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Methodenartikel

In Ovo Electroporation im Hühnchen auditorischen Hirnstamm

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DOI:

10.3791/55628

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9. Juni 2017

 ,  , 
1Roxelyn and Richard Pepper Department of Communication Sciences and Disorders, Northwestern University, 2Knowles Hearing Research Center, Northwestern University, 3Department of Neurobiology, Northwestern University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Auditorische Hirnstamm Neuronen von Vogel und Säugetiere sind spezialisiert auf schnelle neuronale Kodierung, ein grundlegendes Verfahren für normale Hörfunktionen. Diese Neuronen entstehen aus verschiedenen Vorläufern des embryonalen Hinterhirns. Wir präsentieren Techniken, die die Elektroporation verwenden, um Gene im Hirnhirn von Hühnerembryonen zu exprimieren, um die Genfunktion während der auditorischen Entwicklung zu untersuchen.

Zusammenfassung

Elektroporation ist eine Methode, die interessante Gene in biologisch relevante Organismen wie den Hühnerembryo einführt. Es ist lange festzustellen, dass der Hühnerembryo ein wirksames Forschungsmodell für das Studium der grundlegenden biologischen Funktionen der auditorischen Systementwicklung ist. In jüngster Zeit ist der Hühnerembryo besonders wertvoll bei der Untersuchung von Genexpression, Regulation und Funktion, die mit dem Hören verbunden ist. In ovo Elektroporation kann verwendet werden, um auditorische Hirnstammregionen zu bestimmen, die für hochspezialisierte auditive Funktionen verantwortlich sind. Zu diesen Regionen gehören der Hühnerkern Magnozellularis (NM) und der Kernlaminaris (NL). NM- und NL-Neuronen entstehen aus verschiedenen Vorläufern der Rhombomere 5 und 6 (R5 / R6). Hier präsentieren wir in der Ovo- Elektroporation von Plasmid-codierten Genen, um gen-bezogene Eigenschaften in diesen Regionen zu untersuchen. Wir zeigen eine Methode zur räumlichen und zeitlichen Kontrolle der Genexpression, die entweder Gewinn oder Verlust des funktionellen Phänotyps fördernEs Durch die Ausrichtung auf auditorische neuronale Progenitorregionen, die mit R5 / R6 assoziiert sind, zeigen wir die Plasmid-Transfektion in NM und NL. Die zeitliche Regulation der Genexpression kann durch die Annahme eines Tet-on-Vektorsystems erreicht werden. Dies ist ein Arzneimittel-induzierbares Verfahren, das die interessierenden Gene in Gegenwart von Doxycyclin (Dox) exprimiert. Die in ovo- Elektroporationstechnik - zusammen mit biochemischen, pharmakologischen und oder in vivo funktionellen Assays - bietet einen innovativen Ansatz zur Untersuchung der auditorischen Neuronenentwicklung und der damit verbundenen pathophysiologischen Phänomene.

Einleitung

Eine schnelle neuronale Kodierung von Klängen ist für normale Hörfunktionen unerlässlich. Dazu gehören die Klanglokalisierungsfähigkeiten 1 , die Sprache in der Rauschunterscheidung 2 und das Verständnis anderer verhaltensrelevanter Kommunikationssignale 3 . Analoge Neuronen, die sich im auditorischen Hirnstamm von Vogel und Säugetieren befinden, sind hochspezialisiert für eine schnelle neuronale Kodierung 4 . Dazu gehören der Hühnerkern Magnocellularis (NM), der Nucleus laminaris (NL) und deren Säugetieranaloga, der anteroventrale Cochlearkern (AVCN) und der mediale Superior Olive (MSO) bzw. 5 . Allerdings sind Entwicklungsmechanismen, die eine schnelle neuronale Kodierung regulieren, im auditorischen Hirnstamm schlecht verstanden. Daher ist es vorteilhaft, spezifische Gene zu studieren, die für eine schnelle neuronale Kodierung verantwortlich sind, um ihren Ausdruck, ihre Regulierung und ihre Funktion in au zu verstehenDitory Entwicklung.

