehen davon aus, dass die Expression eines löslichen Proteins in Escherichia coli transformiert wird . Eine Reinigung von beispielsweise transfizierten Säugetierzellen 49 oder transduzierten Insektenzellen 50 ist ebenfalls möglich, und detaillierte Schritte können an anderer Stelle gefunden werden. Stellen Sie sicher, dass der ausgewählte E. coli- Stamm für das interessierende Protein geeignet ist. Zum Beispiel erfordert die Expression von Proteinen, die Disulfidbrücken enthalten, einen Stamm von kompetenten Zellen mit einem weniger reduzierenden intrazellulären Kompartiment (siehe Materialliste).
    2. Inokulieren Sie einen Starter E Coli Kultur unter Verwendung einer sterilen Pipettenspitze, um eine einzelne umgewandelte Kolonie 48 aufzunehmen. Füllen Sie es in 100 ml selektives LB-Medium (siehe Materialliste) und lassen Sie die Kultur über Nacht bei 37 ° C wachsen.
    3. LB-Brühe vorbereiten (siehe Materialliste). Autoklav es zu sterilisieren.
    4. Inokulieren von Großkulturen von transformiertem E. coli durch Zugabe der Übernachtkultur zu 2 l selektivem LB-Medium bei einem Verhältnis von 1: 500
    5. In den nächsten Stunden beurteilen Sie das Wachstum der Kultur durch die Überwachung der Absorptionswerte (Abs) der Kultur bei 600 nm, die manchmal als optische Dichte bei 600 nm (OD 600 ) bezeichnet werden, oder durch Verwendung eines Zelldichtemessers. Beachten Sie, dass die Messwerte im Laufe der Zeit zunehmen.
    6. Induzieren Sie die Proteinexpression mit einer Endkonzentration von 0,5 mM Isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG), wenn die Kultur eine OD 600 von 0,7 erreicht. Shake induzierte E. coli bei 20 ° C für 20-24 h
    7. Nach der Proteininduktion wird das E. coli durch 20 Minuten lang bei 3000 xg und 4 ° C gepinnt. Verwerfen Sie den Überstand und lagern Sie das E. coli- Pellet, das das intrazelluläre Protein enthält, bei -80 ° C bis zur Verwendung.
  2. Proteinreinigung
    1. Lyse E. coli mit einer Lyse-Methode der Wahl ( zB Beschallung, französische Presse, Stickstoff-Kavitation, etc. ) 51 .
    2. Die Membran und den Zelltrümmer abschleudern, indem man das Lysat 1 h bei 185000 xg und 4 ° C zentrifugiert.
    3. Für ein His-markiertes Protein laden Sie den Überstand auf eine äquilibrierte, nickelgeladene, immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) -Säule unter Verwendung eines Fast-Protein-Flüssigchromatographie-Systems (FPLC) (siehe Materialtabelle ) 52 .
      HINWEIS: Äquilibrierungspuffer für das NMDA GluN1 LBD: 200 mM NaCl, 20 mM Tris und 1 mM Glycin, pH 8. Elutionspuffer für NMDA GluN1 LBD: 200 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM Glycin und 400 mM Imidazol, pH 8.
      1. Waschen Sie die IMAC-Säule mit Puffer, der eine geringe Menge (~ 12 mM) Imidazol enthält.
      2. Eluieren Sie das Protein aus der IMAC-Säule unter Verwendung eines linearen Gradienten von Imidazol von 12 mM bis 400 mM.
    4. Dialyse des Proteins über Nacht in Äquilibrierungspuffer ohne Imidazol 53 , indem das Eluat aus Schritt 3.2.3.2 in Dialyseschlauch gegeben und in den Äquilibrierungspuffer unter kontinuierlichem Rühren für 2-3 Stunden untergetaucht wird. Wiederholen Sie mindestens ein weiteres Mal.
      HINWEIS: Die Schritte 3.2.3-3.2.6 nehmen die Reinigung eines His-markierten Proteins an. Wenn Sie durch eine andere Methode reinigen, passen Sie das Protokoll entsprechend an.
    5. Quantifizieren Sie die Proteinmenge, indem Sie die Extinktion bei 280 nm des dialysierten Proteins und unter Verwendung des Biergesetzes ( Absorptionseinheit = ε L c , wobei ε Ist der Extinktionskoeffizient (M -1 cm -1), Die hier erhalten werden können 54 ; L ist die Lichtweglänge (cm); Und c die Proteinkonzentration (M) ist).
