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Assessing Autophagic Flux durch Messung von LC3, p62 und LAMP1 Co-Lokalisierung mittels Multispektral Imaging Flow Cytometry

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DOI:

10.3791/55637

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21. Juli 2017

1Amnis Biology Department, MilliporeSigma

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier wurde die multispektrale bildgebende Durchflusszytometrie mit einem analytischen Merkmal, das helle Detailbilder von 3 Autophagie-Markern vergleicht und deren Co-Lokalisierung zusammen mit der LC3-Spotzählung quantifiziert, verwendet, um Autophagie objektiv, quantitativ und statistisch robust zu messen.

Zusammenfassung

Autophagie ist ein katabolischer Weg, in dem normale oder dysfunktionelle zelluläre Komponenten, die sich während des Wachstums und der Differenzierung ansammeln, über das Lysosom abgebaut und recycelt werden. Während der Autophagie wird das zytoplasmatische LC3-Protein lipidiert und an die autophagosomalen Membranen rekrutiert. Das Autophagosom verschmilzt dann mit dem Lysosom, um das Autolysosom zu bilden, wo der Abbau der Autophagosomen-Vesikel und deren Inhalt auftritt. Das ubiquitin-assoziierte Protein p62, das an LC3 bindet, wird auch zur Überwachung des autophagischen Flusses verwendet. Zellen, die sich einer Autophagie unterziehen, sollten die Co-Lokalisierung von p62, LC3 und lysosomalen Markern nachweisen. Immunfluoreszenzmikroskopie wurde verwendet, um LC3 puncta, p62 und / oder Lysosomen auf einer per-Zell-Basis visuell zu identifizieren. Eine objektive und statistisch rigorose Bewertung kann jedoch schwierig sein. Um diese Probleme zu überwinden, wurde die multispektrale Bildgebungsdurchflusszytometrie zusammen mit einem analytischen Merkmal verwendet, das die helle de vergleicht(LC3, p62 und lysosomale LAMP1) und quantifiziert ihre Co-Lokalisierung in Kombination mit LC3-Punktzählung, um Autophagie in einer objektiven, quantitativen und statistisch robusten Weise zu messen.

Einleitung

Makroautophagie, im Folgenden Autophagie genannt, ist ein katabolischer Weg, in dem beschädigte oder dysfunktionelle Komponenten, langlebige Proteine ​​und Organellen über das Lysosom abgebaut und recycelt werden 1 . Autophagie ist ein dynamischer, mehrstufiger Prozess, der die Bildung eines Autophagosoms beinhaltet; Die Verschmelzung des Autophagosoms mit dem Lysosom, die das Autolysosom bildet; Und der Abbau des Inhalts des Autolysosoms 2 . Der entscheidende biologische Marker, der zur Identifizierung von Autophagie in Säugetiersystemen verwendet wird, ist das Mikrotubuli-assoziierte Protein 1A / 1B-leichte Kette 3 (LC3), das die autophagosomale Membran bildet. Während der Autophagie wird zytosolisches LC3-1 an Phosphatidylethanolamin konjugiert, um LC3-II zu bilden; LC3-II wird dann in die autophagosomale Membran 3 eingearbeitet. Ein weiterer weit verbreiteter Marker für autophagischen Fluss ist das Autophagie-Rezeptor-Sequestosom 1 (SQSTM1, p62), das physisch liNaut autophagische Ladung an die autophagische Membran 4 , 5 .

Methoden, die traditionell verwendet wurden, um Autophagie zu messen, sind Western Blots und Fluoreszenzmikroskopie 7 . Jedoch werden keine dieser Methoden als der "Goldstandard" betrachtet 2 , 6, da es Herausforderungen gibt, die mit diesen beiden Techniken verbunden sind. Western Blots geben nur einen Durchschnitt, weil sie eine homogenate Probe verwenden, so dass Beobachter nicht sehen können, was in einzelnen Zellen passiert. Auf der anderen Seite gibt die Fluoreszenzmikroskopie eine Beobachterinformation auf der einzelligen Ebene, aber es fehlt die Durchsatzfähigkeit, so dass es schwierig ist, objektive und statistisch rigorose Einschätzungen zu erhalten. In den letzten Jahren hat die Messung von LC3 und p62 durch multispektrale Bildgebungsdurchflusszytometrie (MIFC, siehe Tabelle der Materialien ) popu gewonnenGröße durch seine quantitative Leistung, hohe Durchsatzfähigkeiten, Multiplex-Potential und die Fähigkeit, jede Zelle abzubilden. Eine der am weitesten verbreiteten Methoden zur Messung der Autophagie mit MIFC, zusammen mit ihrer Begleitanalyse-Software (siehe Tabelle der Materialien ), ist durch die Punktzählung von LC3 puncta oder autophagosomen 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Allerdings bedeutet eine Erhöhung der Autophagosomen nicht zwangsläufig, dass es eine Erhöhung der Autophagie gibt, da sie auch eine Blockade im Prozess darstellen könnte 2 . LC3-II Umsatz ist ein nützlicher Parameter, um autophagischen Fluss zu messen durch die Analyse von Zellen in der Gegenwart undAbwesenheit eines lysosomalen Abbauinhibitors, wie Chloroquin. Chloroquin inhibiert die Fusion des Autophagosom zum Lysosom, wodurch die Quantifizierung der Autophagosom Bildung als Maß für den Grad der durch autophagy autophagischen Flußmittel vor dem lysosomalen Abbau Arretieren kann 18 auftreten. Darüber hinaus wird p62 primär durch Autophagie abgebaut, und wenn der lysosomale Abbau des Autophagosoms und seines Inhalts blockiert wird, wird eine Anreicherung von p62 erwartet, 17 , 19 .

