Methodenartikel

Lichtblatt-basierte Fluoreszenzmikroskopie lebender oder fixiert und gefärbt Tribolium castaneum Embry

DOI:

10.3791/55629

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28. April 2017

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1Physical Biology, Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), 2Cluster of Excellence Frankfurt, Macromolecular Complexes, 3Goethe-Universität Frankfurt am Main – Campus Riedberg

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Abbilden der Morphogenese von Insekten Embryonen mit Lichtbogen basierende Fluoreszenzmikroskopie wurde Stand der Technik geworden. Dieses Protokoll beschreibt und vergleicht drei Befestigungstechniken geeignet für Tribolium castaneum Embryonen führt zwei neue maßgeschneiderte transgenen Linien gut geeignet für die Echtzeit- Bildgebung, diskutiert wesentliche Qualitätskontrollen und zeigt den aktuellen experimentellen Beschränkungen.

Zusammenfassung

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Der rote Mehlkäfer Tribolium castaneum ist zu einem wichtigen Insektenmodellorganismus in der Entwicklungsgenetik und Evolutionsentwicklungsbiologie worden. Die Beobachtung von Tribolium Embryonen mit Lichtbogen basierende Fluoreszenzmikroskopie hat mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Weitfeld- und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie. Aufgrund der einzigartigen Eigenschaften eines Lichtbogenbasierten Mikroskop dreidimensionale Bilder lebender Proben mit hohem Signal-Rausch-Verhältnisse und eine deutlich reduzierte Photobleich sowie Phototoxizität entlang mehrerer Richtungen über Perioden aufgezeichnet werden, die mehrere dauern Tage. Mit mehr als vier Jahren der methodischen Entwicklung und eine kontinuierlichen Steigerung von Daten, scheint die Zeit entsprechende Standardarbeitsanweisungen für die Verwendung von Lichtblatt - Technologie in der Tribolium Gemeinschaft zu etablieren sowie in den Insekt Gemeinschaft. Dieses Protokoll beschreibt drei Montagetechniken geeignet foder verschiedene Zwecke, stellt zwei neue maßgeschneiderte transgenen Linien Tribolium geeignet für Langzeit - Echtzeit- Bildgebung, schlägt fünf Fluoreszenzfarbstoffe intrazelluläre Strukturen von festen Embryonen etikettieren und liefert Informationen über die Daten Nachverarbeitung für die rechtzeitige Auswertung der aufgezeichneten Daten. Repräsentative Ergebnisse konzentrieren sich auf die langfristige Echtzeit-Bildgebung, optischen Schneidens und der Beobachtung des gleichen Embryos entlang mehrerer Richtungen. Die entsprechenden Datensätze werden als herunterladbare Ressource bereitgestellt. Schließlich beschreibt das Protokoll Qualitätskontrollen für Echtzeit-Bildgebung Assays aktuellen Einschränkungen und die Anwendbarkeit der beschriebenen Verfahren auf andere Insektenarten.

Dieses Protokoll wird für Entwicklungsbiologen in erster Linie gedacht, die Imaging-Lösungen suchen, die Standard-Laborgeräte entwickeln. Es fördert den kontinuierlichen Versuch, die Lücke zwischen den technisch orientierten Laboratorien / Gemeinden zu schließen, die sich entwickeln und Mikros verfeinernKopieren methodologisch und das Life-Science-Labor / Gemeinden, die technischen Herausforderungen 'Plug-and-Play' Lösungen erfordern. Darüber hinaus unterstützt es einen axiomatischen Ansatz, der die biologischen Fragen in den Mittelpunkt der Aufmerksamkeit bewegt.

Einleitung

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Die rote Mehlkäfer Tribolium castaneum, die von Schwarzkäfer (Tenebrionidae) zur großen Familie gehört, hat eine lange Geschichte in der Landwirtschaft und Lebenswissenschaften und ist die zweite am besten untersuchte Modell Insektenmodellorganismus nach der Fruchtfliege Drosophila melanogaster. In den letzten vier Jahrzehnten wurde es ein starker und beliebtes Insekt Modellorganismus in der Entwicklungsgenetik, in der evolutionären Entwicklungsbiologie und in den letzten zwanzig Jahren in der embryonalen Morphogenese für eine Vielzahl von Gründen:

Drosophila und Tribolium gehören beide zur Holometabola, aber etwa 300.000.000 Jahre wichen vor 1, 2, 3, 4. Während die embryonale Entwicklung von Drosophila allgemein als hoch abgeleitet betrachtet wird, zeigt einen Tribolium Vorfahren Modus Entwicklung , die in einem deutlich größeren Anteil an Insektenart 5, 6, 7, 8, 9 zu finden ist. Erstens weist Tribolium nicht-involuted Kopfentwicklung, dh seine Mundwerkzeuge und Antennen entstehen bereits während der Embryonalentwicklung 10, 11, 12, 13, 14, 15. Zweitens folgt Tribolium die Prinzipien der Kurzkeimentwicklung, dh Abdominalsegmente 16 sind der Reihe nach von einer posterioren Wachstumszone während germband Dehnung hinzugefügt, 17, 18, 19. Drittens entwickelt Tribolium und später degradiertzwei extraembryonalen Membranen dh das Amnion, das nur den Embryo ventral abdeckt und der Serosa, die den Embryo vollständig einhüllt 20, 21, 22. Beide Membranen spielen eine entscheidende morphogenetischen 23 sowie Schutzfunktion gegen Mikroorganismen 24, 25 und Austrocknungs 26. Viertens sind die embryonal Entwicklungs Beine während des Larvenentwicklungsstadium voll funktionsfähig und dienen als Primor für den erwachsenen Beine während pupal Metamorphose 27, 28, 29, 30, 31.

Aufgrund ihrer geringen Größe und bescheidenen Forderungen, Anbau von Tribolium im Labor ist recht unkompliziert. Kulturen von Wildtyp (WT) Stämme oder transgenen Linien besteht typischerweise von etwa 100-300 Erwachsenen und kann innerhalb von Ein-Liter - Glasflaschen (footprint 80 cm 2) gefüllt drei vor vier Zentimetern hoch (etwa 50 g) mit Wachstumsmedium gehalten werden , das aus Vollkornweizen besteht Mehl mit inaktiver Trockenhefe ergänzt. Eine Wasserversorgung ist nicht erforderlich. Auf diese Weise kann auch kleine Laboratorien Dutzende von Käfern Kulturen innerhalb kleinen oder mittelgroßen Handel erhältlich Insekten Inkubatoren zu halten. Späteren Entwicklungsstadien von Tribolium (Larven nach etwa der vierten Larvenstadium, Puppen und Adulte) leicht aus dem Wachstumsmedium durch Sieben getrennt. Synchronisierte Embryonen erhalten von Erwachsenen für eine kurze Zeit auf Eiablage Medium inkubiert. Für die schnelle Entwicklung, Käfer Kulturen werden bei 32 ° C (etwa vier Wochen pro Generation) gehalten, während der Lagerhaltung typischerweise bei 22 bis 25 ° C (etwa 10 Wochen pro Generation) durchgeführt wird.