      ANMERKUNG: Verschiedene Proteinquantifizierungsassays sind verfügbar, einschließlich des Bradford-Assays und des Bicinchoninsäure-Tests. Beide liefern genaue Ergebnisse.
  3. Protein-Etikettierung
    1. Addieren Sie Spender (Maleinimid reaktive Cyan-Grün-Farbstoff) und Akzeptor (Maleimid reaktive far-red Farbstoff) Fluorophore an das gereinigte Protein bei einem 1: 1: 8-Protein: Donor: Akzeptor-Molverhältnis.
    2. Inkubieren Sie die Protein- und Fluorophormischung auf Eis für 30 min. Längere Inkubationszeiten sind möglich.
    3. Packen Sie eine 0,5 ml Ni-Nitrilotriessigsäure (Ni-NTA) -Agarose-Säule (siehe Materialliste) und equilibrieren Sie sie mit dem gleichen Äquilibrierungspuffer wie in Schritt 3.2.3, während das Protein inkubiert.
      HINWEIS: Halten Sie die Menge des geladenen Proteins entsprechend der Harzbindungskapazität.
    4. Nach 30 minKubation, laden die Protein / Fluorophor-Mischung auf die in Schritt 3.3.3 hergestellte Säule und reinigen durch Schwerkraftströmung.
    5. Abwässern von überschüssigem Fluorophor mit 5 ml Äquilibrierungspuffer.
    6. Eluieren Sie das markierte Protein durch Schwerkraft aus der Säule viermal mit 0,5 ml Elutionspuffer. Da das Protein bereits aus anderen Proteinen gereinigt wurde, ist kein Gradient notwendig.
    7. Überprüfen Sie jedes Eluat mit einem UV-Vis-Spektrometer, um zu identifizieren, welche Fraktion das markierte Protein enthält. Die Absorption von 230-700 nm abtasten, um sicherzustellen, dass die Absorptionsspitzen vom Protein (280 nm) und jedes Fluorophor (493 nm für das Cyan-Green-Fluorophor und 651 nm für den fernen Rot-Fluorophor) sichtbar sind Eluieren
      HINWEIS: In der Regel wird das Protein in Fraktion 2 eluieren.
    8. Äquilibrieren Sie eine Entsalzungssäule (siehe Materialtabelle ) mit kohlebehandeltem PBS (Schritt 1.1).
    9. Das markierte Protein auf die Entsalzungssäule durch Schwerkraft strömen.
      HINWEIS: Halten Sie die Menge des geladenen Proteins gemäß der ausgewählten Entsalzungssäule Kapazität 55 .
    10. Eluieren unter Verwendung von 3,5 ml kohlebehandeltem PBS durch Schwerkraftfluss und sammeln 0,5 ml Fraktionen des Eluats.
    11. Verwenden Sie ein UV-Vis-Spektrometer, um die Extinktion jedes Eluats von 230-700 nm zu scannen, um zu identifizieren, welche Fraktion markiertes Protein enthält.
      HINWEIS: Die Schritte 3.3.8-3.3.11 dienen grundsätzlich als Pufferaustausch. Andere Protokolle, die diesem Zweck dienen, sind auch möglich ( zB umfangreiche Dialyse). Alternativ könnte man ab Schritt 3.3.2 direkt zu Schritt 3.3.8 gehen.

4. Messungen im Ensemble erforderlich (in Küvette)

  1. Bestimmung der Försterkonstante
    1. Scan f D , die Fluorophor-Fluoreszenzemission (cps), in einem Fluorimeter durch Anregung des Donors bei 15 nm auf seine maximale Extinktionswellenlänge, um die volle Em zu erhaltenIssionsspektrum Überwachen Sie die Emission beginnend 5 nm nach der Anregungswellenlänge und enden 150 nm später. Verwenden Sie magische Winkelbedingungen, indem Sie den Emissionspolarisator auf 54,7 ° einstellen Und die Anregungspolarisatoren auf 0 ° 56 .
      HINWEIS: Für den hier verwendeten Spenderfluorophor liegt das Abs-Maximum bei 490 nm; 475 nm wird als Anregungswellenlänge verwendet und die Emission von 480-650 nm wird überwacht. Für den Akzeptor tritt das Abs-Maximum bei 645 nm auf; 630 nm wird für die Anregungswellenlänge verwendet und die Emission von 635-735 nm wird überwacht.
    2. Verwenden Sie das Fluorimeter, um eine Anregungsabtastung des Akzeptorfluorophors (Abs A ) im Bereich von 400-700 nm durchzuführen und die magischen Winkelbedingungen zu verwenden, indem Sie den Emissionspolarisator auf 54,7 ° einstellen Und die Anregungspolarisatoren auf 0 ° 56 . Setzen Sie den Emissionsmonochromator auf 15 nm nach der maximalen Emissionswellenlänge. Normalisieren bis zum Maximum exciWert.