Der Entwicklung von Hühnerembryo ist ein wirksames und etabliertes Forschungsinstrument, um grundlegende biologische Fragen der auditorischen Systementwicklung zu untersuchen 6 , 7 . Jüngste molekulare Fortschritte haben diese biologischen Fragen in den sich entwickelnden Hühnerembryo durch Ausdrücken oder Klopfen von Genen von Interesse, um in vivo Gen-Funktion 8 , 9 zu analysieren. Die Untersuchung der regulatorischen Rolle von spezifischen Genen ist ein wichtiger Fortschritt beim Verständnis von Pathologien im Zusammenhang mit akustischen Defiziten. Hier präsentieren wir in der Ovo- Elektroporation von Plasmid-codierten Genen in den Hühner-Hirnstamm, wo eine schnelle neuronale Kodierung des Klangs auftritt 10 . Durch die Ausrichtung auf auditorische neuronale Vorläuferregionen, die mit den Rhombomeren 5 und 6, 11 , 12 (R5 /R6) zeigen wir die räumliche Kontrolle der Plasmid-Transfektion in NM und NL. Darüber hinaus zeigen wir eine zeitliche Regulierung des Ausdrucks durch die Annahme eines Tet-on-Vektorsystems. Dies ist ein Arzneimittel-induzierbares Verfahren, das die interessierenden Gene in Gegenwart von Doxycyclin (Dox) 8 exprimiert.

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Protokoll

Alle Verfahren wurden von Northwestern University Institutional Animal Care und Use Committees genehmigt und durchgeführt in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guidelines für die Pflege und Verwendung von Labortieren.

1. Eierbearbeitung

  1. Kaufen Sie befruchtete Eier von einem örtlichen Verkäufer. Eier bei 13 ° C im Kühlschrank für höchstens 5 Tage vor der Inkubation aufbewahren. Die Embryo-Lebensfähigkeit verringert sich nach 1 Woche deutlich.
  2. Tupfe jedes Ei mit 70% Ethanol vor dem Einstellen in den Inkubator.
  3. Setzen Sie 1-2 Dutzend Eier an ihren Seiten in einem Inkubator mit der Temperatur auf 38 ° C bei ~ 50% Feuchtigkeit eingestellt. Dies gewährleistet eine korrekte Embryo-Positionierung für die Elektroporation und eine optimale Lebensfähigkeit.
    HINWEIS: Nach 48-52 h Inkubation werden die Eier bei Hamburger-Hamilton (HH) Bühne ~ 12-13 und bereit für Elektroporation.

2. Vorbereitung

  1. Plasmid MiXing
    1. Füge 1 μl 0,1% Fast Green (0,1% in 18 MΩ deionisiertem und destilliertem H 2 O [ddH 2 O]) für jede 7 μl DNA Mischung hinzu.
    2. Zur Co-Elektroporation von mehreren Plasmiden, vermischen Sie Plasmide im Verhältnis 1: 1. Die endgültige DNA-Konzentration sollte 5-8 μg / μL betragen.
  2. Einfüllpipette füllen
    1. Pipetten auf einen Mikropipettenabzieher ziehen. Füllen Sie die Pipette mit 1-2 μl Plasmiden mit einer 28G Spritzenadel.
    2. Pipettenspitze mit Pinzette auf 10 - 20 μm pipettieren. Verwenden Sie ein Mikroskop, um bei der Bestimmung der Größe der gebrochenen Pipettenspitze zu helfen. Bringen Sie die Pipette an den Pipettenhalter des Picospritzers an.

3. Fenster

HINWEIS: Das Fensterverfahren wurde vor 13 veröffentlicht. Bitte beachten Sie bitte die Referenz 13 für weitere visuelle Informationen.