Innerhalb der letzten zehn Jahre, viele Standard-techniques wurden für Tribolium allmählich angepasst und optimiert, wie 32 in den Schwellenmodellorganismen Bücher zusammengefasst. Von großer Bedeutung sind genetische Methoden vorgeschoben , wie beispielsweise embryonale 33, Larven 34, 35 oder Eltern 36, 37 RNA - Interferenz-basierte Knock-Down, mit Keimbahn - Transformation entweder das 38 piggyBac, 39 oder dem Minos 40 Transposase - System und CRISPR / Cas9 basierter Genom Technik 41. Darüber hinaus hat der Tribolium Genom etwa ein Jahrzehnt 42 her sequenziert worden und ist nun in der dritten Runde der Genomanordnung 43 freizugeben, die 44 effizient und genomweite Identifikation und systematische Analyse von Genen ermöglicht , oder andere Elemente genetische 45, 46. Darüber hinaus sind die Genome von vier anderen Coleoptera - Spezies für vergleichende genetische Ansätze 47, 48, 49, 50. In Verbindung mit dem sequenzierten Genom, zwei großen genetischen Analysen dh einen Insertionsmutagenese Bildschirm 51 und ein systematischen RNA - Interferenz basierenden Knock-Down - Bildschirm 52 durchgeführt wurden, 53.

Fluoreszenz Echtzeit- Bildgebung mit Weitfeld-, konfokaler oder Lichtbogen-Basis - Mikroskopie (LSFM) ermöglicht die embryonale Morphologie von Tribolium als Funktion der Zeit (dh die Morphogenese) in einem mehrdimensionalen Kontext (Tabelle 1) zu beobachten. In Weitfeld- und konfokale Fluoreszenzmikroskopie, die excitation und Emissionslicht wird durch die gleiche Objektivlinse geführt wird. Bei beiden Ansätzen wird die gesamte Probe für jede aufgenommene zweidimensionale Ebene beleuchtet. Somit werden die Proben auf eine sehr hohe Energieniveaus ausgesetzt. In LSFM nur die Fluorophore in der Fokusebene sind auf eine Entkoppelung der Beleuchtung und Detektion angeregt durch Verwendung von zwei senkrecht zueinander angeordneten Objektivlinsen (Abbildung 1). LSFM kommt in zwei kanonische Implementierungen - die einzige Ebene Beleuchtungsmikroskop (SPIM) und das digitale abgetastete Laserlichtbogen basierende Fluoreszenzmikroskop (DSLM, Bild 2) - und bietet mehrere entscheidende Vorteile gegenüber traditionellen Herangehensweisen: (i) intrinsische optischen Schneidens fähig, (ii) ein gutes axiale Auflösung, (iii) stark reduzierter Gehalt an Photobleich, (iv) sehr geringe Phototoxizität, (v) hohe Signal-zu-Rausch-Verhältnis, (vi) relativ hohe Erfassungsgeschwindigkeit, (vii) -Bildgebung entlang mehrerer Richtungen und (viii) tiefere Gewebepenetration durch die Verwendung von niedrigeren numerischen Apertur Beleuchtungsobjektivlinsen 54, 55, 56.

LSFM wird bereits in Tribolium zu dokumentieren fast den gesamten embryonalen Morphogenese 57 und zu analysieren , um die Prinzipien der extraembryonalen Membranruptur zu Beginn des Rückenverschlusses 23 erfolgreich eingesetzt. Um die Attraktivität der LSFM in der Tribolium Gemeinschaft und für Insekten Wissenschaft im Allgemeinen zu erhöhen, ist es von großer Bedeutung zu etablieren Standard - Betriebsverfahren und die Methoden, Protokolle und den Pool von Ressourcen auf ein Niveau zu verbessern , wo das Mikroskop ein wird die Einfachheit des -Nutzung Standardwerkzeug in der Entwicklungsbiologie Labors und die biologischen Fragen in den Mittelpunkt der Aufmerksamkeit bleiben.

Dieses Protokoll beginnt mit den Grundlagen von Tribolium </ em> Anbau, dh Wartung, Reproduktion und Embryo - Entnahme. Als nächstes werden zwei Versuchsstrategien dargestellt: (i) Echtzeit- Bildgebung von maßgeschneiderten transgenen Linien und (ii) Darstellung von festen Embryonen , die mit Fluoreszenzfarbstoffen (Tabelle 2) gefärbt wurden. (I) die Agarose - Säule, (ii) die Agarose Hemisphäre und (iii) der neuen Spinnweben Inhaber: Anschließend werden im Detail (Abbildung 3 und Tabelle 3) drei Befestigungstechniken mit leicht unterschiedlichen Zwecken erläutern. Das Protokoll erklärt dann den Einlesevorgang mit LSFM. Bildgebungsverfahren und wichtige Überlegungen skizziert. Schließlich wird Embryo Retrieval erklärt und Vorschläge für grundlegende Datenverarbeitung zur Verfügung gestellt werden. In den repräsentativen Ergebnissen, Livebilddaten von zwei neuartigen maßgefertigte und die Glia-blue 58 transgene Linien gezeigt sind und die jeweiligen Abbildungsdatensätze werden als herunterladbare Ressource bereitgestellt. Zusätzlich BildDaten von Fest Embryonen, die mit einer Vielzahl von Fluoreszenzfarbstoffen gefärbt wurden vorgestellt. Die Diskussion konzentriert sich auf die Qualitätskontrolle, die derzeitigen Beschränkungen des Live-Imaging-Ansatz und die Anpassung des Protokolls zu anderen Arten.

Das Protokoll ist für die Lichtbogen-Basis geschrieben Fluoreszenzmikroskope , die mit einer Probenkammer und einer drehbaren Klemmmechanismus für standardisierte Probenhaltern 54, 59, 60, ausgestattet, die mit einem Durchmesser von Metall, Kunststoff oder Glas bestehen typischerweise zylinderförmige Elemente sind , im Millimeterbereich. Das Protokoll ist auch geeignet für beide kanonische Implementierungen, das heißt SPIM und DSLM sowie für Aufbauten mit zwei oder mehr Beleuchtungs- und Detektionsarme 61, 62, 63. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, Daten, die in zwei spektralen Kanälen, grün (illumination mit einem 488 nm-Laser, Feststellung durch einen 525/50 Bandpaßfilters) und Rot (Beleuchtung mit einem 561-nm-Laser, Feststellung durch einen 607/70 Bandpaßfilters), aber das Protokoll kann auf drei oder vier spektrale Kanäle erweitert werden.

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Protokoll

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1. Haltung von Tribolium Cultures

HINWEIS: Standardbedingungen werden als eine Inkubationstemperatur von 25 ° C und 70% relativer Luftfeuchtigkeit in einem 12 h definiert Hell / 12 h Dunkel-Zyklus. Weitere Informationen über die Tribolium Haltung, sind entsprechende Richtlinien 64 zur Verfügung. Dieses Protokoll erfordert zwei verschiedene Mehlbasis Medien, die in Kilogramm-Mengen und gespeichert für mehrere Monate vorbereitet werden kann.