    3. Auf veröffentlichten Tabellen finden Sie den Extinktionskoeffizienten des Akzeptors, ε A (M -1 cm -1 ) 56 oder verwenden Sie die vom Hersteller bereitgestellten Werte.
      HINWEIS: Der für das in diesem Manuskript verwendete Akzeptorfluorophor veröffentlichte Wert ist ε A647 = 270.000 cm -1 M -1 56 .
    4. Berechnen Sie die spektrale Überlappung mit J = Σf D · (Abs A · ε A ) · λ 4 , wobei f D , Abs A und ε A oben λ definiert sind und die Wellenlänge (nm) ist. Verwenden Sie ein Arbeitsblatt, um in Spalten alle in den Schritten 4.1.1-4.1.3 erhaltenen wellenlängenabhängigen Werte aufzulisten. Richten Sie sie nach Wellenlänge aus. Führen Sie die Summierung von der minimalen Wellenlänge der Donoremission (λ min ) bis zur maximalen Wellenlänge des Akzeptor-Absorptionsmittels durchE (λ max ).
    5. Berechnen Sie die Förster-Konstante (R o ) unter Verwendung der folgenden Formel R o 6 = 8,79 x 10 -5 · J · κ 2 · Φ F, D · n -4 , wobei J die spektrale Überlappung ist, die zuvor in Schritt 4.1.4 berechnet wurde, Κ 2 Ist der Orientierungsfaktor Φ F, D Ist die Fluoreszenzquantenausbeute des Donorfluorophors und n ist der Brechungsindex des Mediums, in dem sich das Fluorophor befindet.
      HINWEIS: Verwenden Sie n = 1,33 (wenn wässriger Puffer verwendet wird) und κ 2 = 2/3.
    6. Lokalisieren Sie den Quantenausbeutewert des Donorfluorophors (Φ F, D , Umweltabhängig) auf veröffentlichten Tabellen (siehe Referenz 57) und verwenden Sie den Wert der in Schritt 4.1.4 erhaltenen spektralen Überlappung, um den Endwert der Förster-Konstante mit dem GlAus Schritt 4.1.5.
      HINWEIS: Wenn die Quantenausbeute nicht verfügbar ist, folgen Sie Schritt 4.2 unten, um sie zu berechnen. In diesem Fall verwenden Sie Φ F, D = 0,8, was einer Spenderlebensdauer τ D entspricht , r = 4,0 ns.
  2. Bestimmung der Fluoreszenzquantenausbeute
    HINWEIS: Das folgende Verfahren setzt nur eine dynamische Abschreckung voraus. Um eine statische Abschreckung zu betrachten, siehe Referenz 56. PIE-MFD-Experimente sind aber auch bei der Bestimmung der Quantenausbeute auch bei statischer Quenchung (siehe Ergebnisse) nützlich.
    1. Wählen Sie einen Referenzfluorophor mit ähnlichen Absorptions- und Emissionsprofilen sowohl für den Akzeptor als auch für die Donorfluorophore, für die die Quantenausbeute (Φ r ) bestimmt wurde.
      HINWEIS: Für den Spender gilt Φ r = 0,8 und τ r = 4 ns, während für den Akzeptor Φ r = 0,32 und τ r = 1,17 ns, WDie dem Φ r und τ r für die Cyan-Green-Fluorophor- und die fernroten Fluorophor-markierten Oligonukleotide entsprechen bzw. 57 .
    2. Messen Sie den zeitaufgelösten Fluoreszenzabfall (f (t)) unter Verwendung des zeitkorrelierten Einzelphotonenzählverfahrens (TCSPC) bei magischen Winkelbedingungen.
    3. Setzen Sie den Fluoreszenzabfall mit einer mono- oder multi-exponentiellen Zerfallsfunktion in Form von f (t) = Σ i x i e -t / τ i , wobei x i ist Ist die Bevölkerungsfraktion und τ i Ist die Fluoreszenz-Lebensdauer der Bevölkerung.
    4. Berechnen Sie die durchschnittliche Lebensdauer der Spezies, <τ> x = Σx i τ i , Wobei x i Ist die Bevölkerungsfraktion und τ i Ist die Fluoreszenzlebensdauer der Bevölkerung.