  1. Wischen Sie alle Instrumente und den Arbeitsbereich mit 70%Ethanol.
  2. Nehmen Sie die gewünschte Anzahl von Eier aus dem Inkubator (zwischen 6-10), lassen Sie bei Raumtemperatur ab und tauschen Sie Eier mit 70% Ethanol wieder ab. Eier bleiben für mindestens 2 Stunden nach der Inkubatorentfernung lebensfähig.
  3. Legen Sie das Ei auf eine Licht-Illuminator, um die Embryo-Positionierung zu identifizieren. Umkreisen Sie die Mitte des dunklen Bereichs ( dh Embryo) mit einem Bleistift.
  4. Mit einer 19G-Nadel, stoße ein Loch in das stumpfe Ende des Eies.
  5. Stoßen Sie ein anderes Loch in der Nähe des gezogenen Kreises auf die spitze Seite des Eies. Entfernen Sie ein kleines Stück der äußeren Eierschale (ca. 16 mm 2 ) mit der 19G-Nadel und entfernen Sie dann ein kleines Stück der inneren Eierschale (ca. 8 mm 2 ) mit einer Pinzette.
  6. Mit einer 3-ml-Spritze, die mit einer 19G-Nadel ausgestattet ist, entziehen Sie 1,5-2,5 ml Albumin aus dem Ei durch das Stumpfloch. Achten Sie darauf, die Nadel bei 45 ° nach unten zu schlagen.
  7. Decken Sie das stumpfe Ende mit einem kleinen Stück Klebeband (1 cm x 1 cm) ab. Bedecken den gezeichneten Kreis undD das zweite Loch mit Klebeband (2,5 cm x 4 cm).
  8. Mit geschwungener Schere (Schneide = 2,5 cm) schneide ein Fenster im Kreis. Schere sollte parallel zur Eierschale sein und der Durchmesser des Fensters sollte weniger als 2 cm betragen.

4. Plasmid-Injektion

  1. Schalte den Pikospritzer ein. Stellen Sie den Druck auf 18 psi und die Dauer auf 5 μs. Schalten Sie den Luftbehälter und die Lampe für das Sektionsmikroskop ein.
  2. Mischen Sie 30 mL Stammlösung einer 1: 10-Verdünnung der gekauften indischen Tinte, die in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gemischt wurde. Bei 4 ° C aufbewahren. Die Injektion der indischen Tinte ist ein wichtiger Schritt, um eine bessere Visualisierung des Hühnerembryos zu erhalten.
    1. Füllen Sie eine 1-ml-Spritze mit der verdünnten indischen Tintenlösung. Bringen Sie eine 27G-Nadel an und vertreiben Sie alle Blasen, die in der Spritze vorhanden sind.
    2. Setzen Sie die Nadel gerade unter die Eigelb Membran ~ 2 - 3 mm aus dem Embryo und injizieren ~ 0,2 ml indischen Tinte sanft unter dem Embryo. MachenNicht mehr als 0,5 ml der indischen Tinte injizieren, da es das Überleben des Embryos verringern kann.
  3. Legen Sie das Fenster-Ei auf einen Eierhalter unter dem Sektionsmikroskop. Verwenden Sie die höchste Vergrößerung für die beste Visualisierung der Plasmid-Injektionsstelle.
  4. Mit der Pinzette die Membran über den Injektionsbereich entfernen. Von den Rhombomeren 5 und 6 (R5 / R6) entstehen akustische Hirnstammregionen von Interesse ( dh NM und NL). R5 / R6 befinden sich neben den Otozysten (eine embryonale Struktur bei Wirbeltieren, die sich in das Innenohr entwickeln), die als Orientierungspunkte für R5 / R6-Plasmidinjektionen dienen.
  5. Senken Sie die DNA-gefüllte Pipette in das Neuralrohr, das über dem R5 / R6-Bereich liegt, und zwischen den Otocysten unter Verwendung des Mikromanipulators. Ein Schema der idealen Platzierung ist in Fig. 1A gezeigt .
  6. Tragen Sie Luftdruck (18 psi, 5 μs Dauer) von der Picospritzer, um DNA in der Neuralröhre auszustoßen.