  1. Vor Beginn der Arbeit mit Mehl und inaktiver Trockenhefe, lagert die ungeöffneten Verpackungen bei -20 ° C für 24 h und dann auf Raumtemperatur erwärmen lassen. Dieses Verfahren eliminiert potenzielle Krankheitserreger.
  2. Passieren Vollkornweizenmehl und inaktive Trockenhefe durch ein Sieb mit 710 um Maschenweite, dann Wachstumsmedium herzustellen, indem man das gesiebte Vollkornmehl mit 5% ergänzen (w / w) gesiebten inaktive Trockenhefe.
  3. Übergeben Sie 405 feinen Weizenmehl und inaktive Trockenhefe durch ein Sieb mit 250 & #181; m Maschenweite, dann Eiablage Medium herzustellen, indem man den gesiebte 405 feinen Weizenmehls mit 5% ergänzen (w / w) inaktiv Trockenhefe gesiebten.
  4. Übergeben Sie die jeweiligen Tribolium Kultur durch ein Sieb mit 800 & mgr; m Maschenweite. Entsorgen Sie das übriggebliebene Wachstumsmedium. Übertragen Sie die Larven, Puppen und Erwachsene zu einem großen Glasschale.
  5. Wenn keine Nachkommen Kultur vorhanden ist, übertragen etwa 80 Larven und / oder Puppen auf eine neue Glasflasche eine neue Nachkommen Kultur zu etablieren. Wenn keine Larven und / oder Puppen vorhanden sind, nehmen rund 40 Erwachsene statt. In 50 g Wachstumsmedium und Inkubation unter Standardbedingungen.
  6. Collect etwa 300 Erwachsene (500-700 mg) in einer anderen neuen Glasflasche die Abbildungskultur zu etablieren. In 50 g Wachstumsmedium und Inkubation unter Standardbedingungen. Lassen Sie die Abbildungskultur für mindestens 24 h in frischem Wachstumsmedium vor dem Besamungs zu regeln.
  7. Ersetzen Sie das Wachstumsmedium der Abbildungs ​​Kultur mindestens alle zwei wirEKS, die in Verbindung mit embryo Sammlung durchgeführt werden können (siehe 3.2). Nach zwei bis drei Monaten, ersetzen Sie die Bildkultur vollständig durch neue Erwachsene aus der Nachkommenschaft Kultur.
  8. Wenn ein Nicht-homozygote transgene Linie verwendet wird, kuratieren die Nachkommen Kulturen häufig durch nicht-transgenen Tieren zu entfernen. Idealerweise homozygote Linien erzeugen, wenn das jeweilige Transgen nicht letal ist oder Sterilität bewirkt, wenn auf beiden Chromosomen. Homozygot Kulturen haben in der Regel ein höheres durchschnittliches Fluoreszenzniveau und die Gesamt experimentellen Bedingungen sind schmaler, da nur ein Genotyp vorhanden ist.

2. Mikroskop Einrichtung und Kalibrierung

HINWEIS: Der Tribolium Embryo weist eine anterior-posteriore Länge von etwa 600-660 & mgr; m und ein Querdurchmesser von etwa 300-330 & mgr; m. Die meisten modernen CCD - Kameras haben eine Sensorchipgröße von etwa 9 mm x 7 mm, dh mit einem Durchmesser von 11,4 um, und ein Pixel-Pixel - Abstand von 6,45 & mgr; m.Wenn sie mit einer 10 - facher Vergrößerung Objektivlinse kombiniert wird , kann der Embryo mit einem Pixelabstand von 0,645 & mgr; m in toto abgebildet werden. Die meisten modernen sCMOS Kameras haben eine größere Sensorchipgröße von etwa 16 mm x 14 mm, also einem Durchmesser von 21,3 um, und ein Pixel-Pixel - Abstand von 6,5 um. Wenn sie mit einer 20 - facher Vergrößerung Objektivlinse kombiniert wird , kann der Embryo mit einem Pixelabstand von 0,325 & mgr; m in toto abgebildet werden.

  1. Bringen Sie die Beleuchtungs- und Detektionsobjektivlinsen zum Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass Laser und Fluoreszenzfilter das Fluorophor Absorptions- und Emissionsspektren entsprechen sehr gut.
  2. Bringen Sie die Probenkammer mit dem Mikroskop. Füllen der Probenkammer, die mit PBS pH 7,4 oder einer anderen geeigneten Abbildungspuffer.
  3. Einschalten und das Mikroskop kalibrieren. Umfassende Kalibrierungsroutinen und Fehlerbehebung Richtlinien für maßgeschneiderte Lichtbogenbasis Mikroskope (genauer gesagt für die DSLM Implementierung) wurden pr veröffentlichteviously 65. Für gewerbliche Geräte, folgen den Anweisungen des Herstellers sehr sorgfältig. Falsche Handhabung könnte die Probenkammer des Mediums und verursachen Chaos in das Instrument als auch die Probe führen.

3. Sammlung von transgenen oder WT Embry

  1. Übergeben der Abbildungs ​​Kolonie durch ein Sieb mit 800 um Maschenweite. Sammeln erwachsene Käfer in einer neuen Glasflasche und mit 10 g Eiablage Medium. Inkubiere die Eiablage Kultur für 1 h bei 25 ° C und 70% relative Luftfeuchtigkeit in Licht.
  2. Übergeben der Eiablage Kultur durch ein Sieb mit 800 & mgr; m Maschenweite Erwachsene aus der Eiablage Medium zu trennen, die um 30-100 Embryonen enthält. Übertragen Erwachsene auf eine neue Glasflasche und fügen Sie entweder die alte oder 50 g frisches Wachstumsmedium.
  3. Wenn Beobachtung an dem einheitlichen Blastodermstadium (Beispiel-Datensatz DS0002) beginnen sollte, inkubiere die Eiablage Medium für 15 h bei 25 ° C und 70% relative Luftfeuchtigkeit. To startet zu Beginn des Zurückziehens germband (Beispiel Datensätze DS0001 und DS0003), inkubieren Embryonen für 23 h bei 32 ° C und 70% relative Luftfeuchtigkeit. Wenn andere Entwicklungsstufen erwünscht sind, beziehen sich auf die jeweilige Literatur 64, 65 und anzupassen Inkubationszeit und / oder Temperatur nach Bedarf.

4. Embryo dechorionation

HINWEIS: Die Chorion die äußere Schicht der Eischale und besteht aus Proteinen und Polysacchariden. Es ist stark lichtabsorbierenden aber nicht wesentlich für die richtige Entwicklung und damit chemisch entfernt werden kann.

  1. Übergeben der Eiablage Medium durch ein Sieb mit 300 um Maschenweite. Sammeln der Embryos in einem Zellfilter mit 100 & mgr; m Maschenweite und verwerfen die übrig gebliebenen Eiablage Medium.
  2. Vorbereiten eine 6-Well-Platte wie folgt: Füllen der A1, A2, A3 und B3 Vertiefungen mit 10 ml PBS pH 7.4 und den B1- und B2-Vertiefungen mit 9 ml PBS. Dann sorgfältig hinzufügen1 mL Natriumhypochlorit B1 und B2. Beachten Sie die Fortschritte der Schritte 4,3 bis 4,8 unter dem Stereomikroskop. VORSICHT Natriumhypochlorit ist ätzend.
  3. Legen Sie die Zelle Sieb in die A1 gut (PBS pH-Wert 7,4) und waschen Sie die Embryonen eine Minute lang unter leichtem Schütteln. Größere Mehlpartikel aus den Embryonen lösen sollte.
  4. Übertragen der Zellsieb zum B1 gut (Natriumhypochlorit in PBS pH 7,4) und schüttelt die Platte kräftig für 30 s. Die restlichen Mehlpartikel sollten vollständig von den Embryonen lösen.
  5. Übertragen der Zellsieb zum A2 gut (PBS pH 7,4) und wäscht die Embryonen für 1 min unter leichtem Schütteln.
  6. Für dechorionation, überträgt die Zellsieb an den B2 gut (Natriumhypochlorit in PBS pH 7,4). Schütteln Sie die Platte kräftig, bis die Chorion Brüche und löst sich von den Embryonen. Das Chorion sieht aus wie ein dünner, halbtransparente Membran mit abgerissenen Kanten, während dechorionated Embryonen eine einfache Silhouette aufweist.
  7. Transfer the Zellsieb gut an der A3 (PBS pH 7,4) und die Embryonen für 1 min unter leichtem Rühren gewaschen werden. Wenn irgendwelche Chorion-Fragmente noch zu den Embryonen nach dem Waschen angebracht sind, wiederholen Sie Schritt 4.6.
  8. Lagern Sie die Embryonen in der B3 gut (PBS pH 7,4). Lagerung für mehrere Stunden nicht schadet die Embryonen, aber bedenken Sie, dass die Entwicklung geht weiter.
  9. Für nicht-homozygoten transgenen Linien, entfernen Sie alle nichtfluoreszierenden Embryonen, wenn möglich. Zur Fixierung und Färbung von WT oder transgenen Embryonen, mit Schritt 5 für Echtzeit-Bildgebung transgener Embryonen weiter, weiter mit Schritt 6.