    5. Benutze thE Formel Φ F, D = <τ D > x * Φ r / τ r Um die Fluoreszenzquantenausbeute des Donorfluorophors zu berechnen, indem die Fluoreszenzlebensdauer und die Quantenausbeute der Referenz sowie die Fluoreszenzlebensdauer des Donorfluorophors eingesteckt werden.
      HINWEIS: Diese Methode setzt eine dynamische Abschreckung voraus. Für andere Φ F, D Bestimmungen, folgen Lakowicz 56 .

5. Experiment Alignment für PIE-MFD Single-Molekül-Detektion (SMD)

HINWEIS: Es ist besser, die Lichter auszuschalten, wenn Messungen vorgenommen werden.

  1. Geräteeinstellung (Abbildung 1)
    HINWEIS: Für dieses Experiment wird ein in Fig. 1 dargestellter hausgemachter MFD-Aufbau mit zwei gepulsten Lasern und 4 Detektionskanälen in einem invertierten Mikroskopkörper verwendet. Es gibt ähnliche kommerzielle Systeme.
    1. Schalten Sie die 485-nm- und 640-nm-Laser und alle Detektoren des MFD-Setups ein. Öffnen Sie die Software, die die TCSPC-Erfassung und Laser steuert. Stellen Sie sicher, dass die Laserwiederholfrequenz 40 MHz beträgt.
    2. Setzen Sie die 485-nm-gepulste Laserleistung auf 60 μW an einer Bildebene des 60X 1.2 NA-Wasser-Immersionsobjektivs und der 640-nm-Pulslaserleistung auf 23 μW im gepulsten Interleaved-Erregungsmodus (PIE-MFD) 42 .
      HINWEIS: Um PIE-MFD einzustellen, verzögern sich die beiden Laserpulse in der Laser-Controller-Software. Für die 485-nm-Laseranregung sind die Detektions-TCSPC-Kanäle (TAC-Kanäle) 1-12.499 ("prompt" -Kanal). Bei 640 nm Laseranregung sind die TCSPC-Kanäle (TAC-Kanäle) 12.499-50.000 ("Delay" -Kanal).
    3. Fügen Sie eine objektive Immersionsflüssigkeit (ein Tropfen doppelt destilliertes Wasser) zwischen die Mikroskopobjektivlinse und eine Deckglasscheibe ein. Um sicherzustellen, dass die Bildebene innerhalb der Lösung und weit von der Glasoberfläche liegtCe, drehen Sie den Einstellknopf eineinhalb Umdrehungen, nachdem Sie den zweiten hellen Brennpunkt durch die Reflexion der Laser an der Glas-Flüssigkeitsschnittstelle gefunden haben.
    4. Füge 1 μl 100 nM Rhodamin 110 zu 50 μl destilliertem Wasser in die Mitte des Deckglases. Stellen Sie sicher, dass sich die Lösung auch im Zentrum des Mikroskopobjektivs befindet.
    5. Stellen Sie die Pinhole (Größe: 70 μm) Positionen (x und y Richtung eins zu einer Zeit) ein, während Sie die Photonenzählrate auf der Erfassungssoftware überwachen, um die Anzahl der erkannten Photonen zu maximieren.
  2. Standardmessung SMD (Arbeit in einem dunklen Raum)
    1. Verwenden Sie das Sample aus Schritt 5.1.4 und notieren Sie 120 s der Zählrate, indem Sie auf die Schaltfläche "Start" auf dem zeitgesteckten zeitaufgelösten (TTTR) -Steuerelement im Format "* .ht3" 58 auf der Erfassungssoftware klicken.
    2. Berechnen Sie die Offline-Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS) 59 , </ Sup> 60 , 61 ( dh FCS-Messung) zur Bestimmung der charakteristischen Zeit der Diffusion, der Anzahl der Moleküle im konfokalen Volumen, der Triplettzustandskinetik und der molekularen Helligkeit 62 .
      1. Öffnen Sie die Software für FCS (Kristine, MFD Suite). Wählen Sie die experimentellen Einstellungen aus, indem Sie auf "Optionen" -> "Wählen Sie Einrichten" klicken. Wählen Sie eine Datei mit ähnlichen experimentellen Einstellungen und klicken Sie auf "Parameter aus Datei abrufen", um die Header-Informationen in der Datei zu lesen.
      2. Wählen Sie "Operate" -> "Correlate", um FCS auszuführen.
        HINWEIS: Vergewissern Sie sich, dass die Kanalnummern ordnungsgemäß angegeben sind und dass die "TAC Gate" (TCSPC Kanäle) so gewählt werden, dass sie die Aufforderung oder die Verzögerungskanäle entsprechend auswählen.