5. Elektroporation

  1. Einschalten tEr Strom / Spannung Stimulator.
  2. Füllen Sie eine 3-ml-Spritze mit PBS und befestigen Sie den Spritzenfilter. Füge 1-2 Tropfen PBS auf den Embryo hinzu.
  3. Senken Sie die bipolare Elektrode zum Embryo unter Verwendung des Mikromanipulators mit der negativen Elektrode oberhalb der Injektionsstelle (medial) und der positiven Elektrode lateral zum R5 / R6 (Abbildung 1A ). Vermeiden Sie direkten Kontakt mit dem Embryo. Verwenden Sie bipolare Elektroden, bei denen das Elektrodenmaterial Platin-Iridium ist. Den Abstand zwischen den Spitzen auf 0,5 mm mit Pinzette einstellen.
  4. Mit einem Strom- / Spannungsstimulator, Puls 20 mal bei 50 V für 1 ms in 1 s Intervallen.
  5. Nach der Elektroporation fügen Sie einen Tropfen PBS über den exponierten Bereich hinzu. Entfernen Sie die Elektrode vorsichtig und reinigen Sie sie mit einem Laborgewebe und 70% Ethanol. Schließen Sie das Fenster, das den Embryo mit Klebeband aussetzt.
  6. Etikett Eierschale mit dem injizierten Plasmid-Typ und die Luke Datum.
  7. Lege die Eier wieder in den Inkubator mit der Fensterseite nach oben. Inkubieren bei 38 ° C mit 50% Luftfeuchtigkeit bis zur gewünschten Entwicklungsstufe erreicht.
  8. Wenn ein Tet-on-Vektor für die zeitliche Kontrolle der Genexpression elektroporiert wird, müssen alle 24 h Doxycyclin (Dox) angewendet werden, um die Genexpression zu induzieren (siehe Abschnitt 6).

6. Tet-on-System zur zeitlichen Kontrolle der Genexpression

  1. Verwenden Sie die folgenden Plasmide:
    PCAGGS-T2TP: eine Transposase, die Plasmid exprimiert.
    PT2K-CAGGS-rtTA-M2: ein Plasmid, das das Dox-bindende Protein stabil exprimiert.
    PT2K-BI-TRE-EGFP: ein Plasmid, das einen bidirektionalen Tet-on-Promotor (TRE) -abhängige Expression des EGFP-Reporters und ein zweites Gen von Interesse enthält.
    HINWEIS: Die obigen drei Plasmide müssen im Verhältnis 1: 1: 1 co-elektroporiert werden.
  2. Lagerlösungsvorbereitung:
    1. Dox in sterilem PBS auflösen, um eine 1 mg / ml Stammlösung zu erzeugen. Bei -20 ° C aufbewahren.
  3. Dox Anwendung:
    1. Um das expressio zu induzierenN des Gens von Interesse während bestimmter Entwicklungsstadien, gelten Dox alle 24 Stunden.
    2. Bei der Anwendung von Dox nehmen Sie das Ei heraus, öffnen Sie das Fenster, pipettieren Sie 50 μL Dox auf die chorioallointoische Membran, schließen Sie das Fenster und legen Sie das Ei wieder in den Inkubator.

7. Vorbereitung der Dissektionsfläche für Hirnstammscheiben

HINWEIS: Die folgenden Abschnitte (7 - 9) und Verfahren wurden vor 14 veröffentlicht. Bitte beachten Sie diese Hinweise für weitere visuelle Informationen.

  1. Eine Agarlösung (40 mg / ml Agarose, dh 4% in ddH 2 O) zubereiten. Agar-Lösung in eine Petrischale geben und bei Raumtemperatur erstarren lassen. Lagern Sie die gedeckte Agarplatte im Kühlschrank für die zukünftige Verwendung während des Hirnstammes, der das Gewebe schneidet.
  2. Kontinuierliche Blase künstliche zerebrale Spinalflüssigkeit (ACSF) mit 95% O 2 und 5% CO 2 (pH 7,2-7,4 und Osmolarität: 295-310 mOsm / L).
  3. Den Arbeitsbereich und Vibratom mit 70% EtOH reinigen und die Klinge mit destilliertem Wasser spülen.
  4. Legen Sie einen sauberen Flüssigkeitsabsorptionskissen auf den Arbeitsbereich mit geeigneten Sektionswerkzeugen.
  5. Nehmen Sie die Agarplatte aus dem Kühlschrank, schneiden Sie einen kleinen Agarwürfel (10 mm x 10 mm x 8 mm). Kleben Sie den Agarblock auf die Stufe einer Vibrationsschneidkammer mit handelsüblichem Sekundenkleber.