5. Vitelline Membranpermeabilisierung, Fixierung und Färbung

HINWEIS: Die Vitellinmembran die innere Schicht der Eischale ist. Es ist undurchlässig für fluoreszierende Farbstoffe und somit chemisch vor der Färbung permeabilisiert werden.

  1. Füllen ein Szintillationsfläschchen mit Fixierung / Permeabilisierung Lösung (1,5 ml von 4% (w / v) Paraformaldehyd in PBS pH 6,9 einnd 1.5 ml n-Heptan). Übertragen Embryonen mit einem Pinsel in die Fläschchen. Abdeckung Vials mit Aluminiumfolie vor Licht zu schützen Fluorophore und für 30 Minuten auf einer Schüttelplattform bei 50 Umdrehungen pro Minute inkubiert. VORSICHT Paraformaldehyd ist giftig und korrosiv, n-Heptan ist entzündlich und toxisch.
  2. Entfernen Fixierungslösung und Behandlung von Embryonen dreimal für 15 min in 3 ml 0,1% (v / v) Triton X-100 in PBS pH 7,4 und danach einmal für 15 min in 3 ml 1% (v / v) Triton X-100 in PBS, pH 7,4 auf einer Schüttelplattform bei 50 Umdrehungen pro Minute. VORSICHT Triton X-100 ist ätzend.
  3. Entfernen Permeabilisierung Lösung und 0,5 mL Färbelösung in das Fläschchen. Exemplarische Färbelösungen sind in Tabelle 2 bereitgestellt. Stain Embryos über Nacht bei 4 ° C auf einer Schüttelplattform bei 50 Umdrehungen pro Minute. Für die vorgeschlagenen Farbstoffe in Tabelle 2 ist Waschen nicht erforderlich.

6. Herstellung von Agarose Montage

  1. 1 g niedrigschmelzAgarose zu 100 ml PBS, pH 7,4, und die Mischung für 2-3 min in einem Mikrowellenofen bei 800 W. Wenn kleine Agarose-Teilchen noch vorhanden sind, wiederholen Sie den Heizprozess in 30 sec-Intervallen, bis die Teilchen vollständig auflösen. Die Montage Agarose muss nicht jedes Mal neu vorbereitet werden, kann die erstarrte Agarose durch Erwärmen wieder verflüssigt werden, wie oben beschrieben. Dieser Vorgang kann 5-6 mal vor zu viel Wasser verdunstet wiederholt werden.
  2. Lassen Sie die Agarose auf etwa 40-45 ° C abkühlen, dann füllt zwei 1,5 ml-Reaktionsröhrchen mit dem erwärmten Agarose und so alle Röhrchen bei 35 ° C in einem Thermoblock.

7. Embryo Montage und Insertion in die Probenkammer

  1. Option 1: Agarosesäule (3A -C, erste Spalte, Tabelle 3, zweite Spalte)
    1. Füllen Sie eine 1,0-ml-Spritze mit destilliertem Wasser und befestigen es an einen der Glaskapillare Öffnungen, die durch einen kleinen Gummischlauch.Füllen Sie die Kapillare zur Hälfte mit destilliertem Wasser.
    2. Wähle einen Embryo mit einem Pinsel und sie auf der Innenseite der anderen Glas Kapillaröffnung. Gehen Sie schnell zum nächsten Schritt, bevor der Embryo austrocknet.
    3. Haften die Kapillare in die flüssige Agarose und langsam ein paar & mgr; l Flüssigkeit Agarose neben den Embryo in die Kapillare ziehen. Dann erhöht schnell die Ziehkraft, so dass der Embryo zusammen mit dem Agarose gezogen wird. Am Ende soll ein paar ul Agarose über und unter dem Embryo sein. Stellen Sie die Kapillare beiseite für ein paar Minuten und lassen Sie die Agarose erstarren.
    4. Kürzen die Kapillare mit einem Diamantglasschneider auf eine Länge von etwa 5 mm. Das verbleibende Fragment sollte vollständig mit Agarose gefüllt werden und der Embryo sollte innerhalb des zweiten Quartil sein.
    5. Setzen Sie den Stahlzylinder mit dem Stift in die Probenkammer, und dann bleibt das kapillare Fragment auf der Oberseite des Stiftes. Die Agarose-Säule sollte eine wenige Millimeter f herausragenrom das kapillare Fragment mit dem Teil, das den Embryo enthält.
  2. Option 2: Agarose Halbkugel (3A -C, zweite Spalte, Tabelle 3, die dritte Spalte)
    1. Zeichne 200 ul Flüssigkeit Agarose in eine 1,0-ml-Spritze, dann verwenden, das Stahlrohr von oben mit Agarose, bis eine Halbkugel bildet sich an der unteren Öffnung zu füllen. Die Halbkugel Durchmesser soll das Rohrdurchmesser gleich groß sein. Warten Sie ein paar Minuten, bis die Agarose erstarrt ist.
    2. Wähle einen Embryo mit einem Pinsel und neu ordnen sie auf der Spitze der Bürste, so dass das vordere Ende zugänglich wird. Tauchen Sie die Agarose Hemisphäre in flüssige Agarose zu bedecken es mit einem dünnen Film.
    3. Setzen Sie den Embryo mit seinem vorderen Ende aufrecht auf dem Pol des Agarose-Hemisphäre. Biegen das Stahlrohr herum und Korrektur der Position des Embryos mit dem Pinsel. Falls erforderlich, stabilisiert den Embryo durch Zugabe von 2 & mgr; l Agarose zu dem Embryo / Hemisphäre Grenze. Ideally, weniger als die Hälfte der Embryooberfläche sollte möglichst in Agarose und die Flanken bedeckt sein sollten so steil sein.
    4. Legen Sie das Stahlrohr mit der Halbkugel und Embryo langsam in die Probenkammer.
  3. Option 3: Cobweb Halter (3A -C, dritte Spalte, Tabelle 3, die vierte Spalte)
    1. Wählen Sie einen Embryo mit einem Pinsel und zur Seite legen.
    2. Deckt das Langloch des Spinnweben-Halters mit 5-8 & mgr; l Flüssigkeit Agarose, dann entfernt die meisten der Agarose, bis nur ein dünner Agarose Film bleibt.
    3. Platzieren Sie den Embryo auf die Agarose-Film und stellen Sie ihre Position. Bewegen Sie vorsichtig den Embryo in der x-Achsenmitte des Langlochs, und richtet ihre längliche anterior-posterior-Achse mit der Längsachse des Langlochs.
    4. Setzen Sie den Spinnweben Halter mit montiertem embryo langsam in die Probenkammer. Platzieren Sie den Spinnweben Halter, so dass es nicht mit der Anregung und Emission nicht störtLicht, das heißt 45 ° relativ zu den x- und z-Achse.