      3. Wählen Sie "Operate" -> "Global Fit of Correlation Curves", um die Passungsroutine zu öffnen. Verwenden Sie "Gleichung # 24" auf dem SoftwarE und klicken Sie auf "Start".
        HINWEIS: Gleichung # 24 auf der Software beschreibt die Autokorrelationsfunktion ( G c ) von frei diffundierenden fluoreszierenden Molekülen über ein dreidimensionales Gauß-Beleuchtungsprofil wie 61 :
        figure-protocol-1
        Wobei N die mittlere Anzahl von Molekülen im Nachweisvolumen ist, x T der Anteil der Moleküle ist, die Triplettzustandskinetiken mit der charakteristischen Zeit t T , t c ausüben, ist die Korrelationszeit t diff die Diffusionszeit, die mit der geometrischen Beziehung zusammenhängt Parameter ω und ω beschreibt das Gaußsche Beleuchtungsprofil. Nach der Passung nehmen Sie die Diffusionszeit und die Anzahl der Moleküle im konfokalen Volumen zur Kenntnis.
    3. 10 μl 100 nM Rhodamin 101 in 50 μl destilliert gebenWasser und gut mischen Legen Sie diese Mischung auf das Deckglas und stellen Sie sicher, dass sich das Tröpfchen in der Mitte des Objektivs befindet. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Start" auf dem TTTR-Bedienfeld, um 120 s Daten im TTTR-Format aufzuzeichnen.
    4. 1 & mgr; l 100 nM weit-rotes Fluorophor in 50 & mgr; l destilliertes Wasser geben und gut vermischen. Legen Sie diese Mischung in die Mitte des Objektivs. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Start" und notieren Sie 120 s Daten im TTTR-Format.
    5. Legen Sie 50 μl destilliertes Wasser in die Mitte der Objektivlinse. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Start" und zeichnen Sie 300 s Daten im TTTR-Format auf.
    6. Platzieren Sie 50 μl PBS-Puffer in der Mitte der Objektivlinse. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Start" und zeichnen Sie 300 s Daten im TTTR-Format auf.
    7. Nehmen Sie 1 μl der Mischung aus Schritt 5.1.4 und mischen mit 50 μl destilliertem Wasser. Legen Sie diese Mischung auf das Deckglas. Zuerst klicken Sie auf die Schaltfläche "Start" und sammeln Sie 10 s Daten im TTTR-Modus. Dann analysiere die TTTR-Modus-Datei mit der Burst Integration Fluorescence Lifetime (BIFL) Analysesoftware (Paris, MFD Suite), wie in Schritt 5.3 beschrieben.
      HINWEIS: Überprüfen Sie die Anzahl der Bursts pro Sekunde aus der Burst-Auswahl- und Analysesoftware 26 , 61 . Wenn der Burst-Level etwa 35 alle 10 s beträgt, ist es für die Einzelmolekülmessung geeignet.
    8. Fortsetzung der Aufzeichnung der Zählrate im TTTR-Format für 1,5 h ( dh TCSPC bei SMD) zur Behandlung als Einzelmolekül-Messstandard.
      HINWEIS: Wegen der großen Dateigröße, geteilte rohe "* .ht3" -Dateien in kleinere Dateien zu laden und zu verarbeiten mit BIFL.
  3. Analyse von Standardproben mit BIFL
    1. Öffnen Sie die BIFL Software (Paris).
    2. Wählen Sie das Setup für PIE im automatischen Popup-Fenster "Bestätigen Setup" und lesen Sie den Header, indem Sie die Datei mit ähnlichen experimentellen Einstellungen auswählen. Klicken Sie auf "Parameter holen"M-Datei "Klicken Sie auf" OK ". Beachten Sie, dass das Pop-up-Fenster schließt und in das Pariser Front-End integriert ist. Klicken Sie auf" OK "unter" Weiter ".
    3. Wählen Sie die zu analysierenden Dateien aus, indem Sie auf "Select" auf "Data Path Array" klicken, um die zu analysierende Messung auszuwählen.
      1. Klicken Sie auf "Green Scatter" (für eine Wassermessung), "Green BG" (für eine Puffermessung), "Green dick" (für eine 2 nM Rhodamin 110 Messung), "Red Scatter" (für eine Wassermessung), " Red BG "(für eine Puffer- oder Wassermessung)," Red dick "(für eine 20-nM Rhodamin 101 Messung)," Yellow Scatter "(für eine Wassermessung)," Yellow BG "(für eine Puffermessung) und "Yellow Thick" (für eine 2 nM Fernrot-Fluorophor-Messung).