8. Isolierung des Hühnchen-akustischen Hirnstamms

  1. Öffnen Sie das Ei an der Taped-Fenster-Seite. Punktion der Membran Sac mit einem Skalpell und entfernen Sie den Kopf des Hühnerembryos.
  2. Enthaupte das Huhn mit scharfer Schere.
  3. Legen Sie die Rasierklingenspitze etwas nach hinten in die Augen. Schneide durch den Schädel an der rostral-to-caudalen Mittellinie. Tragen Sie leichten Druck je nach Alter des Embryos. Ältere Embryonen erfordern mehr Druck.
  4. Schieben Sie die Haut und die Federn vorsichtig ab, um Schädel auszusetzen und den Mittellinienschnitt zu überprüfen.
  5. Anwenden sDrehen Sie den rostralen Teil des Schädels mit einer Rasierklinge. Setzen Sie die Klinge sofort nach hinten und schneiden Sie durch den ganzen Schädel und das Gehirngewebe.
  6. Machen Sie Mittellinie-zu-laterale Schnitte mit einer Schere im Schädel "sududalen Bereich, etwas anterior bis Nackenmuskeln auf beiden Seiten des Kopfes. Expose Gehirn und Kleinhirn durch Ziehen weg Schädel und überschüssiges Gewebe.
  7. Schneide Gewebe an den Hirnstamm mit Schere befestigt und entfernen Sie die Hirnstamm, die frei löst sich vom Schädel.

9. Vorbereitung von Hirnstammscheiben für In-vivo- Elektrophysiologie oder Imaging

  1. Pin Hirnstamm durch die Optik tecta.
  2. Entfernen Sie das Kleinhirn, indem Sie Stöcke mit einer Schere schneiden und den Boden des vierten Ventrikels aussetzen.
  3. Mit Pinzetten, entfernen Sie alle membranösen Gewebe und Blutgefäße aus der Hirnstamm Oberfläche.
  4. Um den Hirnstamm zu blockieren, machen Sie einen horizontalen Schnitt am östlichsten Ende des Bodens der vierTh ventrikel, nur kaudal der kortex Setzen Sie seitliche Schnitte senkrecht durch die Optik tecta, um den Hirnstamm zu isolieren.
  5. Legen Sie eine kleine Menge von Leim auf die Vibrationsstufe direkt vor dem Agarblock.
  6. Heben Sie den Hirnstamm am Rückenmark mit Pinzette an und legen Sie ihn auf den Superleim mit rostraler Seite nach unten und dorsaler Seite zur Vibrationsklinge. Entfernen Sie überschüssigen Kleber mit einem Laborgewebe oder Filterpapier.
  7. Gießen Sie sauerstoffhaltiges ACSF in die Vibrationsstufe. Setzen Sie die Vibrationsklinge auf einen Winkel von 20-22 °. Start Vibratom bei maximaler Amplitude Oszillation. Bewege die Bühne in Richtung der Klinge, so dass die Oberseite des Gewebes parallel zur Klinge ist.
  8. Die Klinge schnell in Richtung Hirnstammgewebe bewegen. Verlangsamen Sie die Klinge erheblich vor dem Kontakt der Klinge mit dem Gewebe.
  9. Scheibengewebe mit der langsamsten Vorwärtsgeschwindigkeit. Sobald die Klinge durch den gesamten koronalen Gewebeabschnitt ist, entfernen Sie die Scheibe vorsichtig mit einer Transferpipette/ Li>
  10. Die Stufe 200-300 μm absenken und wieder schneiden. Wiederholen, bis anatomische Landmarken von Hörkernen sichtbar werden, zB die deutliche dorsale / ventrale Neuropilregion NL und die mediale Lage von NM im Vergleich zu NL.
  11. Sorgfältige Aufbewahrung von Scheiben in ACFS. Dies kann bei Raumtemperatur (22 ° C) oder in der Nähe von physiologischen Bedingungen (~ 41 ° C) mit einem warmen Wasserbad erfolgen. Beachten Sie die Reihenfolge des Schneidens. Die erste Scheibe entspricht der kaudalsten Gewebsfläche und die letzte Scheibe entspricht der rostralen Region. Dies stellt grob die tonotopische Organisation des auditorischen Hirnstamms dar, von Nieder- bis Hochfrequenz-Kodierungsregionen.