8. Lichtblatt-basierte Fluoreszenzmikroskopie

  1. Entscheiden, wie viele Richtungen entlang (und entlang der Orientierungen) sollte der Embryo abgebildet werden. Vier Richtungen (entlang der Ausrichtung 0 °, 90 °, 180 ° und 270 °) in der Regel bieten einen guten Kompromiss zwischen Reichweite und Energiebelastung.
  2. Stellen Sie die Anzahl der Fluoreszenzkanäle. Die Hauptparameter für jeden Kanal sind die Laserlinie, die Fluoreszenz-Filter, die Laserleistung und die Belichtungszeit. Für langfristige Live-Bildgebung ist es wichtig, dass die integrierte Energiebelastung nicht die Toleranz des Embryos nicht übersteigt. Eine Belichtungszeit von 25-50 ms sorgt für eine schnelle Bildgebung, während eine Laserleistung zwischen 100 und 300 & mgr; W nicht der Lebensfähigkeit des Embryos beeinflussen sollte. Für feste Proben, Belichtungszeit und Laserleistung kann mindestens verdoppelt werden.
  3. Für Live-Imaging-Assays, konfigurieren Sie den Zeitablauf. die complete Embryonalentwicklung von Tribolium dauert etwa sieben Tage bei Raumtemperatur (23 ± 1 ° C) und etwas weniger als drei Tage bei 32-35 ° C 64. Definiert den zeitlichen Abstand nach den morphogenetischen Ereignissen, die eingehalten werden sollten. Für kurze zeitliche Intervalle, erwägen Senkung Belichtungszeit und Laserleistung (siehe 8.2).
  4. Positionieren des Embryos im Transmissionsmodus Licht entlang der x- und y-Achse in der Mitte des Sichtfeldes, ohne es zu dem Laser ausgesetzt wird. Drehen, um den Embryo um 360 ° in 90 ° -Schritten um den Embryo für Schäden zu untersuchen, die während des Montageprozesses aufgetreten sein könnten.
  5. Drehen , um den Embryo in geeigneter Weise um die y-Achse die embryonischen Achsen auszurichten mit dem Mikroskopachse, beispielsweise die Querachse mit der x-Achse, dh die dorsoventralen Achse mit der z-Achse. Wenn die Spinnweben Haltertechnik, Ausrichtung möglicherweise nicht möglich sein.
  6. Im Fluoreszenzmodus definiert den z-Stapel for jede Richtung. Hinzufügen von 25-50 & mgr; m als räumlicher Puffer vor und hinter dem Embryo. Einschließlich den Puffern deckt der typische z-Stapel rund 350-400 & mgr; m für einen Tribolium embryo. Definieren auch den z-Abstand, die das Vierfache der seitliche Abstand sein sollte, dh der Abstand entlang der x- und y-Achse 66.
  7. Wenn zwei oder mehr Embryos parallel abgebildet werden, startet bei 8.4 mit dem nächsten Embryo.
  8. Für die Langzeitbildgebung, sicherzustellen, dass die Probenkammer mit ausreichend PBS pH 7,4 oder anderen Bildgebungspuffern gefüllt ist. Außerdem deckt die Probenkammeröffnung.
  9. Starten Sie das Imaging-Verfahren. Für langfristige Live-Bildgebung, überwachen die korrekte Erfassung entlang aller Richtungen in allen Kanälen für alle Embryonen. überprüft gelegentlich in den nächsten Tagen, dass die Embryonen am Leben und in der richtigen Position sind.

9. Embryo Retrieval und Qualitätskontrolle

  1. Sobald Bildgebung abgeschlossen ist, entfernen Sie den Probenhalter mitdie Embryonen aus der Probenkammer. Nur Embryonen aus Live-Imaging-Assays haben abgerufen werden. Fixiert und gefärbt Embryonen verworfen werden.
  2. Wenn eine Echtzeit-Bildgebung Assay durchgeführt wurde, übertragen, um den Embryo zu einem Objektträger. Für die Agarose-Säule Technik, extrahieren die Embryonen aus der umgebenden Agarose mit einem Skalpell, Mikro-Messer oder einer Rasierklinge. Für die Agarose-Technik Hemisphäre, überträgt die Halbkugel mit der flachen Seite auf den Objektträger. Embryo Entfernung ist nicht erforderlich. Für die Spinnweben Halter Technik absteigen sanft die Embryos aus dem Agarose-Film mit einem Pinsel. Inkubieren der Objektträger in einem kleinen Glasschale in gesättigte Feuchtigkeitsatmosphäre unter Standardbedingungen, bis die Larven schlüpfen.
  3. Nach dem Schlüpfen der Larven übertragen auf einzelne Vertiefungen einer 24-Well-Platte und füge 500 mg Wachstumsmediums in jeder Vertiefung. Inkubiere unter Standardbedingungen. Vergleichen Sie die Gesamtentwicklungszeit und die Morphologie der abgebildeten Larven nicht bebilderte WT und transgenen larvae (siehe Diskussion). In Assays, die WT-Entwicklung, keine offensichtlichen morphologischen Abweichungen charakterisieren sollte idealerweise bemerkbar.
  4. Sobald die Larven zu gesunden Erwachsenen entwickeln, ihnen mit entsprechenden WT Partnern gleichen Hintergrundstamm. Nach zwei Wochen prüfen Nachkommen Produktion. Sehen Sie sich auch die Fruchtbarkeit der Nachkommen zu prüfen , durch Paarung sie inter pares. Erst wenn die abgebildeten Embryonen in fruchtbaren Erwachsenen entwickeln, die fruchtbare Nachkommen erzeugen, kann das Bildgebungsverfahren nicht-invasive betrachtet werden.

10. Bilddatenverarbeitung

HINWEIS: Für die Bilddatenverarbeitung, die Open-Source - Bildverarbeitungssoftware ImageJ 67 oder dessen Derivates FIJI 68 empfohlen. Beide Versionen sowie eine umfassende Dokumentation an www.imagej.net gefunden. Das Standard-Dateiformat für LSFM Daten ist das Tagged Image File Format (TIFF). Die innere Behälter Option erlaubt es den storagt von Bildstapeln, wie beispielsweise z-Stapel oder Zeitreihen von z maximalen Projektionen innerhalb einer einzigen Datei, die in ImageJ oder FIJI per Drag-and-Drop geöffnet werden kann.