      2. Klicken Sie auf "OK" unter "Weiter".
        HINWEIS: Der "grüne" Kanal entspricht dem Signal der grünen Detektoren in den TPSPC-Kanälen. Das4; Red "-Kanal entspricht dem Signal der roten Detektoren in den TCP-Kanälen" prompt ". Der" Yellow "-Kanal entspricht dem Signal der roten Detektoren in den TCSPC-Kanälen.
    4. Klicken Sie auf "Anpassen" neben "Datenschnitt Burstwise", um Einzelmolekül-Auswahlparameter einzustellen. Im neuen Pop-up-Fenster wählen Sie Einzelmolekül-Ereignisse mit zwei Standardabweichungen von der mittleren Interphoton-Ankunftszeit ("dt") durch Ändern der Interphoton-Ankunftszeit unter "Threshold" und der minimalen Anzahl von Photonen pro Einzelmolekül-Ereignis unter "min . #. " Klicken Sie auf "Zurück", um das Popup-Fenster zu schließen. Klicken Sie auf "OK" unter "Weiter".
      HINWEIS: Die Schwelle in ms-Einheiten hängt von der Hintergrundzählrate ab. Die typische Mindestanzahl der verwendeten Photonen beträgt 60.
    5. Passen Sie die anfängliche Fluoreszenzlebensdauer "Farbanpassungsparameter" ( zB von, zu und und Faltung) für die Erzeugung anD Fluoreszenz-Zerfallsparameter auf den Farben "Grün", "Rot" und "Gelb". Im selben Fenster die "von" und "auf" Werte für "Prompt" und "Delay" einstellen. Klicken Sie auf "Zurück", um das Popup-Fenster zu schließen. Klicken Sie auf "OK" unter "Weiter".
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen 2-Farben-Erregung ausgewählt ist. "From" und "to" entsprechen den Anfangs- und Endbehältern des Fluoreszenz-Zerfalls-Histogramms (TAC-Kanalnummer). Wenn die anfänglichen Anpassungsparameter richtig ausgewählt sind, wird den Fluoreszenzabfällen auf jedem Kanal eine Fit-Funktion hinzugefügt.
    6. Wählen Sie den Speicherort auf der Festplatte aus, auf dem alle verarbeiteten ascii-Dateien in einem übergeordneten Ordner gespeichert werden sollen.
      HINWEIS: Paris verarbeitet alle ausgewählten Bursts und erstellt mehrere ascii-Ausgabedateien, die von anderen Programmen zur Visualisierung verwendet werden können ( zB Margarita MFD Suite).

6. dsDNA-Standards und ProbenmehlUrements

  1. Füge 500 μl PBS-Puffer zu einem Kammerdeckelglas hinzu und lege einen Tropfen destilliertes Wasser zwischen die Kammer und die Objektivlinse. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Start" auf dem Steuerpedal und sammeln Sie 5 min Daten im TTTR-Modus, um für die Analyse zu verwenden.
  2. Nehmen Sie eine kleine Menge (üblicherweise etwa 0,1 μl, Konzentration von ca. 1 μM) des dsDNA-Standards, fügen Sie sie dem PBS-Puffer hinzu und mischen Sie gut. Zuerst sammeln Sie 10 s Daten, indem Sie auf "Start" klicken. Dann kontrolliere den Burst, um 35 Bursts pro 10 s zu bekommen (wie in den Schritten 5.2.7 und 5.3). Schließlich sammle ich 2 h Daten im TTTR-Format, wie oben beschrieben.
  3. Analysieren Sie die gesammelten Daten für die dsDNA-Beispiele, wie in Schritt 5.3.3.
  4. Visualisierung der Burst-Histogramme mit der MFD-Suite (Margarita) und Anzeige der FRET-Effizienz gegenüber <τ D (A) > f oder der F D / F A gegenüber <τ D (A) > f .
    1. Öffnen tEr Margarita Software und wählen Sie "Datei" -> "Import alle *. ?? 4 und * .mti Dateien." Wählen Sie den übergeordneten Ordner mit verschiedenen Unterordnern aus.
    2. Wählen Sie die zu visualisierenden Parameter aus, indem Sie neben der "X" (Abszisse) eines der aus Paris abgeleiteten Parameter klicken ( zB tau grün oder <τ D (A) > f ); In ähnlicher Weise wiederholen Sie dies für die Ordinate "Y", um den gewünschten Parameter zu visualisieren ( zB FRET-Effizienz, F D / F A oder S PIE PIE).