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Ergebnisse

Wir zeigen hier, dass in ovo Elektroporation die Genexpression in einem normal sich entwickelnden biologischen System erlaubt. Plasmid-codierte Gene werden fokal in das Neuralrohr injiziert, das über R5 / R6 liegt. Ein schematisches Beispiel für die Elektroden- und Pipettenplatzierungen relativ zu wichtigen anatomischen Markern ist in Fig. 1A gezeigt . Die korrekte Position der Plasmidinjektion wird 24 h nach der Elektroporation bestätigt und in 1B gezei...

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Diskussion

In ovo Elektroporation ist eine Methode zur Expression oder Klopfen von Genen von Interesse, um in vivo Gen-Funktion 8 , 9 zu analysieren. Im Hühnerembryo ist es eine innovative Methode zur Expression von Plasmid-codierten Genen in verschiedene akustische Hirnstammregionen 8 . Um einen optimalen Ausdruck zu gewährleisten, sind mehrere kritische Schritte erforderlich. Zuerst nur Embryonen injizieren, deren Otozysten deutl...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Wir danken Drs. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria und Frau Ximena Optiz-Araya für die erste Unterstützung bei der Protokollierung und zur Bereitstellung von Plasmiden. Diese Arbeit wurde von NIH / NIDCD Grant DC013841 (JTS) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Befruchtete weiße Leghorn-HühnereierSunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)
PicospritzerParker Hannifin052-0500-900Picospritzer III, ein- oder zweikanalig
Strom-/SpannungsstimulatorGrass TechnologiesSD9SD9
Microfil SpritzennadelnWorld Precision InstrumentsMF28G67-528 Gauge, 67 mm lang, (5er Pack)
ElektrodenhalterWarner Instruments64-1280MP Serie: Nicht-elektrische Druckanwendungen
Stimulierende MikroelektrodeFHCPBSA1075PBSA1075
Lufttank/ReglerNU Laboratory ServicesLufttrocknen 300 CF
Fast grünSigma AldrichF7258-25GF7258-25G
Durchsichtiges KunststoffbandScotch191
Doxycyclin-HyclatSigma AldrichD9891-1G
Kühlschrank für EierVissani Weinkühlschrank13.3 - 16.1 ° C (56-61°; f)
BrutkastenHova-Bator38 ° C (100 &Grad; F), ~50% Luftfeuchtigkeit
DissektionsbereichZeiss4.35E+15SteREO Discovery, V8 Mikroskop, 50.4X
KaltlichtquelleZeiss4.36E+15CL6000 LED
MikromanipulatorenNarishige JapanModell: MM-32 Mikromanipulatoren
KapillarrohreSutter InstrumentBF150-86-10Dickwandiges Borosilikatglas (Abmessungen)
Spritzen1 mL, 3 mL
NadelnBD Precision Glide 27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2
PinzetteStoeltingNo. 5 Super Fine Dumont
EierhalterCustomMade Clay Base funktioniert auch
MikropipettenabzieherSutter InstrumentModell P-97
SpritzenfilterUltra Cruzsc-358811PVDF 0,22 μ m

Referenzen

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