Autophagy ist ein mehrstufiger Prozess, und die Messung von LC3 oder p62 allein liefert kein vollständiges Bild dessen, was in den Zellen passiert. Die jüngsten Veröffentlichungen haben die Notwendigkeit betont, die gleichzeitige Bildung des Autolysosoms 2 , 17 , 20 , 21 zu untersuchen . MIFC istDie die Bildung des Autolysosoms durch die Abbildung der Co-Lokalisierung des Autophagosoms an das Lysosom 15 - 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 eindeutig messen kann. Darüber hinaus wurde auch die Co-Lokalisierung von p62 und LC3 unter Verwendung von MIFC untersucht, um den autophagischen Fluss 5 zu messen. In der referenzierten Analysesoftware heißt das "Merkmal", das die Co-Lokalisierung misst, "Bright Detail Similarity R3" (BDS) und wurde speziell entworfen, um die kleinen, hellen Bilddetails von zwei Bildern zu vergleichen. BDS ist der logarithmierte Pearson-Korrelationskoeffizient der lokalisierten hellen Flecken mit einem Radius von 3 Pixeln oder weniger; Mit anderen Worten, BDS berechnet den Grad von oVerkürzte Pixel aus zwei verschiedenen Fluoreszenzkanälen. Die hellen Flecken sind entweder korreliert ( dh gleiche räumliche Lage) oder unkorrelierte ( dh unterschiedliche räumliche Orte). Daher variiert der Korrelationskoeffizient zwischen 0 (unkorreliert) und 1 (perfekte Korrelation). Der Koeffizient wird log-transformiert, um den Bereich zwischen null und unendlich 26 , 27 zu erhöhen. BDS allein darf nicht ausreichen; Rajan et al. Dass mit nur BDS zu falsch-positiven oder falsch-negativen Ergebnissen führen könnte 21 . BDS bewertet die Co-Lokalisierung von zwei Marker der Autophagie, aber nicht die Anzahl der Autophagosomen. Um die Anzahl der Autophagosomen zu berücksichtigen, haben Rajan et al. Inklusive Punktzählung der LC3 puncta 21 . Rajan et al. Vorgeschlagen, mit einem bivariate Scatter-Plot von LC3-Spot-Zählung gegenüber BDS. Mit dieser bivariate Handlung, zwei Populationen werE zuerst identifiziert: eine mit Zellen, die ein hohes Maß an LC3 Spots und eine mit Zellen, die ein niedriges Niveau von LC3 Spots haben. Die Hoch-LC3-Punkt-Population wurde weiter in zwei Populationen unterteilt: Zellen mit geringer Co-Lokalisierung ( dh Akkumulation von Autophagosomen) und Zellen mit hoher Co-Lokalisierung ( dh Akkumulation von Autolysosomen). Diese bivariate Handlung erlaubt es, zwischen Zellen mit sehr wenigen Autophagosomen und Zellen mit einer Anhäufung von Autophagosomen und / oder Autolysosomen zu unterscheiden 21 .

Bisher war die gleichzeitige Ko-Lokalisierung von LC3, p62 und LAMP1 (lysosomaler Marker) nicht möglich mit einem einzigen "Feature Type" in der MIFC Companion Analysesoftware (siehe Tabelle der Materialien ). Ein neues Feature, das kürzlich in Version 6.1 eingeführt wurde, heißt Bright Detail Colocalization 3 (BDC3). BDC3 vergleicht die hellen Detailbilder von jedem der drei Bilder (in diesem Fall LC3, p62 und LAMP1) und quantifiziert die Co-Lokalisierung der drei Sonden ( dh LC3, p62 und LAMP1). Die BDC3-Funktion berechnet den Korrekturkoeffizienten des Pearson, der modifiziert wurde, um auf drei Bilder zu erweitern. Da die hellen Flecken in den drei Bildern entweder korreliert oder unkorreliert sind, variiert der Korrelationskoeffizient zwischen 0 (unkorreliert) und 1 (perfekte Korrelation). Der Koeffizient wird log-transformiert, um den Dynamikbereich zwischen 0 und unendlich zu erhöhen. Durch das Ausschalten der BDS-Funktion mit der BDC3-Funktion, die Analyse-Methode von Rajan et al. Kann nun die drei am häufigsten verwendeten Marker zur Messung der Autophagie in einem System zur gleichen Zeit einbinden. Die Fähigkeit, diese drei Marker von Autophagie in einem einzigen Assay zu lokalisieren, könnte zu neuartigen Einsichten in die Induktion und Regulierung der Autophagie führen. Das folgende Protokoll skizziert die Schritte, um Autophagie in Jurkat-Zellen zu induzieren; Markieren Sie die Zellen mit LC3-, p62- und LAMP1-Antikörpern; Erwerben von Daten auf einem MultispEctral Bildgebungsdurchflusszytometer; Und analysieren die Daten, um autophagischen Fluss zu beurteilen.

Protokoll

1. Vorbereitung des Kulturmediums und des lysosomalen Degradationsinhibitors

  1. 1.1. Machen Sie ~ 500 ml 1x RPMI Kulturmedium. Fügen Sie 5 ml MEM-nicht-essentielle Aminosäuren (100x), 5 ml Natriumpyruvat (100 mM), 5 ml Penicillin-Streptomycin-Glutamin (100x) und 25 ml fötales Rinderserum (FBS) zu einem 500 ml hinzu Flasche RPMI - 1640 1x Medium. Das Medium sollte in einem Biosicherheitsschrank vorbereitet werden. Das RPMI-Kulturmedium bei 2-8 ° C aufbewahren. Das RPMI-Kulturmedium auf 37 ° C erhitzen, bevor es zu den Jurkat-Zellen hinzugefügt wird.
  2. Machen Sie 100 mM Chloroquin, den lysosomalen Abbau-Inhibitor. 0,05 g Chloroquindiphosphatsalz abwiegen und 1 ml Zellkultur-Wasser in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen zugeben. Vortex, bis sich das Chloroquin aufgelöst hat.

2. Kultivierung von Zellen

  1. Kultur 80 ml Jurkat-Zellen klonieren E6-1 in RPMI-Kulturmedium bei 37 ° C und 5% CO 2 .
    HINWEIS: Beim Kultivieren von ZellenOder mit den Jurkat-Zellen vor der Fixierung arbeiten, sollten alle Arbeiten im Biosicherheitsschrank durchgeführt werden.
  2. Vor der Induktion Autophagie, zählen die Jurkat-Zellen mit einem Hämocytometer oder eine andere Zelle Zählvorrichtung, um die Zellen / ml zu bestimmen.