      HINWEIS: In diesem Fall korrigieren die FRET-Effizienz, F D / F A oder S PIE die korrekte Hintergrundzählrate in den grünen, roten und gelben Kanälen. Für Quantenausbeuten des Donors und Akzeptors; Für das Erfassungseffizienzverhältnis (g G / g R ); Und für Übersprechen (α). Hier gilt g G / g R = 3,7 und α = 0,017, je nach Instrument. HintergrundzählratenAbhängig von dem verwendeten Puffer, und Quantenausbeutewerte werden vorher bestimmt.
    3. Fügen Sie eine FRET-Zeile hinzu, indem Sie das Fenster "Overlay-Gleichung" öffnen, indem Sie auf "Display" -> "Overlay-Gleichung" klicken. Wählen Sie im Popup-Menü die statische FRET-Zeile aus. Wählen Sie die richtigen Spenderlebensdauer und die Quantenausbeute-Parameter, um die richtige FRET-Linie zu erzeugen.
      HINWEIS: FRET-Linien zur Korrelation verschiedener FRET-Indikatoren können erzeugt werden.
  5. Bestimmen Sie den Korrekturfaktor für die Akzeptoranregung durch die Donoranregungsquelle (β) unter Verwendung des Stöchiometrieparameters durch Anzeige der FRET-Effizienz gegenüber der Stöchiometrie (S PIE ) in Margarita (Gleichung 1 unten).
    HINWEIS: β wird so gewählt, dass die Spenderprobe bei S PIE = 1,0 in der Stöchiometrie-Skala einen Peak aufweist; Die Akzeptor-Probe sollte eine Stöchiometrie von S PIE = 0,0 haben, und die dsDNA mit beiden Markierungen sollte eine Stöchiometrie von S PIE ~ 0,5 habenBr /> HINWEIS: Das Instrument ist nun fertig und es ist möglich, FRET-markierte Proben zu messen.
  6. Messen und Analysieren von in Abschnitt 3 hergestellten FRET-markierten Proben nach den Schritten 6.3-6.4.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In typischen smFRET-Experimenten unter Verwendung eines MFD-Aufbaus (Laserlinien: 485 nm bei 60 μW und 640 nm bei 23 μW, Abschnitt 5.1) wird die Fluoreszenzprobe auf eine niedrigpikomolare Konzentration (10 -12 M = 1 pM) verdünnt und platziert In einem konfokalen Mikroskop, bei dem ein Sub-Nanosekunden-Laserpuls markierte Moleküle erregt, die durch ein Erregungsvolumen frei diffundieren. Ein typisches konfokales Volumen ist <4 femtoliter (fL). Bei derart niedrigen Konzentra...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dieser Arbeit wird das Protokoll zur Ausrichtung, Kalibrierung und Messung von Interdye-Abständen mit hoher Präzision unter Verwendung von PIE-MFD-Einzelmolekül-FRET-Experimenten vorgestellt. Durch sorgfältige Kalibrierung aller Instrumentalparameter kann man die Genauigkeit der gemessenen Distanzen erhöhen und die Angstrom-Genauigkeit erreichen. Dazu werden verschiedene multidimensionale Histogramme verwendet, um Populationen zur weiteren Charakterisierung zu analysieren und zu identifizieren. Unter Verwendung der m...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen mit dem Inhalt dieses Artikels haben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

VJ und HS bestätigen Unterstützung von NIH R01 GM094246 bis VJ. HS erkennt Start-up-Fonds aus dem Clemson University Creative Anfrage-Programm und dem Zentrum für Optische Materialien Wissenschaft und Technik Technologien an der Clemson University. Dieses Projekt wurde auch von einem Ausbildungsstipendium des Keck-Zentrums für interdisziplinäre Bioscience Training der Golfküstenkonsortien (NIGMS Grant Nr. 1 T32GM089657-05) und der Schissler Stiftungsstipendium für Translationsstudien allgemeiner menschlicher Krankheiten an DD unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health dar.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
HolzkohleMerck KGaAK42964486 320
SpritzenvorsatzfilterFisherbrand09-719CGröße: 0.20 µ
m Kammer-DeckglasFisher Scientific1554091,5 Borosilikatglas, 8 Vertiefungen
Mikroskop-DeckglasFisher Scientific063014-9Größe: 24 x 60-1,5
Nukleasefreies WasserFisher Scientific148859nukleasefreies
Tween-20Thermo Scientific2832010%ige Lösung von Polysorbat 20
