Methodenartikel

Die DNA-Farbstoff-ausgelöste Seitenbevölkerung Phänotyp zur Erkennung und Reinigung von Krebsstammzellen aus biologischen Proben

DOI:

10.3791/55634

⸱

10. Mai 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Immunobiology, Kantonsspital St. Gallen, 2Internal Medicine V, Medical University of Innsbruck, 3Tyrolean Cancer Research Institute (TKFI), 4Medical Clinic III, Oncology, Hematology, Immunoncology and Rheumatology, University Clinic Bonn (UKB)

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Methoden, die die Charakterisierung und Isolierung von Stammzellpopulationen aus biologischen Proben ermöglichen, sind entscheidend für den Fortschritt der Stammzell-zielgerichteten Behandlungen bei Krebs und darüber hinaus. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Krebs-Stammzell-Isolierung mit dem Farbstoff-ausgelösten Seiten-Population Phänotyp.

Zusammenfassung

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Krebs ist eine Stammzell-getriebene Krankheit und Tilgung dieser Zellen hat sich zu einem wichtigen therapeutischen Ziel. Die Entschlüsselung von Schwachstellen von Krebsstammzellen (CSC) und die Identifizierung geeigneter molekularer Targets beruht auf Methoden, die ihre spezifische Diskriminierung in heterogenen Proben wie Zelllinien und ex vivo- Tumorgewebe ermöglichen. Durchflusszytometrie / FACS ist eine leistungsstarke Technologie zur multiparametrischen Sezierung biologischer Proben auf Einzelzellenebene und ist bis heute die Methode der Wahl, um lebende Zellen für nachgeschaltete Analysen wiederherzustellen. Oberflächenmarker wie CD44 und CD133 sowie der Nachweis der enzymatischen Aldehyddehydrogenase wurden häufig verwendet, um CSCs aus Tumorproben durch FACS zu definieren und zu sortieren. Ein komplementärer Ansatz, der hier im methodischen Detail dargestellt ist, nutzt die funktionelle Farbstoff-Extrusion durch ABC-Arzneimitteltransporter, die eine ausgeprägte Population von fluoreszenzdämmenden Zellen identifiziert, die üblicherweise als Seitenpopulation (SP) bezeichnet werden. SPKrebszellen weisen kanonische Stammzellcharakteristiken auf und können unter Verwendung von Mitteln, die den Farbstoff-Extrudier-Arzneimitteltransporter hemmen (am häufigsten ABCB1 / P-Glykoprotein / MDR1 / CD243 und ABCG2 / Bcrp1 / CD338), abrogiert und funktionell bestätigt werden. Darüber hinaus ist der SP-Assay mit anderen durchflusszytometrischen Auswertungen, wie Färbung von Oberflächenantigenen, Aldehyddehydrogenase-Nachweis und toter Zelldiskriminierung ( z. B. mit 7-AAD oder Propidiumiodid (PI)) kompatibel. So beschreiben wir eine wertvolle und weitgehend anwendbare Methode zur CSC-Identifikation, Isolierung und Subcharakterisierung mechanistisch auf der Grundlage eines funktionalen und nicht eines phänotypischen Parameters. Obwohl wir ursprünglich mit Hoechst 33342 als auslösenden Farbstoff durchgeführt wurden, konzentrieren wir uns hier auf den neueren violetten Farbstoff-basierten SP-Phänotyp, der auf jedem Durchflusszytometer, das mit einer violetten Laserquelle ausgestattet ist, auflösbar ist.

Einleitung

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Die Wirksamkeit der primären Krebstherapien hat sich im Laufe des letzten Jahrzehnts durch die überzeugenden Fortschritte im genetischen und molekularen Verständnis der Erkrankung und das Aufkommen von zielgerichteten Medikamenten wie therapeutischen Antikörpern und kleinen Molekülinhibitoren deutlich verbessert. Im Gegensatz dazu sind metastatische und wiederkehrende Erkrankungen immer noch typisch, und Morbidität und Mortalität bleiben in diesen klinischen Einstellungen hoch. CSCs stellen eine deutliche Subpopulation innerhalb von Tumoren dar und sind mit kanonischen Stammzelleneigenschaften wie Klonogenität / Tumorigenität, Multi-Arzneimittelresistenz und asymmetrischer Zellteilung 1 , 2 ausgestattet. So führen CSCs nicht nur metastatische Progression und Tumor Heterogenität, sondern auch bestehen während der Behandlung zu prädisponieren den Patienten zum Rückfall. Therapeutische CSC-Eliminierung ist daher ein wichtiges medizinisches Bedürfnis, die Wiederkehr von Krankheiten zu verhindern und eine langfristige Heilung von Krebs zu ermöglichen 3 .