  1. Falls erforderlich, dreht, um die z-stapelt die anterior-posteriore Achse des Embryos mit der y-Achse (Bild → Transformation → Rotate) auszurichten. Bitte beachten Sie, dass die Rotationsparameter individuell für jede Richtung eingestellt werden müssen, aber nicht für den Zeitablauf und die Fluoreszenzkanäle.
  2. Zuschneiden den z-Stapels entlang der x-, y- und z-Achsen, so dass nur ein minimaler Hintergrund (20 bis 40 Pixel entlang der x- und y-Achsen, von 5 bis 10 Ebene entlang der Z-Achse) bleibt (für die x - und y-Achse und den rechteckigen Auswahlwerkzeug verwenden, dann Bild → Pflanzenbau, für die z-Achse, die Verwendung Bild → Stapel → Werkzeuge → Scheibe Keeper). Bitte beachten Sie, dass die Anbau Parameter individuell für jede Richtung eingestellt werden müssen, aber nicht für die Zeitpunkte und die Fluoreszenzkanäle.
  3. Berechnen Sie die z maximale Projektion für jeden z-Stack(Bild → Stapel → Z-Projekt, wählen Max Intensity). Intensity Projection Berechnungen sind Daten Vereinfachungsverfahren, die eine räumliche Dimension zu entfernen.
  4. Für Live - Bilddaten langfristig betrachtet einen ImageJ oder FIJI Skript , das die Verarbeitung 10.1 bis 10.3 für alle Richtungen, alle Zeitpunkt und alle Fluoreszenzkanäle 65 Stufen durchführt. Idealerweise verketten alle z maximalen Projektionen pro Kanal und die Richtung und als eine Zeitreihe in einem TIFF Container abzuspeichern. Alternativ kann die BigDataViewer 69 Plug-in für FIJI verwendet werden , um durch Terabyte-große Datenmengen zu navigieren.
  5. In Abhängigkeit von den transgenen Linie und bildgebenden Verfahren, dynamische Intensitätsanpassung der Zeitstapel könnten wünschenswert sein, aufgrund von Photobleichung und / oder Fluorophor-Expression Schwankungen. Entweder die ImageJ- oder FIJI-intrinsische Bleach Korrekturfunktion (Bild → Anpassen → Bleach Korrektur, wählt Histogramm Matching) oder dedicated Software 65 vorgeschlagen.
  6. Wenn der Embryo wurde aufgezeichnet und / oder entlang mehrerer Richtungen und in mehreren Fluoreszenzkanälen, horizontale Kombination der Richtungen (Bild → Stapel → Werkzeuge → Kombination) und Kanal merge (Bild → Farbmischen → Kanäle) empfohlen.
  7. Registrierung und Fusion von Z-Stapeln entlang mehrere Richtungen 70, eventuell in Kombination mit erworbenem Dekonvolution 71, erlauben die Berechnung von überlegenen dreidimensionalen Bildern mit gleichmßiger Qualität und isotroper Auflösung. Beide Plug-Ins sind Open Source und in FIJI vorinstalliert, aber sie erfordern das Vorhandensein von Kennungsmarken (fluoreszierende Mikrokügelchen, wie zB Kügelchen) um die Probe.
  8. Open-Source - Software - Frameworks für großräumige quantitative Datenextraktion und Analyse ist ebenfalls verfügbar, beispielsweise für die Segmentierung und Verfolgung von Zellkernen 72 oder cell Formerkennung 73.

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Ergebnisse

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Dieses Protokoll beschreibt einen experimentellen Rahmen für die Fluoreszenzabbildung von lebenden oder fixierten und gefärbten Tribolium Embryonen mit LSFM. Aufgrund der geringen Mengen an Photobleichung und Phototoxizität, eine direkte Folge seiner optischen Schneidens Fähigkeit ist LSFM besonders gut geeignet für die Langzeitechtzeit-Bildgebung.

Die neuartige Ágóc {ATub'H2B-mEmerald} # 1 transgene Linie drückt ein ...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qualitätskontrolle

In Echtzeit- Bildgebung Assays, muss die Herstellung und Aufzeichnungsverfahren nicht-invasiv sein, dh weder die mechanische und chemische Behandlung (Sammlung, dechorionation, auf die Probenhaltermontage) noch die integrierte Energiebelastung während der Beobachtung sollte die Lebensfähigkeit der Probe beeinflussen. Für Studien, die WT Entwicklung zu charakterisieren, ist es nur die Verwendung von Daten aus Experimenten empfohlen, in denen der Em...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Autor Beiträge

FS und Ehks konzipierte die Forschung. FS erzeugt, um die transgenen Linien Ágóc. Lichtbogen-basierte Fluoreszenz-Bildgebung wurde durch FS und SK durchgeführt. FS und Ehks schrieb das Manuskript mit dem Input von SK.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Sven Plath für den technischen Support. Die Glia-blau transgene Linie war ein freundliches Geschenk von Gregor Bucher (Göttingen, Deutschland). Die Forschung wurde von dem Exzellenzcluster Frankfurt am Main für Makromolekulare Komplexe (CEF-MC, EXC 115, Sprecher Volker Dötsch) teilweise zu Ehks am Buchmann-Institut für Molekulare Biowissenschaften (BMLS, Direktor Enrico Schleiff) an der Goethe gewährt finanziert Universität Frankfurt am Main von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
VollkornweizenmehlDemeter e.V.1.13E+08US: Vollkornmehl, UK: Vollkornmehl
405 FeinweizenmehlDemeter e.V.1.13E+08US: Gebäckmehl, UK: Weichmehl
inaktive TrockenhefeFliegenstaub / Genesee Scientific62-106
Phosphatgepuffertes Sain (PBS), pH 7,4Thermo Fisher Scientific10010-023
Natriumhypochlorit, ~12% aktiv ClSigma Aldrich425044-250MLAchtung: Natriumhypochlorit ist ätzend
niedrigschmelzende AgaroseCarl Roth6351.2
6-Well-PlatteOrange Scientific4430500
24-Well-PlatteOrange Scientific4430300
Glaskapillaren, intern & Oslash; 0,46 mmBrand GmbH + Co KG7087 09
SYTOX GreenThermo Fisher Scientific57020Die Herstellung der Färbelösung ist in Tabelle 2
erläutert YOYO-1 IodidThermo Fisher ScientificY3601Die Vorbereitung der Färbelösung wird in Tabelle 2 erläutert
BOBO-3 IodidThermo Fisher ScientificB3586Die Vorbereitung der Färbelösung wird in Tabelle 2 erläutert
Alexa Fluor 488 PhalloidinThermo Fisher ScientificA12379Vorbereitung der Färbelösung wird in Tabelle 2 erläutert
Alexa Fluor 546 PhalloidinThermo Fisher ScientificA22283Die Vorbereitung der Färbelösung wird in Tabelle 2
Sieb, 800 & micro; m MaschenweiteVWR International200.025.222-051
Sieb, 710 & Mikro; m MaschenweiteVWR International200.025.222-050für die Vorbereitung des Wachstumsmediums (Stufe 1.1)
Sieb, 300 & Mikro; m MaschenweiteVWR International200.025.222-040
Sieb, 250 & Mikro; m MaschenweiteVWR International200.025.222-038für die Vorbereitung des Eiablagemediums (Schritt 1.2)
Glasschale, Ø 100 mm × 20 mmSigma AldrichCLS70165102
Zellensieb, 100 & Mikro; m MaschenweiteBD Biosciences352360
Pinsel, Kopf & Oslash; 2 mmVWR International149-2121
Spritze, 1,0 mLB. Braun Medical AG9166017V
SzintillationsfläschchenSigma AldrichM1152-1000EA
Paraformaldehyd (PFA)Sigma Aldrich158127Achtung: Paraformaldehyd ist giftig und ätzend
n-Heptan &GE; 99%Carl Roth8654.1Achtung: n-Heptan ist brennbar und giftig
Triton X-100Sigma AldrichX100-100MLAchtung: Trition X-100 ist ätzend
Die