3. Inducing Autophagy in Zellen

  1. Nehmen Sie die Jurkat-Zellen in exponentieller Wachstumsphase und teilen Sie sie in vier Proben von jeweils 20 ml in 50-ml-Zentrifugenröhrchen auf. Beschriften Sie die Röhrchen als "Kontrolle", "Kontrolle + Chloroquin", "Hunger" und "Hunger + Chloroquin".
    HINWEIS: Jurkat-Zellen sollten eine Konzentration von 2,5-5 x 10 5 Zellen / ml aufweisen.
  2. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 30 ml Hank's Balanced Salt Solution ohne Ca 2+ oder Mg 2+ (HBSS) zu jeder Probe. Zentrifuge bei 250 xg für 10 min. Den Überstand in einen Abfallbecher gießen.
  3. Die Kontrollproben in 20 ml RPMI-Kulturmedium durch Pipettieren auf und ab unter Verwendung von 25 ml lysierenTerile Einwegpipette, gefolgt von Lichtwirbeln. In ähnlicher Weise resuspendieren die ausgehungerten Proben in 20 ml Earle's Balanced Salt Solution ohne Ca 2+ oder Mg 2+ (EBSS).
  4. Mit einer 25 ml sterilen Einwegpipette können Sie die Kontrolle und die verhungerten Proben auf T75-Flaschen übertragen, die mit "Control", "Control + Chloroquine", "Starved" und "Starved + Chloroquine" bezeichnet wurden.
  5. Füge 20 μl 100 mM Chloroquin zu den 20 ml Zellkulturmedium im "Control + Chloroquin" und den "Starved + Chloroquin" -Kolben hinzu. Mischen Sie das Chloroquin durch sanftes Wirbeln des Kolbens. Legen Sie alle Kolben in einen 37 ° C und 5% CO 2 Inkubator für 2 h.

4. Vorbereitung der Puffer für die Fixierung und Kennzeichnung von LC3, LAMP1 und p62

  1. 10 ml einer 4% Formalin-Fixierungslösung in PBS zubereiten. Füge 4 ml 10% Formalin-Stamm zu 1 ml 10x Dulbecco's Phosphat-gepuffert hinzuKochsalzlösung ohne Ca 2+ oder Mg 2+ (PBS) und 5 ml Reinstwasser in einem 15 mL Zentrifugenröhrchen.
    HINWEIS: ACHTUNG. Formalin / Formaldehyd ist giftig bei Einatmen oder Verschlucken; Reizt die Augen, die Atmungsorgane und die Haut; Und kann durch Inhalation oder Hautkontakt Sensibilisierung verursachen. Es besteht die Gefahr ernster Augenschäden. Es ist ein potentielles Karzinogen.
  2. Vorbereiten von 10 ml einer 1% igen Formalin-End-Resuspension-Lösung in PBS. Füge 1 ml 10% Formalin-Stamm zu 9 ml 1x PBS in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen hinzu.
  3. Vorbereiten von 500 ml Waschpuffer durch Zugabe von 10 ml FBS zu einer 500 ml Flasche von 1x PBS.
  4. 50 ml Permeabilisierungspuffer in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen durch Zugabe von 0,5 ml 10% Triton X-100 zu dem in Schritt 4.3 hergestellten 49,5 ml Waschpuffer herstellen.
  5. Vorbereitung von Anti-SQSTM1 / p62-Alexa 488 (AF488) Antikörper / Permeabilisierungspuffer Arbeitslösung durch Zugabe von 5 μl anti-SQSTM1 / p62-AF488 auf 495 μl des in s hergestellten PermeabilisierungspuffersTep 4.4 Stellen Sie sicher, dass die endgültige Antikörperkonzentration 5 μg / ml beträgt.
    HINWEIS: Machen Sie eine Antikörper-Permeabilisierungspuffer-Arbeitslösung, kurz bevor Sie sie der Probe hinzufügen. Schützen Sie die Lösung vor Licht.
  6. Vorbereitung der Maus-Anti-LC3 / Permeabilisierungspuffer-Arbeitslösung durch Zugabe von 5 μl Maus-Anti-LC3 zu 495 μl des in Schritt 4.4 hergestellten Permeabilisierungspuffers. Stellen Sie sicher, dass die endgültige Antikörperkonzentration 20 μg / ml beträgt.
    HINWEIS: Machen Sie Antikörper-Permeabilisierungspuffer-Arbeitslösungen, kurz bevor Sie es der Probe hinzufügen. Schützen Sie die Lösung vor Licht.
  7. Vorbereitung der Esel-Anti-Maus-Alexa 647 (AF647) / Permeabilisierungspuffer-Arbeitslösung durch Zugabe von 5 μl AF647-markiertem Esel-Anti-Maus-IgG zu 495 μl des in Schritt 4.4 hergestellten Permeabilisierungspuffers. Stellen Sie sicher, dass die endgültige Antikörperkonzentration 20 μg / ml beträgt.
    HINWEIS: Machen Sie die Antikörper-Permeabilisierungspuffer-Arbeitslösung, kurz bevor Sie sie der Probe hinzufügen. Schütze tEr lösung aus licht
  8. Vorbereitung der Anti-Human-CD107a (LAMP1) -PE-Antikörper / Permeabilisierungspuffer-Arbeitslösung durch Zugabe von 25 μl anti-CD107a (LAMP1) -PE zu 475 μl des in Schritt 4.4 hergestellten Permeabilisierungspuffers. Stellen Sie sicher, dass die endgültige Antikörperkonzentration 21 μg / ml beträgt.
    HINWEIS: Machen Sie die Antikörper-Permeabilisierungspuffer-Arbeitslösung, kurz bevor Sie sie der Probe hinzufügen. Schützen Sie die Lösung vor Licht.
  9. Vorbereitung von 10x DAPI-Kernflecken durch Zugabe von 4 μl 5 mg / ml DAPI und 100 μl 10% Triton X-100 auf 896 μl 1x PBS.