Die Identifizierung von Schwachstellen und die Aufklärung von Strategien zur Beseitigung von CSCs hängt stark von Methoden ab, die ihre Reinigung aus biologischen Proben für die anschließende Expressionsprofilierung und / oder funktionelle Untersuchung ermöglichen. Im Gegenzug beruhen solche Verfahren auf Oberflächen-, intrazellulären oder funktionellen Markern, die für diese Zellen spezifisch sind. CSC-spezifische Oberflächenmarker umfassen, sind aber nicht beschränkt auf CD44, CD133, CD24 und CD90 und wurden verwendet, um CSC-Populationen in einer Vielzahl von Tumorentitäten einschließlich Brustkrebs und Darmkrebs zu identifizieren 4 . Eine weitere Markierung, Aldehyddehydrogenase (ALDH), zeigt die intrazelluläre Lokalisierung und kann funktionell detektiert werden, wobei ein jeweiliges Substrat bereitgestellt wird, dessen enzymatische Umwandlung Licht erzeugt. Mit diesem Test wurden auch CSC-Populationen in diversen Tumorentitäten identifiziert. Eine ergänzende Methode, die gemeinhin als SP-Analyse bezeichnet und hier in m dargestellt wird Ethodologische Details, nutzt den aktiven Farbstoffausfluss durch ABC-Arzneimitteltransporter, um kleine Populationen von fluoreszenzdämmenden Stammzellen 6 , 7 , 8 zu identifizieren. Um dies zu erreichen, wird eine gegebene Probe in Gegenwart eines lipophilen DNA-bindenden Fluorophors inkubiert, der alle durch passive Diffusion in alle Zellen eindringt und nukleare und mitochondriale DNA zur Bindung zielt. Nicht-CSCs ohne ABC-Arzneimitteltransporter-Expression akkumulieren den Farbstoff, was zu einer hellen Fluoreszenz führt, während CSCs aktiv den Farbstoff extrudieren, der die Fluoreszenz reduziert. Die pharmakologische Hemmung der Arzneimitteltransporteraktivität unterbricht und verarbeitet den SP-Phänotyp funktionell und sollte für Kontrollzwecke verwendet werden. CSC-Populationen, die SP-Charakteristiken aufweisen, wurden unter anderem in Eierstockkrebs 9 , 10 , Prostatakrebs 11 ,> 12, Brustkrebs 13 , Lungenkrebs 14 , Endometriumkrebs 15 , Gliom 16 , 17 und Knochensarkom 18 . Wichtig ist, dass der SP-Assay sowohl mit Krebszelllinien als auch mit primärem Tumorgewebe kompatibel ist, obwohl das primäre Material zusätzliche Herausforderungen wie die Anforderung an eine spezifische Tumorzelldiskriminierungsstrategie darstellt (bestimmte Wirtszellpopulationen können auch SP-Merkmale aufweisen) 19 , 20 .

Die beiden am meisten etablierten SP-verleihenden Arzneimitteltransporter sind ABCB1 / P-Glykoprotein / MDR1 / CD243 und ABCG2 / Bcrp1 / CD338 8 , 9 , 21 ; Jedoch können auch andere Arzneimitteltransporter eine molekulare Determinante des SP-Phänotyps sein ( zB ABCB5) 22 . ABCB1Kann mit Verapamil effizient blockiert werden, während die Aktivität von ABCG2 mit Fumitremorgin C (FTC) 6 , 19 spezifisch aufgehoben werden kann. Eine besondere Stärke der SP-Analyse ist, dass sie mit anderen Färbungen ( z. B. Oberflächenmarkierungen und ALDH) kombiniert werden kann und dass es die lebende Zellwiederherstellung ermöglicht, so dass sie mit nachgeschalteten funktionellen Untersuchungen kompatibel ist. Darüber hinaus ist die SP-Erkennung aufgrund der hohen Konservierung von ABC-Arzneimitteltransportern unter den CSC-Populationen 9 , 23 weitgehend anwendbar.