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brown, S. J., Denell, R. E., Beeman, R. W. Beetling around the genome. Genet. Res. 82, 155-161 (2003).
  2. Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346, 763-767 (2014).
  3. Tong, K. J., Duchêne, S., Ho, S. Y. W., Lo, N. INSECT PHYLOGENOMICS. Comment on "Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 349, 487(2015).
  4. Kjer, K. M., et al. INSECT PHYLOGENOMICS. Response to Comment on "Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 349, 487(2015).
  5. Klingler, M. Tribolium. Curr Biol. 14, 639-640 (2004).
  6. Savard, J., Marques-Souza, H., Aranda, M., Tautz, D. A segmentation gene in tribolium produces a polycistronic mRNA that codes for multiple conserved peptides. Cell. 126, 559-569 (2006).
  7. Yang, X., Zarinkamar, N., Bao, R., Friedrich, M. Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (I): The early retinal genes dachshund, eyes absent and sine oculis. Dev. Biol. 333, 202-214 (2009).
  8. Peel, A. D. Forward genetics in Tribolium castaneum: opening new avenues of research in arthropod biology. J. Biol. 8, 106(2009).
  9. Lynch, J. A., El-Sherif, E., Brown, S. J. Comparisons of the embryonic development of Drosophila, Nasonia, and Tribolium. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 1, 16-39 (2012).
  10. Schröder, R., Jay, D. G., Tautz, D. Elimination of EVE protein by CALI in the short germ band insect Tribolium suggests a conserved pair-rule function for even skipped. Mech. Dev. 80, 191-195 (1999).
  11. Posnien, N., Schinko, J. B., Kittelmann, S., Bucher, G. Genetics, development and composition of the insect head--a beetle's view. Arthropod Struct. Dev. 39, 399-410 (2010).
  12. Posnien, N., Koniszewski, N. D. B., Hein, H. J., Bucher, G. Candidate gene screen in the red flour beetle Tribolium reveals six3 as ancient regulator of anterior median head and central complex development. PLoS Genet. 7, 1002416(2011).
  13. Angelini, D. R., Smith, F. W., Aspiras, A. C., Kikuchi, M., Jockusch, E. L. Patterning of the adult mandibulate mouthparts in the red flour beetle, Tribolium castaneum. Genetics. 190, 639-654 (2012).
  14. Coulcher, J. F., Telford, M. J. Cap'n'collar differentiates the mandible from the maxilla in the beetle Tribolium castaneum. Evodevo. 3, 25(2012).
  15. Peel, A. D., et al. Tc-knirps plays different roles in the specification of antennal and mandibular parasegment boundaries and is regulated by a pair-rule gene in the beetle Tribolium castaneum. BMC Dev. Biol. 13, 25(2013).
  16. Bucher, G., Klingler, M. Divergent segmentation mechanism in the short germ insect Tribolium revealed by giant expression and function. Development. 131, 1729-1740 (2004).
  17. Handel, K., Basal, A., Fan, X., Roth, S. Tribolium castaneum twist: gastrulation and mesoderm formation in a short-germ beetle. Dev. Genes Evol. 215, 13-31 (2005).
  18. Roth, S., Hartenstein, V. Development of Tribolium castaneum. Development Genes and Evolution. 218, 115-118 (2008).
  19. Schröder, R., Beermann, A., Wittkopp, N., Lutz, R. From development to biodiversity--Tribolium castaneum, an insect model organism for short germband development. Dev. Genes Evol. 218, 119-126 (2008).
  20. Sharma, R., Beermann, A., Schröder, R. The dynamic expression of extraembryonic marker genes in the beetle Tribolium castaneum reveals the complexity of serosa and amnion formation in a short germ insect. Gene Expr. Patterns. 13, 362-371 (2013).
  21. Benton, M. A., Pavlopoulos, A. Tribolium embryo morphogenesis: may the force be with you. Bioarchitecture. 4, 16-21 (2014).
  22. Horn, T., Hilbrant, M., Panfilio, K. A. Evolution of epithelial morphogenesis: phenotypic integration across multiple levels of biological organization. Front. Genet. 6, 303(2015).
  23. Hilbrant, M., Horn, T., Koelzer, S., Panfilio, K. A. The beetle amnion and serosa functionally interact as apposed epithelia. Elife. 5, (2016).
  24. Jacobs, C. G. C. C., vander Zee, M. Immune competence in insect eggs depends on the extraembryonic serosa. Dev. Comp. Immunol. 41, 263-269 (2013).
  25. Jacobs, C. G. C., Spaink, H. P., vander Zee, M. The extraembryonic serosa is a frontier epithelium providing the insect egg with a full-range innate immune response. Elife. 3, (2014).
  26. Jacobs, C. G. C., Rezende, G. L., Lamers, G. E. M., vander Zee, M. The extraembryonic serosa protects the insect egg against desiccation. Proc. Biol. Sci. 280, 20131082(2013).
  27. Lewis, D. L., DeCamillis, M., Bennett, R. L. Distinct roles of the homeotic genes Ubx and abd-A in beetle embryonic abdominal appendage development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4504-4509 (2000).
  28. Beermann, A., et al. The Short antennae gene of Tribolium is required for limb development and encodes the orthologue of the Drosophila Distal-less protein. Development. , 287-297 (2001).
  29. Grossmann, D., Scholten, J., Prpic, N. -M. Separable functions of wingless in distal and ventral patterning of the Tribolium leg. Dev. Genes Evol. 219, 469-479 (2009).
  30. Angelini, D. R., Smith, F. W., Jockusch, E. L. Extent With Modification: Leg Patterning in the Beetle Tribolium castaneum and the Evolution of Serial Homologs. G3. 2, Bethesda. 235-248 (2012).
  31. Grossmann, D., Prpic, N. -M. Egfr signaling regulates distal as well as medial fate in the embryonic leg of Tribolium castaneum. Dev. Biol. 370, 264-272 (2012).
  32. Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 2. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. (2010).
  33. Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects. Evol. Dev. 1, 11-15 (1999).
  34. Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Dev. Genes Evol. 214, 575-578 (2004).
  35. Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borràs-Castells, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA interference in the red flour beetle, Tribolium castaneum. J. Vis. Exp. , e52059(2014).
  36. Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr. Biol. 12, 85-86 (2002).
  37. Posnien, N., et al. RNAi in the red flour beetle (Tribolium). Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  38. Lorenzen, M. D., et al. piggyBac-mediated germline transformation in the beetle Tribolium castaneum. Insect Mol. Biol. 12, 433-440 (2003).
  39. Berghammer, A. J., Weber, M., Trauner, J., Klingler, M. Red flour beetle (Tribolium) germline transformation and insertional mutagenesis. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  40. Pavlopoulos, A., Berghammer, A. J., Averof, M., Klingler, M. Efficient transformation of the beetle Tribolium castaneum using the Minos transposable element: quantitative and qualitative analysis of genomic integration events. Genetics. 167, 737-746 (2004).
  41. Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum. Development. 142, 2832-2839 (2015).
  42. Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
  43. Kim, H. S., et al. BeetleBase in 2010: revisions to provide comprehensive genomic information for Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 38, 437-442 (2010).
  44. Stappert, D., Frey, N., von Levetzow, C., Roth, S. Genome-wide identification of Tribolium dorsoventral patterning genes. Development. 143, 2443-2454 (2016).
  45. Pavlek, M., Gelfand, Y., Plohl, M., Meštrović, N. Genome-wide analysis of tandem repeats in Tribolium castaneum genome reveals abundant and highly dynamic tandem repeat families with satellite DNA features in euchromatic chromosomal arms. DNA Res. 22, 387-401 (2015).
  46. Vlahović, I., Glunčić, M., Rosandić, M., Ugarković, Đ, Paar, V. Regular higher order repeat structures in beetle Tribolium castaneum genome. Genome Biol. Evol. , (2016).
  47. Keeling, C. I., et al. Draft genome of the mountain pine beetle, Dendroctonus ponderosae Hopkins, a major forest pest. Genome Biol. 14, 27(2013).
  48. Vega, F. E., et al. Draft genome of the most devastating insect pest of coffee worldwide: the coffee berry borer, Hypothenemus hampei. Sci. Rep. 5, 12525(2015).
  49. Cunningham, C. B., et al. The Genome and Methylome of a Beetle with Complex Social Behavior, Nicrophorus vespilloides (Coleoptera: Silphidae). Genome Biol. Evol. 7, 3383-3396 (2015).