Akzeptor DNA-Strang ( High FRET)Integrated DNA Technologies1781248955´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
Akzeptor DNA-Strang (Low FRET)Integrated DNA Technologies1779564245´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
Spender-DNA-StrangIntegriert DNA Technologies1779514375´ -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)
DNA STRANG (No FRET)Integrated DNA Technologies5´ -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
ThermocyclerEppendorfE6331000025Nexus Gradient
Alexa Fluor 488 C5  MaleimidThermo ScientificA10254wird im Manuskript als cyangrüner Fluorophor bezeichnet
Alexa Fluor 647 C2  MaleimidThermo ScientificA20347im Manuskript als dunkelrotes Fluorophor bezeichnet
Rhodamin 110Sigma-Aldrich83695-250MG
Rhodamin 101Sigma-Aldrich83694-500MG
LB Brühe, MillerFisher ScientificBP1426Für die Kultur von E. coli
AmpicillinSigma-AldrichA0166Verwendet bei 100 & Mikro; g/mL Endkonzentration in selektivem LB-Medium zur Aufrechterhaltung der Plasmidselektion
Tetracylin Calbiochem58346Verwendet bei 12,5 & Mikro; g/ml Endkonzentration in selektivem LB-Medium zur Aufrechterhaltung der Gor-Mutation (Schwetathion Reduktase) in Origami B(DE3)-Stämmen, um die Oxidation von Disulfidbindungen zu erleichtern
KanamycinFisher ScientificBP906-5Verwendet bei 15 &; Mikro; g/ml Endkonzentration in selektivem LB-Medium zur Aufrechterhaltung der trxB-Mutation (Rhioreduktase) in B(DE3)-Färbemitteln zur Erleichterung der Oxidation von Disulfidbindungen
Origami B(DE3) Kompetente ZellenMillipore70837-3Kompetente E. coli Zellen für die Expression von Protein mit Disulfidbrücken
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)Fisher ScientificBP1755Zur Induktion von E. coli Proteinexpression
HiTrap Chelating HPGE Life Sciences17-0409-01Für die großtechnische FPLC-Aufreinigung von His-markiertem Protein
ImidazolSigma-Aldrich56749
Ni-NTA Agarose &Qiagen30210
PD-10 EntsalzungssäuleGE Life Sciences17-0851-01
AktaPurifierGE Life Sciences28406264FPLC Instrument
DialyseschläucheSpectrum Labs13256215 kD MWCO 24 mm Flache Breite, 10 Meter/Rolle
DichroitischerSemrockFF500/646-Di01-25x36500/646 BrightLight
50/50 Polarisator für StrahlteilerQioptiq Linos G33 5743 00010 x 10 Filmpolarisator
GrünpassfilterChromaET525/50mET525/50m Halterung mit 25 mm Durchmesser
RotpassfilterChromaET720/150mET720/150m Halterung mit 25 mm Durchmesser
LeistungsmesserThorLabdPM200
UV-Vis-SpektralphotometerVarianCary300Bio
Fluorolog 3 FluorometerHoribaFL3-22-R3
Fluorohub TCSPC ControllerHoribaFluorohub-BTCSPC Elektronik für Ensemble-Messungen
NanoLed 485LHoriba485LBlauer Diodenlaser
NanoLed 635LHoriba635LRoter Diodenlaser
Olympus IX73 MikroskopOlympusIX73P2FMikroskoprahmen
PMA 40 Hybrid DetektorPicoQuant GmbH932200, PMA 40Optimiert für Gründetektion
PMA 50 Hybrid DetektorPicoQuant GmbH932201, PMA 50Optimiert für ed shifter sensitivity
485 nm LaserPicoQuant GmbHLDH-D-C-485
640 nm LaserPicoQuant GmbHLDH-D-C-640
Hydraharp 400 und TTTR AkquisitionssoftwarePicoQuant930021Pikosekunden-Ereignis-Timer und zeitkorrelierte Einzelphotonen-Coutning-Einheit, enthält TTTR-Akquisitionssoftware
SEPIA II SLM 828 und SEPIA-SoftwarePicoQuant910028Lasertreiber für Pikosekundenpulse, enthält SEPIA Software-Controller.
ComputerDellOptiplex 7010CPU: i7-3770 RAM:16GB
FRET Positioning and Screening (FPS) SoftwareHeinrich Heine Universitätenthält den Accesibel Volume Clacualtor der in http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html MFD-Suite
verfügbaren Heinrich-Heine-UniversitätEs umfasst das BIFL-Softwarepaket Paris; Margarita zur Visualisierung der Multiparameter-Hisotrams und Software für die Wahrscheinlichkeitsverteilungsanalyse, die auf der http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html verfügbar
: , , , , , , , Es ist

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