Ursprünglich wurde die SP-Detektion unter Verwendung von Hoechst 33342 als Triggerfarbstoff 24 durchgeführt. Dieser Farbstoff erreicht eine ausgezeichnete Auflösung, erfordert jedoch eine Ultraviolettlaseranregung; Daher ist ihre Anwendbarkeit natürlich auf High-End-Durchflusszytometrie-Instrumente beschränkt. Das Aufkommen von DyeCycle Violet (DCV) 25 hat neue Avenu eröffnetEs für die SP-Analyse und erweitert die Anwendbarkeit dieser Methode auf Standard-Durchflusszytometrie-Instrumente ohne Ultraviolett-Laserquelle (eine violette Laserquelle genügt, um DCV-SP-Zellen zu lösen). Wichtig ist, dass Hoechst 33342 und DCV gemeinsame Pumpenspezifitäten aufweisen, was darauf hinweist, dass entweder Farbstoff die gleichen Zellpopulationen identifizieren sollte.

Hier stellen wir Ihnen ein detailliertes experimentelles Protokoll der DCV-basierten SP-Analyse zur schnellen und einfachen Reproduktion in unabhängigen Labors zur Verfügung. So sehen wir unseren Artikel als Ressource für CSC-Forscher, die zur Optimierung und Standardisierung dieser nützlichen zellbiologischen Methode beitragen sollen.

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Protokoll

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Dieses Protokoll ist in voller Übereinstimmung mit den Standards Institutional Ethical Review Board Richtlinien. Wenn menschliches oder tierisches Gewebe mit dem hier dargestellten Protokoll untersucht wird, sind die Forscher verpflichtet, die Zustimmung des jeweiligen Prüfungsausschusses ihrer Einrichtung oder ihres Landes zuzulassen.

Achtung: Für dieses Protokoll gelten die üblichen Vorsichtsmaßnahmen für den sicheren Umgang mit biologischen Proben. Dazu gehören das Tragen von Handschuhen und ein Laborkittel, und die Arbeit unter einem Biosicherheitskabinett, wann immer möglich.

1. Vorbereitung der Zellen

  1. Krebszelllinien
    1. Kultur eine jeweilige menschliche oder murine Krebszelllinie bei 37 ° C in 10-30 ml eines geeigneten Mediums ( z. B. RPMI 1640, ergänzt mit 10% ( v / v ) FBS, 2 mM L-Glutamin und 1x Penicillin / Streptomycin) und Ernte Die Zellen bei Sub-Konfluenz ( dh 70-90%) unter Verwendung von Verdau mit 0,05% Trypsin-EDTA oder einem anderen De-AttVermittlungsverfahren. Bestimmen Sie die Zellzahl und überprüfen Sie die Lebensfähigkeit mit einer Zählkammer und Trypan-Blau-Färbung. Der Anteil der lebensfähigen Zellen sollte 85% übersteigen.
      HINWEIS: Beispiele für menschliche Krebszelllinien, die SP-Kompartimente beherbergen, umfassen MCF7 / HTB-22 und SKBR3 / HTB-30 (Brustkrebs), A2780 und SKOV-3 / HTB-77 (Eierstockkrebs) und A549 (Lungenkrebs) 26 .
  2. Ex vivo -Tumorgewebe
    1. Nehmen Sie eine frische chirurgische Tumorprobe oder alternativ, ernten Sie Tumorgewebe aus einem transplantierbaren oder gentechnisch veränderten Maus-Tumormodell. Nehmen Sie 200-1000 mg Gewebe und erzeugen Sie eine Einzelzellsuspension durch mechanische Disaggregation ( z. B. unter Verwendung von Scheren oder Skalpell) und enzymatische Verdauung ( z. B. unter Verwendung eines Collagenase / Dispase / DNase-Cocktails).
    2. Filtriere die Probe durch ein 70 μm-Cut-off-Sieb. Bestimmen Sie die Zellzahl und überprüfen Sie die Lebensfähigkeit mit einer Zählkammer und Trypan blUe färbung
      HINWEIS: Verdauungscocktails enthalten häufig 200 μg / ml Kollagenase P, 0,8 U / mL Dispase und 25 μg / mL DNase I und Inkubationszeiten liegen typischerweise im Bereich von 20 - 50 min. Idealerweise wird die Gewebe-Disaggregation nach einem für das zu untersuchende Gewebe 27 , 28 , 29 optimierten Protokoll durchgeführt.

