Abbilden der Morphogenese von Insekten Embryonen mit Lichtbogen basierende Fluoreszenzmikroskopie wurde Stand der Technik geworden. Dieses Protokoll beschreibt und vergleicht drei Befestigungstechniken geeignet für Tribolium castaneum Embryonen führt zwei neue maßgeschneiderte transgenen Linien gut geeignet für die Echtzeit- Bildgebung, diskutiert wesentliche Qualitätskontrollen und zeigt den aktuellen experimentellen Beschränkungen.
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Methodenartikel
Lichtblatt-basierte Fluoreszenzmikroskopie lebender oder fixiert und gefärbt
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der rote Mehlkäfer Tribolium castaneum ist zu einem wichtigen Insektenmodellorganismus in der Entwicklungsgenetik und Evolutionsentwicklungsbiologie worden. Die Beobachtung von Tribolium Embryonen mit Lichtbogen basierende Fluoreszenzmikroskopie hat mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Weitfeld- und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie. Aufgrund der einzigartigen Eigenschaften eines Lichtbogenbasierten Mikroskop dreidimensionale Bilder lebender Proben mit hohem Signal-Rausch-Verhältnisse und eine deutlich reduzierte Photobleich sowie Phototoxizität entlang mehrerer Richtungen über Perioden aufgezeichnet werden, die mehrere dauern Tage. Mit mehr als vier Jahren der methodischen Entwicklung und eine kontinuierlichen Steigerung von Daten, scheint die Zeit entsprechende Standardarbeitsanweisungen für die Verwendung von Lichtblatt - Technologie in der Tribolium Gemeinschaft zu etablieren sowie in den Insekt Gemeinschaft. Dieses Protokoll beschreibt drei Montagetechniken geeignet foder verschiedene Zwecke, stellt zwei neue maßgeschneiderte transgenen Linien Tribolium geeignet für Langzeit - Echtzeit- Bildgebung, schlägt fünf Fluoreszenzfarbstoffe intrazelluläre Strukturen von festen Embryonen etikettieren und liefert Informationen über die Daten Nachverarbeitung für die rechtzeitige Auswertung der aufgezeichneten Daten. Repräsentative Ergebnisse konzentrieren sich auf die langfristige Echtzeit-Bildgebung, optischen Schneidens und der Beobachtung des gleichen Embryos entlang mehrerer Richtungen. Die entsprechenden Datensätze werden als herunterladbare Ressource bereitgestellt. Schließlich beschreibt das Protokoll Qualitätskontrollen für Echtzeit-Bildgebung Assays aktuellen Einschränkungen und die Anwendbarkeit der beschriebenen Verfahren auf andere Insektenarten.
Dieses Protokoll wird für Entwicklungsbiologen in erster Linie gedacht, die Imaging-Lösungen suchen, die Standard-Laborgeräte entwickeln. Es fördert den kontinuierlichen Versuch, die Lücke zwischen den technisch orientierten Laboratorien / Gemeinden zu schließen, die sich entwickeln und Mikros verfeinernKopieren methodologisch und das Life-Science-Labor / Gemeinden, die technischen Herausforderungen 'Plug-and-Play' Lösungen erfordern. Darüber hinaus unterstützt es einen axiomatischen Ansatz, der die biologischen Fragen in den Mittelpunkt der Aufmerksamkeit bewegt.
Einleitung
Die rote Mehlkäfer Tribolium castaneum, die von Schwarzkäfer (Tenebrionidae) zur großen Familie gehört, hat eine lange Geschichte in der Landwirtschaft und Lebenswissenschaften und ist die zweite am besten untersuchte Modell Insektenmodellorganismus nach der Fruchtfliege Drosophila melanogaster. In den letzten vier Jahrzehnten wurde es ein starker und beliebtes Insekt Modellorganismus in der Entwicklungsgenetik, in der evolutionären Entwicklungsbiologie und in den letzten zwanzig Jahren in der embryonalen Morphogenese für eine Vielzahl von Gründen:
Drosophila und Tribolium gehören beide zur Holometabola....
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Protokoll
1. Haltung von Tribolium Cultures
HINWEIS: Standardbedingungen werden als eine Inkubationstemperatur von 25 ° C und 70% relativer Luftfeuchtigkeit in einem 12 h definiert Hell / 12 h Dunkel-Zyklus. Weitere Informationen über die Tribolium Haltung, sind entsprechende Richtlinien 64 zur Verfügung. Dieses Protokoll erfordert zwei verschiedene Mehlbasis Medien, die in Kilogramm-Mengen und gespeichert für mehrere Monate vorbereitet werden kann.
- Vor Beginn der Arbeit mit Mehl und inaktiver Trockenhefe, lagert die ungeöffneten Verpackungen bei -20 ° C für 24 h und dann auf Raumtemperatur erwär....