5. Etikettierung der Jurkat-Zellen mit LC3, LAMP1 und p62

  1. Entfernen Sie 2 x 10 6 Zellen pro Probe (zählen Sie die Zellen wie in Schritt 2.2). Legen Sie jede Probe in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen, das mit dem entsprechenden Probennamen ( dh Kontrolle, Kontrolle + Chloroquin, verhungert oder verhungert + Chloroquin) markiert wurde.
    1. Waschpuffer hinzufügen, damit ich dort binEin Gesamtvolumen von 15 ml in jedem 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Die Proben bei 250 xg für 10 min zentrifugieren. Absaugen Sie den Überstand ab.
  2. Füge 100 μl 4% Formalin-Fixierungslösung zu jedem der Zellpellets hinzu. Resuspend durch Pipettieren auf und ab mit einer P200 Pipette. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Während des Fixierungsschrittes die Proben auf markierte, silikonisierte Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen übertragen.
    HINWEIS: Die Zellen nicht überfixieren; Dies könnte zu schlechten Beschriftungsergebnissen führen.
  3. Nach dem 10-minütigen Fixierungsschritt 1 ml Waschpuffer zu jeder Probe geben. Pipette auf und ab mit einer P1000 Pipette, um die Probe zu mischen. Zentrifuge bei 250 xg für 5 min. Absaugen Sie den Überstand ab.
  4. Füge 100 μl anti-SQSTM1 / p62 - AF488 Antikörper / Permeabilisierungspuffer Arbeitslösung zu jeder Probe hinzu. Resuspend durch Pipettieren auf und ab mit einer P200 Pipette. Inkubieren für 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur.
  5. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1 mlPermeabilisierungspuffer für jede Probe. Pipette auf und ab mit einer P1000 Pipette, um die Probe zu mischen. Zentrifuge bei 250 xg für 5 min. Absaugen Sie den Überstand ab.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 5.4-5.5 für jede der Antikörper-Arbeitslösungen.
    HINWEIS: Die Antikörper-Arbeitslösungen sind Maus-Anti-LC3 / Permeabilisierungspuffer Arbeitslösung, Esel Anti-Maus - AF647 / Permeabilisierungspuffer Arbeitslösung und Anti-Human CD107a (LAMP1) - PE Antikörper / Permeabilisierungspuffer Arbeitslösung. Jeder Antikörper sollte separat und in der aufgeführten Reihenfolge durchgeführt werden. Die Reihenfolge wurde gewählt, um unerwünschte Kreuzreaktivität zwischen Antikörpern zu minimieren.
  7. 100 μl 1% Formalinlösung zugeben. Resuspend durch Pipettieren auf und ab mit einer P200 Pipette. Füge 10 μl des 10x DAPI-Kernflecks zu jeder Probe hinzu. Die Probe wird vorsichtig verwirbelt. Inkubieren für 10 min im Dunkeln bei Raumtemperatur vor dem Ausführen einer der Proben auf dem Instrument.
    HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt kann die Probe entweder bSie laufen auf dem MIFC oder gespeichert vor Licht bei 2-8 ° C für bis zu einer Woche.

6. Etikettierung von Einfarben-Kontrollen

  1. Für jede einfarbige Kontrolle ( dh AF488, PE, AF647 und DAPI) nehmen Sie 1 x 10 6 Jurkat-Zellen, die aus einer der Probenpopulationen stammen können. 1 x 10 6 Zellen in 15 ml Zentrifugenröhrchen geben, die entweder als AF488, PE, AF647 oder DAPI markiert sind.
  2. Addieren Sie Waschpuffer, so dass es ein Gesamtvolumen von 15 ml in jedem 15 ml Zentrifugenröhrchen gibt. Die Proben bei 250 xg für 10 min zentrifugieren. Absaugen Sie den Überstand ab.
  3. Füge 100 μl Waschpuffer den AF488-, PE- und AF647-Röhrchen zu.
    HINWEIS: Für die DAPI-Röhre gehen Sie zu Schritt 6.8.
    1. Resuspend durch Pipettieren auf und ab mit einer P200 Pipette. Überführung in 1,5-ml-Röhrchen.
  4. Füge 5 μl entweder anti-CD45-AF488, anti-CD45-PE oder anti-CD45-AF647 zu den AF488-, PE- bzw. AF647-Röhrchen hinzu. Mischen durch Vortexen lIghtly
  5. Inkubieren Sie die Röhren von AF488, PE und AF647 für 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Andere Marker können verwendet werden, wie LC3, p62 und LAMP-1 Antikörper anstelle von anti-CD45 Antikörpern. CD45 ist jedoch ein zuverlässiger Marker für einfarbige Kontrollen.
  6. Waschen Sie die AF488-, PE- und AF647-Zellen durch Zugabe von 1 ml Waschpuffer zu jeder Probe.
    1. Pipette auf und ab mit einer P1000 Pipette, um die Probe zu mischen. Zentrifuge bei 250 xg für 5 min. Absaugen Sie den Überstand ab.
  7. 100 μl 1% Formalinlösung zugeben. Resuspend durch Pipettieren auf und ab mit einer P200 Pipette.
    HINWEIS: An dieser Stelle kann die Probe entweder auf dem MIFC betrieben oder bis zu einer Woche bei 2-8 ° C vor Licht geschützt geschützt werden.
  8. Füge 100 μl 1% Formalin-Fixierungslösung zum DAPI-Röhrchen hinzu.
    1. Resuspend durch Pipettieren auf und ab mit einer P200 Pipette. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    2. Füge 10 hinzu1; L von 10x DAPI-Kernflecken zur DAPI-Probe. Leicht vortexen, um zu mischen. Inkubieren für 10 min im Dunkeln bei Raumtemperatur vor dem Laufen auf dem Instrument.
      HINWEIS: An dieser Stelle kann die Probe entweder auf dem MIFC betrieben oder bis zu einer Woche bei 2-8 ° C vor Licht geschützt geschützt werden.

7. MIFC starten und kalibrieren

  1. Überprüfen Sie, ob die Mantel-, Systemkalibrierungsreagenz (siehe Tabelle der Materialien ), Debubbler-, Reinigungs- und Sterilisatorbehälter voll sind und der Abfallbehälter leer ist. Wenn nicht, füllen Sie die Behälter und entleeren Sie den Abfalltank.
  2. Schalten Sie das System ein und doppelklicken Sie auf die Software (siehe Tabelle des Materials s), um die Anwendung zu starten. Damit wird die MIFC-Software gestartet.
  3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Startup und stellen Sie sicher, dass Start alle Kalibrierungen und Tests ausgewählt ist. Dies wird spülen das System, Last Hülle, System Kalibrierung Reagenz,Und kalibriere das System.