2. Testproben

  1. Anpassung der Zellkonzentration auf 1 x 10 6 Zellen / ml im frischen Kulturmedium (ein nährstoffhaltiges Vehikel ist wichtig, da die Farbstoff-Extrusion ein aktiver Energieverbrauch ist). Schließlich 1 ml Probe auf ein gewöhnliches Durchflusszytometrie / FACS-Rundbodenrohr (mit der Bezeichnung "Test") übertragen.
    HINWEIS: Für optimale Ergebnisse kann es notwendig sein, dass die Zellkonzentration titriert wird (z. B. 5 x 10 5 -1 x 10 6 -2,5 x 10 6 Zellen / ml), aber eine niedrigere Zellkonzentration allgemeinErgibt eine höhere Auflösung 19 . Nur für die Sortierung von Applikationen, bei denen eine maximale Anzahl von SP-Zellen wiederhergestellt werden soll, empfiehlt es sich, die Zellkonzentration auf bis zu 1 x 10 7 Zellen / ml zu erhöhen.
  2. 10 μM DCV zu der Probe geben und gut vermischen, entweder durch sanftes Vortexen oder Resuspendieren für 3-5x. Gehen Sie zu den Hemmungssteuerungen vor.
    HINWEIS: Optimale Ergebnisse können von der Titration des auslösenden Farbstoffs abhängen (z. B. 2,5; 5; 10; 20 μM), aber eine höhere Farbstoffkonzentration ergibt im Allgemeinen eine höhere Auflösung 19 .

3. Inhibition Controls

  1. Übertragen Sie 250 μl der farbstoffhaltigen Zellsuspension auf eine neue Durchflusszytometrie / FACS-Rundbodenröhre (mit der Bezeichnung "Kontrolle"). 50 μM Verapamil oder 20 μM FTC zugeben und gut durch Pipettieren vermischen.
    HINWEIS: Verapamil und FTC sind die bekanntesten Inhibitoren für die SP-Analyse, haben aber unterschiedliche Efflux-Pumpen-spezifischeY: Verapamil hemmt mehrere ABC-Arzneimitteltransporter einschließlich ABCB1 und ABCB5, während FTC für ABCG2 6 , 19 spezifisch ist . Wenn der SP-Status einer einzelnen Probe unbekannt ist, empfiehlt es sich daher, sowohl Verapamil als auch FTC in separaten Röhren zu verwenden.

4. Färbung

  1. Kappe sowohl die "Test" und "Kontrolle" Rohre und inkubieren sie bei 37 ° C im Dunkeln für 90 min, mit sanften Agitation alle 15 min. Die meisten der Farbstoff-Extrusion in SP-Zellen treten innerhalb der ersten 45 min auf, aber die Farbstoffakkumulation in Nicht-SP-Zellen (die zur Auflösung beitragen) ist nur maximal nach 75-90 min 19 .
  2. Nach Beendigung der Färbung die Zellen in 3-4 mL eiskaltem PBS waschen und das Pellet in einem Volumen von 100 μl (PBS) resuspendieren. Halten Sie die Zellen im Dunkeln und kühlen auf Eis, und fahren Sie mit der Färbung der zusätzlichen Marker. Alternativ können Sie auch Durchflusszytometrie ana durchführenLyse