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Ergebnisse
Dieses Protokoll beschreibt einen experimentellen Rahmen für die Fluoreszenzabbildung von lebenden oder fixierten und gefärbten Tribolium Embryonen mit LSFM. Aufgrund der geringen Mengen an Photobleichung und Phototoxizität, eine direkte Folge seiner optischen Schneidens Fähigkeit ist LSFM besonders gut geeignet für die Langzeitechtzeit-Bildgebung.
Die neuartige Ágóc {ATub'H2B-mEmerald} # 1 transgene Linie drückt .......
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Diskussion
Qualitätskontrolle
In Echtzeit- Bildgebung Assays, muss die Herstellung und Aufzeichnungsverfahren nicht-invasiv sein, dh weder die mechanische und chemische Behandlung (Sammlung, dechorionation, auf die Probenhaltermontage) noch die integrierte Energiebelastung während der Beobachtung sollte die Lebensfähigkeit der Probe beeinflussen. Für Studien, die WT Entwicklung zu charakterisieren, ist es nur die Verwendung von Daten aus Experimenten empfohlen, in denen der Em.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Autor Beiträge
FS und Ehks konzipierte die Forschung. FS erzeugt, um die transgenen Linien Ágóc. Lichtbogen-basierte Fluoreszenz-Bildgebung wurde durch FS und SK durchgeführt. FS und Ehks schrieb das Manuskript mit dem Input von SK.
Danksagungen
Wir danken Sven Plath für den technischen Support. Die Glia-blau transgene Linie war ein freundliches Geschenk von Gregor Bucher (Göttingen, Deutschland). Die Forschung wurde von dem Exzellenzcluster Frankfurt am Main für Makromolekulare Komplexe (CEF-MC, EXC 115, Sprecher Volker Dötsch) teilweise zu Ehks am Buchmann-Institut für Molekulare Biowissenschaften (BMLS, Direktor Enrico Schleiff) an der Goethe gewährt finanziert Universität Frankfurt am Main von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Vollkornweizenmehl | Demeter e.V. | 1.13E+08 | US: Vollkornmehl, UK: Vollkornmehl |
| 405 Feinweizenmehl | Demeter e.V. | 1.13E+08 | US: Gebäckmehl, UK: Weichmehl |
| inaktive Trockenhefe | Fliegenstaub / Genesee Scientific | 62-106 | |
| Phosphatgepuffertes Sain (PBS), pH 7,4 | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Natriumhypochlorit, ~12% aktiv Cl | Sigma Aldrich | 425044-250ML | Achtung: Natriumhypochlorit ist ätzend |
| niedrigschmelzende Agarose | Carl Roth | 6351.2 | |
| 6-Well-Platte | Orange Scientific | 4430500 | |
| 24-Well-Platte | Orange Scientific | 4430300 | |
| Glaskapillaren, intern & Oslash; 0,46 mm | Brand GmbH + Co KG | 7087 09 | |
| SYTOX Green | Thermo Fisher Scientific | 57020 | Die Herstellung der Färbelösung ist in Tabelle 2 |
| erläutert YOYO-1 Iodid | Thermo Fisher Scientific | Y3601 | Die Vorbereitung der Färbelösung wird in Tabelle 2 erläutert |
| BOBO-3 Iodid | Thermo Fisher Scientific | B3586 | Die Vorbereitung der Färbelösung wird in Tabelle 2 erläutert |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | Vorbereitung der Färbelösung wird in Tabelle 2 erläutert |
| Alexa Fluor 546 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22283 | Die Vorbereitung der Färbelösung wird in Tabelle 2 |
| Sieb, 800 & micro; m Maschenweite | VWR International | 200.025.222-051 | |
| Sieb, 710 & Mikro; m Maschenweite | VWR International | 200.025.222-050 | für die Vorbereitung des Wachstumsmediums (Stufe 1.1) |
| Sieb, 300 & Mikro; m Maschenweite | VWR International | 200.025.222-040 | |
| Sieb, 250 & Mikro; m Maschenweite | VWR International | 200.025.222-038 | für die Vorbereitung des Eiablagemediums (Schritt 1.2) |
| Glasschale, Ø 100 mm × 20 mm | Sigma Aldrich | CLS70165102 | |
| Zellensieb, 100 & Mikro; m Maschenweite | BD Biosciences | 352360 | |
| Pinsel, Kopf & Oslash; 2 mm | VWR International | 149-2121 | |
| Spritze, 1,0 mL | B. Braun Medical AG | 9166017V | |
| Szintillationsfläschchen | Sigma Aldrich | M1152-1000EA | |
| Paraformaldehyd (PFA) | Sigma Aldrich | 158127 | Achtung: Paraformaldehyd ist giftig und ätzend |
| n-Heptan ≥ 99% | Carl Roth | 8654.1 | Achtung: n-Heptan ist brennbar und giftig |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | Achtung: Trition X-100 ist ätzend |
Referenzen
- Brown, S. J., Denell, R. E., Beeman, R. W. Beetling around the genome. Genet. Res. 82, 155-161 (2003).
- Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346, 763-767 (2014).
- Tong, K. J., Duchêne, S., Ho, S. Y. W., Lo, N.
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Nachdrucke und Genehmigungen