8. Ausführen der Samples und Single-Color-Controls auf dem MIFC

  1. Laden Sie die Standardvorlage, indem Sie auf die Registerkarte Datei klicken und Load Default Template auswählen.
    HINWEIS: Die Standardvorlage enthält die rohen Maximalpixelpunktplots.
  2. Schalten Sie die 488 nm, 405 nm, 642 nm und SSC Laser ein, indem Sie auf ihre entsprechenden Schaltflächen klicken. Stellen Sie die Laserleistung ein, indem Sie die gewünschte Leistung neben jeder Lasertaste eingeben. Siehe Abbildung 1 .
    HINWEIS: Für dieses Experiment sind die Laserleistungen 200 mW, 20 mW, 150 mW und 5 mW (Ch06) für die 488 nm, 405 nm, 642 nm bzw. SSC. Die MIFC-Standardvorlagenvergrößerung, die auf 40X eingestellt ist, ist die Standardempfindlichkeit Hallo und alle Kanäle sind aktiviert.
  3. Vergewissern Sie sich, dass der Vergrößerungsregler auf 40X eingestellt ist, der Hochempfindlichkeitsmodus ausgewählt ist und alle Kanäle in der Bildergalerie angezeigt werden. Abbildung 1 zeigt die in diesem Experiment verwendeten Instrumenteneinstellungen.
  4. Laden Sie die Probe "Starved + Chloroquine", indem Sie auf den Load Button klicken und das 1,5 mL Röhrchen auf das Instrument legen.
    HINWEIS: Diese experimentelle Probe sollte das höchste Signal aller Proben für AF488, PE und AF647 haben (das DAPI-Signal sollte für alle experimentellen Proben, einschließlich der "Starved + Chloroquine" -Probe, annähernd die gleiche Signalstärke aufweisen.
  5. Verwenden Sie die "Starved + Chloroquine" Probe, um zu bestätigen, dass die entsprechenden Laserleistungen für die 488 nm, 405 nm, 642 nm und SSC Laser eingestellt sind. Verwenden Sie die Roh-Max-Pixeldot-Plots aus der Standard-Vorlage, um die Laser-Powers so einzustellen, dass die Signale stark sind, aber nicht einen Roh-Max-Pixel-Wert von 4,096 erreichen, was die CCD-Kamera auf dem Instrument sättigen würde. Verwenden Sie diese Lasereinstellung für alle experimentellen Proben.
  6. Klicken Sie auf das Symbol Dot Plots erstellen, um ein neues Punktdiagramm zu erstellen. Wählen Sie "Area_M01 "auf der X-Achse und" Aspect Ratio_M01 "auf der Y-Achse für die" Alle "-Population Klicken Sie auf das Symbol Polygon-Region erstellen und zeichnen Sie eine Region um die Zellen.
    HINWEIS: Benutzer können zusätzliche Plots und Regionen hinzufügen, um die gesammelten Zellen zu verkleinern. Ein gemeinsames zusätzliches Diagramm, das hinzugefügt wird, wäre Gradient RMS, um Zellen zu identifizieren, die im Fokus sind.
  7. Stellen Sie die Erfassungsparameter ein. Geben Sie den Dateinamen und den Zielordner an, ändern Sie die Anzahl der Ereignisse auf "5.000" und wählen Sie die "Zelle" Sammlungspopulation. Klicken Sie auf die Schaltfläche Acquire , um die Datei zu erwerben. Nachdem Sie die Datei gesammelt haben, geben Sie das Beispiel zurück, indem Sie auf die Schaltfläche Zurück klicken. Das Probenröhrchen aus dem Gerät nehmen.
  8. Für die nächsten drei Samples ("Starved", "Control" und "Control + Chloroquine") laden Sie das Sample, geben Sie den Sample-Namen ein, erwerben Sie das Sample und geben Sie das Sample mit den gleichen Einstellungen zurückFür die "Starved + Chloroquine" Probe, oben.
  9. Nachdem die Proben erfasst wurden, führen Sie die einfarbigen Kontrollproben aus und erfassen Daten, so dass eine Kompensationsmatrix erstellt werden kann. Schalten Sie den SSC-Laser aus, indem Sie auf die SSC- Taste klicken. Schalten Sie die Hellfeldkanäle aus, indem Sie auf die Schaltfläche Brightfield klicken und auf OFF klicken.
    HINWEIS: Wenn Kanäle aus der Bildgalerie zur experimentellen Probenerfassung entfernt wurden, können alle Kanäle wieder aktiviert werden. Alternativ können Einfarben-Steuerelemente durch Anklicken der Registerkarte Kompensation und Auswahl von Matrix erhalten werden . Dies öffnet den Kompensations-Assistenten, der durch den Schritt des Sammelns von Dateien gehen und eine Kompensationsmatrix machen wird.
  10. Laden Sie das DAPI-Einfarben-Steuerelement, indem Sie auf die Schaltfläche Laden klicken und das 1,5-ml-Röhrchen in das Instrument laden. Geben Sie den Stichprobennamen (nur DAPI) ein, setzen Sie die Sammelpopulation auf "Alle" und ändern Sie die Anzahl der EreignisseS zu "500".
    1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Acquire , um die einfarbige Steuerdatei zu erwerben.
    2. Wenn die Dateisammlung abgeschlossen ist, geben Sie das Beispiel zurück, indem Sie auf die Schaltfläche Zurück klicken. Das Probenröhrchen aus dem Gerät nehmen.
    3. Nach der DAPI-Probe laden Sie 10% Bleichmittel wie ein Beispiel, indem Sie auf die Load- Taste klicken und 100 μl 10% Bleichmittel in ein 1,5 mL Röhrchen geben. Lassen Sie die Probe für ~ 15 s laufen. Dadurch wird jeglicher Rest-DAPI aus der Röhre entfernt.
    4. Führen Sie 100 μl 1x PBS, wie in 8.10.3 durchgeführt, um die restliche 10% Bleiche zu entfernen. Das Gerät ist nun bereit, die AF488-, PE- und AF647-Einfarben-Bedienelemente auszuführen.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 8.10-8.10.2 für jede der einfarbigen Bedienelemente ( dh AF488, PE und AF647).
      HINWEIS: Es besteht keine Notwendigkeit, 10% Bleichmittel oder PBS zwischen diesen Proben zu laufen, nur nach dem DAPI Einfarbenkontrolle.