5. Kalkulation für andere Marker

  1. Fügen Sie eine gewünschte Gruppe von Fluorochrom-konjugierten Antikörpern zu den DCV-gefärbten Zellen hinzu, mischen Sie gut und inkubieren Sie die Zellen bei 4 ° C im Dunkeln für 20-30 min. Waschen Sie die Zellen in 3 - 4 mL eiskaltem PBS und gehen Sie auf tote Zelle Diskriminierung.
    HINWEIS: Antibody-Formate, die mit DCV leicht kompatibel sind und praktisch keine Kompensation erfordern, umfassen PerCP oder PerCP-Cy5.5, PE-Cy7, APC, Alexa Fluor 647, APC-Cy7, APC-H7, BV711, Alexa Fluor 750 und BV786 . Formate, die mit DCV kompatibel sind, aber eine Kompensation erfordern, umfassen FITC, Alexa Fluor 488, PE und BV650. Formate, die praktisch nicht mit DCV kompatibel sind, sind BV421, V450 und V500.
  2. Addieren Sie 7-AAD (oder PI) zu den DCV-gefärbten Zellen in der vom jeweiligen Hersteller empfohlenen Konzentration und inkubieren Sie die Proben für 5 - 10 min im Dunkeln. Filtriere die Proben durch 70 & mgr; m abgeschnittene Siebe und fuhr fort, um die zytometrische Analyse durchzuführen.

6. Durchflusszytometrische Analyse

HINWEIS: Es empfiehlt sich, das jeweilige Durchflusszytometrie-Instrument während des Färbevorgangs bereits einzuschalten, so dass alles so eingestellt ist, wie die Proben fertig sind. Dazu gehören auch Standard-Wartungsprozeduren wie System Performance Tracking und Tank Nachfüllen.

  1. Erfassen Sie die Zellen auf dem Durchflusszytometer und geben Sie sie auf eine bivariate FSC / SSC-Punkt-Darstellung (Abbildung 1B). Ausschliessen von Dubletts und Aggregaten durch Vergleich der verschiedenen Signale von FSC ( dh Höhe, Breite, Fläche) (Abbildung 1C).
    1. Wenn ein toter Zellmarker eingeschlossen worden ist, Gate auf die lebensfähige Zellfraktion ( z. B. 7-AAD-negativ) ( Abbildung 1D ). Visualisieren Sie die lebensfähigen Singulettzellen auf einem bivariaten Punktdiagramm für "blaue" und "rote" DCV-Emission. Zu diesem Zweck den "blauen" Fluoreszenzkanal auf der y-Achse ( zB 450/50) und den 'Roter "Fluoreszenzkanal auf der x-Achse ( zB 525/50).
    2. Schalten Sie beide Kanäle in den Linearmodus und stellen Sie die Detektorspannungen entsprechend so ein, dass sich der SP an der Seite des Plots im unteren linken Quadranten befindet. Umgekehrt lokalisiert das Nicht-SP den oberen rechten Quadranten des Plots, der die Zellzyklusverteilung (G1 und G2) reflektiert. Tor schalten und die Erfassung stoppen (Abbildung 1E ).
      HINWEIS: DCV-definierte SP-Zellen können mit Durchflusszytometern erkannt werden, die mit einer violetten Laseranregungsquelle ( dh einer 405 nm Laserlinie) ausgestattet sind. Es ist eine spezifische SP-Analyse, dass die emittierte Fluoreszenz im linearen Modus gemessen wird und in zwei getrennten Kanälen, die auf einem Bivariate-Punkt-Diagramm angezeigt werden. Die "blaue" Emission von DCV wird bei etwa 450 nm gemessen ( z. B. bei einem 450/40 Standardfilter) und die "rote" Emission von DCV wird bei etwa 510 - 585 nm gemessen ( zB mit einem 510/50, a 525/50 oder ein 585/15 Filter) 19 . Aufgrund der besonderen Chemie des Assays ist die Trennung zwischen SP und Nicht-SP-Zellen im "roten" Fluoreszenzkanal 19 im allgemeinen höher.
  2. Laden Sie die Sperrregelung (en) und erwerben Sie die Daten. Die SP-Zellen sind nun verschwunden oder sind im Wesentlichen reduziert (Abbildung 1F ). Falls nötig, verfeinere das SP-Tor auf Basis dieser Daten.
  3. Um die Oberflächenmarker-Expression durch SP-Zellen zu untersuchen, lassen Sie die "rote" Fluoreszenz von DCV auf der x-Achse und zeigen einen entsprechenden Fluoreszenzkanal auf der y-Achse im logarithmischen Modus ( zB APC) an. Stellen Sie die Detektorspannungen entsprechend ein und gleiten Sie den Bruchteil der SP-Zellen, die für den untersuchten Marker (s) positiv sind (Abbildung 1G ). Die Koexpression eines bestimmten Markers durch SP-Zellen ergibt ein entsprechendes Signal im oberen linken Quadranten des Plots 30 .
  4. Notieren Sie dieDaten und / oder sortiere die SP-Zellen.