  50. Meyer, J. M., et al. Draft Genome of the Scarab Beetle Oryctes borbonicus on La Réunion Island. Genome Biol. Evol. 8, 2093-2105 (2016).
  51. Trauner, J., et al. Large-scale insertional mutagenesis of a coleopteran stored grain pest, the red flour beetle Tribolium castaneum, identifies embryonic lethal mutations and enhancer traps. BMC Biol. 7, 73(2009).
  52. Schmitt-Engel, C., et al. The iBeetle large-scale RNAi screen reveals gene functions for insect development and physiology. Nat. Commun. 6, 7822(2015).
  53. Dönitz, J., et al. iBeetle-Base: a database for RNAi phenotypes in the red flour beetle Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 43, 720-725 (2015).
  54. Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).
  55. Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, 566-572 (2011).
  56. Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nat. Methods. 12, 23-26 (2015).
  57. Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. , 1-8 (2014).
  58. Koniszewski, N. D. B., et al. The insect central complex as model for heterochronic brain development-background, concepts, and tools. Dev. Genes Evol. , (2016).
  59. Gualda, E. J., et al. OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform. Nat. Methods. 10, 599-600 (2013).
  60. Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nat. Methods. 10, 598-599 (2013).
  61. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat. Methods. 9, 755-763 (2012).
  62. Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging. Nat. Methods. 9, 730-733 (2012).
  63. Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nat. Methods. 12, 1171-1178 (2015).
  64. Brown, S. J., et al. The red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera): a model for studies of development and pest biology. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  65. Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Live imaging of Tribolium castaneum embryonic development using light-sheet-based fluorescence microscopy. Nat. Protoc. 10, 1486-1507 (2015).
  66. Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Opt. Lett. 31, 1477-1479 (2006).
  67. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  68. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
  69. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nat. Methods. 12, 481-483 (2015).
  70. Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nat. Methods. 7, 418-419 (2010).
  71. Preibisch, S., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat. Methods. 11, 645-648 (2014).
  72. Amat, F., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat. Methods. 11, 951-958 (2014).
  73. Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-Dimensional Cell Segmentation in Large-Scale Microscopy Data of Developing Embryos. Dev. Cell. 36, 225-240 (2016).
  74. Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression. Insect Biochem. Mol. Biol. 38, 749-755 (2008).
  75. Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. K. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78, 23705(2007).
  76. El-Sherif, E., Averof, M., Brown, S. J. A segmentation clock operating in blastoderm and germband stages of Tribolium development. Development. , (2012).
  77. Panfilio, K. a, Oberhofer, G., Roth, S. High plasticity in epithelial morphogenesis during insect dorsal closure. Biol. Open. 2, 1108-1118 (2013).
  78. Koelzer, S., Kölsch, Y., Panfilio, K. A. Visualizing late insect embryogenesis: extraembryonic and mesodermal enhancer trap expression in the beetle Tribolium castaneum. PLoS One. 9, 103967(2014).
  79. Nakamoto, A., et al. Changing cell behaviours during beetle embryogenesis correlates with slowing of segmentation. Nat. Commun. 6, 6635(2015).
  80. Horn, T., Panfilio, K. A. Novel functions for Dorsocross in epithelial morphogenesis in the beetle Tribolium castaneum. Development. 143, 3002-3011 (2016).
  81. Benton, M. A., Akam, M., Pavlopoulos, A. Cell and tissue dynamics during Tribolium embryogenesis revealed by versatile fluorescence labeling approaches. Development. 140, 3210-3220 (2013).
  82. van der Zee, M., et al. Innexin7a forms junctions that stabilize the basal membrane during cellularization of the blastoderm in Tribolium castaneum. Development. 142, 2173-2183 (2015).
  83. Macaya, C. C., Saavedra, P. E., Cepeda, R. E., Nuñez, V. A., Sarrazin, A. F. A Tribolium castaneum whole-embryo culture protocol for studying the molecular mechanisms and morphogenetic movements involved in insect development. Dev. Genes Evol. 226, 53-61 (2016).
  84. Sarrazin, A. F., Peel, A. D., Averof, M. A Segmentation Clock with Two-Segment Periodicity in Insects. Science. 336, 338-341 (2012).
  85. Nollmann, F. I., et al. A photorhabdus natural product inhibits insect juvenile hormone epoxide hydrolase. Chembiochem. 16, 766-771 (2015).
  86. Strobl, F., Stelzer, E. H. Long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos: principles, resources, scientific challenges and the comparative approach. Curr. Opin. Insect Sci. 18, 17-26 (2016).
  87. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light-sheet fluorescence microscopy (DSLM) of zebrafish and Drosophila embryonic development. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, 1235-1243 (2011).
  88. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat. Methods. 12, 30-34 (2015).
  89. Cerny, A. C., Bucher, G., Schröder, R., Klingler, M. Breakdown of abdominal patterning in the Tribolium Krüppel mutant jaws. Development. 132, (2005).
  90. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
  91. Sulston, I. A., Anderson, K. V. Embryonic patterning mutants of Tribolium castaneum. Development. 122, (1996).
  92. Berghammer, A., Bucher, G., Maderspacher, F., Klingler, M. A system to efficiently maintain embryonic lethal mutations in the flour beetle Tribolium castaneum. Dev. Genes Evol. 209, 382-389 (1999).
  93. Brown, S., et al. Implications of the Tribolium Deformed mutant phenotype for the evolution of Hox gene function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4510(2000).
  94. Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. 108, 17708-17713 (2011).
  95. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nat. Protoc. 9, 2555(2014).
  96. McGorty, R., et al. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Opt. Express. 23, 16142-16153 (2015).
  97. Amat, F., et al. Efficient processing and analysis of large-scale light-sheet microscopy data. Nat. Protoc. 10, 1679-1696 (2015).
  98. Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging. Nat. Methods. 10, 751-754 (2013).
  99. Supatto, W., McMahon, A., Fraser, S. E., Stathopoulos, A. Quantitative imaging of collective cell migration during Drosophila gastrulation: multiphoton microscopy and computational analysis. Nat. Protoc. 4, 1397-1412 (2009).
  100. Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nat. Biotechnol. , (2016).
  101. Keller, P. J., et al. Fast, high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nat. Methods. 7, 637-642 (2010).
  102. Caroti, F., Urbansky, S., Wosch, M., Lemke, S. Germ line transformation and in vivo labeling of nuclei in Diptera: report on Megaselia abdita (Phoridae) and Chironomus riparius (Chironomidae). Dev. Genes Evol. 225, 179-186 (2015).
  103. Handler, A. M. Use of the piggyBac transposon for germ-line transformation of insects. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1211-1220 (2002).
  104. Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 9003-9008 (2014).
  105. Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat. Biotechnol. 18, 81-84 (2000).
  106. Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germline transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc. R. Soc. B Biol. Sci. 271, 263-265 (2004).
  107. Catteruccia, F., et al. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature. 405, 959-962 (2000).
  108. Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Mol. Biol. 10, 597-604 (2001).
  109. Labbé, G. M. C., Nimmo, D. D., Alphey, L. piggybac- and PhiC31-mediated genetic transformation of the Asian tiger mosquito Aedes albopictus (Skuse). PLoS Negl. Trop. Dis. 4, 788(2010).
  110. Patel, N. H. It's a bug's life. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4442-4444 (2000).

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