9. Datenanalyse im MIFC AnAlse Software

  1. Starten Sie die MIFC-Analyse-Software (siehe Tabelle der Materialien ).
  2. Klicken Sie auf Start Analysis , um den Open File Wizard zu starten. Wählen Sie die zu öffnende Datendatei aus, indem Sie auf die "Starved + Chloroquine" Rohbilddatei (.rif) klicken. Wählen Sie die Datei aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Öffnen . Klicken Sie auf Weiter .
    1. Schadenersatz anwenden Wählen Sie eine zuvor erstellte Kompensationsmatrix aus und klicken Sie auf Weiter . Alternativ können Sie eine neue Kompensationsmatrix erstellen, indem Sie auf die Schaltfläche Neue Matrix klicken.
      HINWEIS: Die Schritte 9.2.1.1-9.2.1.2 sind die Schritte, um eine neue Matrix zu erstellen.
      1. Fügen Sie die einfarbigen Kontrolldateien (dh DAPI nur, AF488 nur, PE nur, und AF647 nur) an die Steuerdateien Liste , indem Sie auf Dateien hinzufügen, die Auswahl der Dateien, und klicken Sie auf die Schaltfläche öffnen. Klicken Sie auf Weiter .
      2. Das Fenster " Kompensationsmatrix erstellen" erscheint für dieses Experiment. EnsurE, dass Ch02, Ch03, Ch07 und Ch11 ausgewählt sind und klicken Sie auf Weiter . Die Kompensationsmatrix wird erstellt. Klicken Sie auf Fertig stellen , um die Kompensationsmatrix zu speichern. Fügen Sie die Kompensationsdatei dem Assistenten zum Öffnen der Datei hinzu, und klicken Sie auf Weiter .
    2. Wenden Sie die Analysevorlage an. In diesem Stadium gibt es keine Analyseschablone anzuwenden, also klicken Sie auf Weiter .
      HINWEIS: Für die anderen experimentellen Dateien kann diese "Starved + Chloroquine.daf" Datei als Vorlage verwendet werden.
    3. Benennen Sie die Datei (die Dateinamen, die den "rif" Namen entsprechen, werden automatisch generiert) und klicken Sie auf Weiter . Stellen Sie die Bildanzeigeeigenschaften ein, indem Sie die Kanäle "02", "03", "07" und "11" auswählen. Kanäle 01, 06 und 09 sind vorgewählt. Klicken Sie auf Weiter .
  3. Am Ende des Open File Wizard wählen Sie den Apoptose Wizard . Klicken Sie auf das Symbol des Apoptose-Assistenten und dann aufKlicken Sie auf die Schaltfläche zum Auswählen des Assistenten , um den Apoptose-Assistenten zu öffnen.
    1. Wählen Sie den Kernbildkanal (Ch07) und klicken Sie auf Weiter . Tor die Zellen im besten Fokus. Klicken Sie auf das Symbol "Zeilenregion erstellen" und zeichnen Sie eine Region auf dem Farbverlauf RMS_M01_Ch01 von 60-90. Benennen Sie diese Region "Fokus", klicken Sie auf OK und klicken Sie auf Weiter .
    2. Tor die einzelnen Zellen. Klicken Sie auf das Symbol Polygonbereich erstellen . Zeichnen Sie eine Region um die einzelnen Zellen, nennen Sie die Region "Single", klicken Sie auf OK und klicken Sie auf Weiter . Klicken Sie auf Nein für "Möchten Sie Subpopulationen analysieren?"
    3. Tor die kernhaltigen Zellen. Klicken Sie auf das Symbol "Zeilenregion erstellen" und zeichnen Sie eine Region, die alle nukleierten Zellen enthält. Nennen Sie die Region "Nukleiert". Klicken Sie auf OK und Weiter .
    4. Tor die apoptotischen Zellen. Klicken Sie auf das Symbol Polygonbereich erstellen . Zeichne eine Region um die apoptotischen Zellen; Das sind ZellenMit niedrigem nuklearen Area_T50% und hohem Hellfeldkontrast. Klicken Sie auf Fertig stellen . Fügen Sie eine zweite Region hinzu, indem Sie auf das Symbol Polygonregion erstellen klicken und eine Region um die nicht-apoptotischen Zellen zeichnen. Nennen Sie diese Region "Zellen".
  4. Wählen Sie Zellen aus, die für LAMP1, p62 und LC3 positiv sind. Klicken Sie auf das Symbol Bausteine , wählen Sie Fluoreszenz Positiv - Eine Farbe , und wählen Sie die "Zellen" Bevölkerung und Intensity_MC_Ch03 . Beschriften Sie die X-Achse "Intensity LAMP1". Zeichnen Sie eine Region, die Zellen mit Intensitäten von mehr als 10.000 enthält, indem Sie auf das Symbol "Zeilenregion erstellen" klicken und die Region zeichnen. Beschriften Sie diese Region "LAMP1 +". Befolgen Sie die gleichen Schritte wie in 9.4, um Zellen positiv für p62 und LC3 auszuwählen.
    1. Für p62 + wählen Sie die "LAMP1 +" Bevölkerung und Intensity_MC_Ch02 . Markieren Sie die X-Achse "Intensität p62" und die Region der p62 + Zellen "LAMP1 + / p62 +".; Für die LC3 + wählen Sie die "LAMP1 + / p62 +" Bevölkerung und Intensity_MC_Ch11. Markieren Sie die X-Achse "Intensity LC3" und die Region der LC3 + Zellen "LAMP1 + / p62 + / LC3 +". Verwenden Sie diese "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" Bevölkerung für den Rest der Analyse.
  5. Erstellen Sie eine Spot-Zählfunktion, um die LC3-Spots zu zählen.
    HINWEIS: Dies sollte mit der "Starved + Chloroquine" Probe erstellt werden.
    1. Klicken Sie auf die Registerkarte Analyse und wählen Sie Maske . Klicken Sie auf die Schaltfläche Neu und dann auf die Schaltfläche Funktion . Wählen Sie unter Funktion die Option Peak aus . Maske , wählen Sie M11 ; Und Kanal , wählen Sie Ch11 . Setzen Sie die Spot-to-Cell-Hintergrund-Verhältnis auf 4 . Klicken Sie auf OK , um die Maske Funktionsfenster und OK definieren schließen Sie es an die Maske Liste hinzuzufügen. Klicken Sie auf Schließen , um den Masken-Manager zu beenden .
    2. Klicken Sie auf die Registerkarte Analyse und wählen Sie Eigenschaften. Klicken Sie auf die Schaltfläche Neu . Wählen Sie unter Feature Type aus Spot Count und unter Maske , wählen Sie Peak (M11, Ch11, Hell, 4). Geben Sie "Spot Count LC3" für den Namen ein und klicken Sie auf OK und schließen , um den Feature Manager zu beenden.
      HINWEIS: Der Spot- Assistent kann auch verwendet werden, um eine Spot-Zählfunktion zu erstellen. Das in diesem Experiment verwendete Punktzählungsmerkmal ist möglicherweise nicht für andere Experimente und / oder Zelllinien geeignet. Der Benutzer sollte bei der Entscheidung über eine Maske / Funktion für einen bestimmten Datensatz mehrere Spot-Count-Masken / Features testen. Pugsley 2017 hat weitere Details zur Punktzählung mit der MIFC-Analysesoftware 26 .
    3. Klicken Sie auf das Symbol Neues Histogramm . Wählen Sie die "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" Bevölkerung. Wählen Sie die Spot Count LC3-Funktion und klicken Sie auf OK .
  6. Erstellen Sie die BDC3-Funktion.
    1. CLege die Registerkarte Analyse und wähle Features . Klicken Sie auf die Schaltfläche Neu . Wählen Sie unter Feature Type die Option Bright Detail Colocalization 3 aus . Maske , wählen Sie MC ; Bild 1 , wählen Sie Ch02 (p62); Bild 2 , wählen Sie Ch03 (LAMP1); Und ich mage 3 , wähle Ch11 (LC3). Geben Sie "BDC3 p62 / LAMP1 / LC3" für den Namen ein und klicken Sie auf OK und schließen , um das zu verlassen Feature Manager .
    2. Klicken Sie auf das Symbol Neues Histogramm . Wählen Sie die "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" Bevölkerung. Wählen Sie die Funktion BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 und klicken Sie auf OK .
  7. Klicken Sie auf das neue Scatterplot- Symbol. Wählen Sie die "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" Bevölkerung. Wählen Sie BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 für die X-Achse. Wählen Sie die Spot Count LC3- Funktion für die Y-Achse. Klicken Sie auf OK .
  8. Sparen Sie thE "Starved + Chloroquine" -Datei. Klicken Sie auf Datei und wählen Sie Datenanalyse speichern (.daf) . Klicken Sie auf Speichern und Ja , um die vorherige Version der Datei zu ersetzen. Diese Datei kann nun als Vorlage verwendet werden.
  9. Öffnen Sie die "Control" Datei. Klicken Sie auf Datei und dann auf Öffnen . Wählen Sie die Datei "Control.rif" und klicken Sie auf Öffnen . Wählen Sie die Kompensationsmatrix aus Schritt 9.2.1 und die Datei "Starved + Chloroquine.daf" als Vorlage aus. Klicken Sie auf OK .
  10. Erstellen Sie Regionen für Autophagosomen Akkumulation und Autolysosomen Akkumulation mit der "Control" Probe, um die Regionen zu setzen.
    1. Klicken Sie auf das Symbol Rectangle Region erstellen . Zeichne einen Bereich von X-Koordinaten von -0,1 bis 3 und Y-Koordinaten von 1,5 bis -0,3. Nennen Sie diese Region "Low Spots". Klicken Sie auf Rechteck- Symbol erstellen . Zeichne eine Region von X-Koordinaten von -0,1 bis 1 und Y-KoordinatVon 17,5 bis 1,5. Nennen Sie diese Region "High Spot / Low BDC3".
    2. Klicken Sie auf das Symbol Rectangle Region erstellen. Zeichne eine Region von X-Koordinaten von 1 bis 3 und Y-Koordinaten von 17,5 bis 1,5. Nennen Sie diese Region "High Spots / High BDC3".
  11. Speichern Sie die Datei "Control". Klicken Sie auf Datei und wählen Sie Datenanalyse speichern (.daf ) . Klicken Sie auf Speichern und Ja , um die vorherige Version der Datei zu ersetzen. Diese Datei kann nun als Vorlage verwendet werden.
  12. Öffnen Sie die Datei "Control + Chloroquine", indem Sie auf Datei klicken und dann auf Öffnen klicken. Wählen Sie die Datei "Control + Chloroquine.rif" und klicken Sie auf Öffnen . Wählen Sie die Kompensationsmatrix aus Schritt 9.2.1 und die Datei "Control.daf" als Vorlage aus. Klicken Sie auf OK . Wiederholen Sie dies für die "Starved" und "Starved + Chloroquine" Dateien.
    HINWEIS: Die Batch-Funktion in der Analysesoftware kann auch verwendet werden, um die Kompensation anzuwendenMatrix und / oder Vorlage zu den anderen Dateien. Die endgültige Gating-Strategie ist in Abbildung 2 dargestellt .