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Ergebnisse

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Vorausgesetzt ist eine repräsentative SP-Analyse von A2780-Zellen, eine menschliche Eierstockkrebs-Zelllinie, die zuvor gezeigt wurde, um eine SP-Bilanzierung von weniger als 1% der Zellen 9 zu beherbergen. Die Zellen wurden bei 37 ° C in RPMI 1640, ergänzt mit 10% ( v / v ) FBS, 2 mM L-Glutamin und 1x Penicillin / Streptomycin, gezüchtet und bei 85% Konfluenz unter Verwendung einer Behandlung mit 0,05% Trypsin-EDTA geerntet. Die Zellen wurden in PBS gewa...

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Diskussion

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Der Fortschritt in der klinischen Behandlung von Krebs hängt auch von der Entwicklung von Behandlungsmodalitäten ab, die auf CSCs abzielen. Methoden, die eine zuverlässige Isolierung von CSCs aus biologischen Proben ermöglichen, beschleunigen die Identifizierung geeigneter Ziele und sind daher in diesem Bestreben von entscheidender Bedeutung. SP-Analyse ist eine etablierte und wertvolle Technik zur Identifizierung von CSC-Populationen, die ABC-Drogen-Transporter ausdrücken und die Implementierung von DCV hat seine Anwen...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären. Es gibt auch keine Nicht-Autor-Beteiligung an der Vorbereitung des Manuskripts.

Danksagungen

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Maximilian Boesch wird von einem Erwin Schrödinger Stipendium des Wissenschaftsfonds FWF (Stimmnummer J-3807) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Vybrant DyeCycle VioletThermo Fisher ScientificV35003Gebrauchsfertig
VerapamilhydrochloridSigma-AldrichV4629In Ethanol
auflösen Fumitremorgin CSigma-AldrichF9054Auflösen in DMSO
7-AAD (oder Propidiumiodid - PI)BioLegend420403Gebrauchsfertig
Standard-Zellkulturreagenzien (z.B. , Medium, FBS, L-Glutamin, Antibiotika, PBS, Trypsin-EDTA, etc.)Verschiedene Lieferanten
Proben/Zellen von Interesse (z.B. , menschliche oder murine Krebszelllinie, menschliches oder murines Tumorgewebe)Verschiedene Lieferanten
Durchflusszytometrisches Instrument (FACS; Analysator oder Zellsortierer)Verschiedene LieferantenViolette Laserquelle erforderlich
FACS-Röhren (mit rundem Boden)Verschiedene LieferantenRöhren mit Kappe empfohlen
70 & Mikro; m Cut-off-SiebeVerschiedene AnbieterFakultativ, aber empfohlen
Verdauungsenzymmischung (z.B. , Kollagenase/Dispase/Dnase)Verschiedene LieferantenNur relevant für die Gewebedissoziation
Flurochrom-konjugierte Antikörper gegen Oberflächenmarker von InteresseVerschiedene LieferantenOptionales
ALDEFLUOR KitSTEMCELL Technologies01700Fakultativ

Referenzen

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Schlagwörter

DurchflusszytometrieFarbstoffextrusionABC TransporterViolett Farbstoff AssayZellreinigungOberfl chenmarkerAldehyd DehydrogenaseGenexpressionsprofiling

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