Ergebnisse

Diese Analysemethode verwendet mehrere Merkmale, um den autophagischen Fluss zu bekämpfen. Um die endgültige bivariate Handlung vollständig zu verstehen, müssen zunächst die einzelnen Analysemerkmale untersucht werden. Das Zählen von Autophagosomen ist ein logischer Weg, um Autophagie zu messen; Allerdings kann die Größe / Form / Helligkeit von LC3 puncta drastisch zwischen den Zellen variieren. Variation kann es schwierig machen, Autophagosomen manuell zu zählen oder eine Spot-Zählfunktion in der Analysesoftware zu verwenden. Daher ist kein Punktzähler-Feature perfekt aufgrund dieser großen Variabilität in Autophagosomen. Jedoch wird ein gutes Punktzählungsmerkmal an den meisten Zellen arbeiten 26 . Abbildung 3 zeigt Beispiele für die Punktmaskierung von LC3-Puncta in Jurkat-Zellen mit verschiedenen Spotmasken. Die für diesen Datensatz ausgewählte Spot-Count-Funktion ist Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4, was bedeutet, dass die Spot-Zähl-Funktion die Spots gezählt hatAk-Maske (M11) auf Kanal 11 (Ch11-LC3-AF647) mit einem Punkt-zu-Zellen-Hintergrundverhältnis von 4 (Bright, 4) identifiziert. Fig. 4 zeigt Spot-Zähl-Histogramme und repräsentative Bilder für die mittlere Spotzahl für die mit Anti-LC3-AF647 markierten Kontroll-, Kontroll- + Chloroquin-, verhungerten und verhungerten + Chloroquin-Jurkat-Zellen. Die Kontrolle und die verhungerten Mittelpunkte sind nicht signifikant unterschiedlich; Bei der Zugabe von Chloroquin gibt es einen großen Unterschied im Mittel der Kontrolle + Chloroquin im Vergleich zu dem Starved + Chloroquin.

Die nächste zu untersuchende Funktion ist BDC3. BDC3 ist ein Maß für die Co-Lokalisierung von drei Markern / Sonden, in diesem Fall LC3, p62 und LAMP1. Abbildung 5A - 5D zeigt BDC3-Histogramme für die mit Anti-p62-AF488 markierten Kontroll-, Kontroll- + Chloroquin-, verhungerten und verhungerten + Chloroquin-Jurkat-Zellen, Anti-LAMP1-PE und Anti-LC3-AF647. Es gibt eine Verschiebung zwischen dem Kontrollmittel zum verhungerten Mittelwert, sowie die Kontrolle + Chloroquin bedeutet für das Starved + Chloroquin-Mittel. Wenn man jedoch die Bilder von Zellen aus den mittleren BDC3-Scores in Abbildung 5E- 5H betrachtet , gibt es einen größeren Unterschied zwischen den Proben, als die Histogramme einen zu glauben führen können. Dies ist, weil BDC3 nicht die Anzahl der Autophagie Organellen, die co-lokalisieren, was zu einem großen Maß an Variabilität in der Anzahl der Autophagosomen für die gleiche BDC3-Score. In den meisten Fällen gibt es eine Überlappung zwischen allen drei Sonden, da auch in Basalstufen p62, LAMP1 und LC3 bis zu einem gewissen Grad in ähnlichen Bereichen in den Zellen co-lokalisieren oder sich befinden sollen. Als Kontrast kann ein Beispiel für drei Sonden, die nicht ko-lokalisieren sollten, anti-p62-AF488, anti-LC3-AF647 und DAPI-Kernfarbstoff für die Starved + Chloroquine-Probe, wie in Abbildung 6 gezeigt/ P>

Wenn das Spot-Zählmerkmal und die BDC3-Funktion kombiniert werden, ist das Vorhandensein unterschiedlicher Subpopulationen, die die Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen den verschiedenen Proben / Bedingungen verbessern, offensichtlich. Abbildung 7 zeigt die bivariate Darstellung der Spotzahl von LC3 gegenüber BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 für die vier Proben: Kontrolle, Kontrolle + Chloroquin, verhungert und verhungert + Chloroquin. Die Kontrollprobe wurde verwendet, um die Gating-Strategie für drei Populationen festzulegen: Low Spots, High Spots / Low BDC3 und High Spots / High BDC3. Die Kontrollproben zeigten, dass mehr als 98% der Zellen 1 oder weniger Flecken hatten. Die Grenze zwischen den High Spots / Low BDC3 und High Spots / High BDC3 wurde auf einen BDC3 Score von 1 gesetzt, da mehr als 91% der Control Probe einen BDC3 Score von weniger als 1 hatten. Eine Zusammenfassung der Ergebnisse für die bivariate Plots Ist in Tabelle 1 dargestellt .

Alter = "1"> figure-results-1
Abbildung 1: Einstellung des MIFC-Geräts. Ein Screenshot der MIFC-Instrumenteneinstellungen, die für dieses Experiment verwendet wurden, in Schritt 8 des Protokolls skizziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2: Analyse-Software-Gating-Strategie. Ein Screenshot der Analyse-Software-Gating-Schema, skizziert in Schritt 9 des Protokolls. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Fig3.jpg "/>
Abbildung 3: LC3-Spot-Maskierung. Jurkat Zelle Bilder und Masken verwendet, um die Spot-Zähl-Feature zu erstellen. Gezeigt sind BrightField (BF), LC3-AF647, Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 2), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647) , Bright, 5), Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 5,3,1) und Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 6,2,1). Die Maske, die am besten für alle gezeigten Zellen funktionierte, war Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

figure-results-3
Abbildung 4: LC3-Spot-Count-Histogramme. Verwenden Sie die Spot-Count-Funktion Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4 und die LC3-AF647 Spot-Zähler-Histogramme für Control ( A , hellblau), Control + ChloroquinE ( B , blau), verhungert ( C , rosa) und verhungert + Chloroquin ( D , rot). Der mittlere Punkt zählt für Kontrolle, Kontrolle + Chloroquin, verhungert und verhungert + Chloroquin sind 0,07, 1,13, 0,10 bzw. 2,77. BF, LC3-AF647 (rot), DAPI-Kernfarbstoff (blau) und ein Komposit der LC3-AF647- und DAPI-Bilder von repräsentativen Zellen für die mittlere Punktzahl sind für die Kontrolle ( E , 0-Punkte), Control + Chloroquin ( F , 1 Stelle), Starved ( G , 0 Spots) und Starved + Chloroquine ( H , 3 Spots). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

figure-results-4
Abbildung 5: BDC3 Histogramme von p62 / LAMP1 / LC3. BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 Histogramme fürR Kontrolle ( A , hellblau), Kontrolle + Chloroquin ( B , Blau), Verhungert ( C , Rosa) und Starved + Chloroquin ( D , Rot). Die mittlere BDC3-Punktzahl für Kontrolle, Kontrolle + Chloroquin, Starved und Starved + Chloroquin beträgt 0,57, 0,82, 0,74 bzw. 0,98. BF; P62-AF488 (grün); LAMP1-PE (gelb); LC3-AF647 (rot); Und ein Composite der p62-AF488-, LAMP1-PE- und LC3-AF647-Bilder von repräsentativen Zellen für den mittleren BDC3 sind für die Kontrolle ( E ), Control + Chloroquin ( F ), Starved ( G ) und Starved + Chloroquin ( H ). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

figure-results-5
Abbildung 6: BDC3 Histogramme von p62 / LC3 / DAPI für die Starved + Chloroquine Probe. ( A ) BDC3 p62 / LC3 / DAPI-Histogramm für die Starved + Chloroquin-Probe wird gezeigt. Die mittlere BDC3-Punktzahl beträgt 0,07. ( B ) BF; P62-AF488 (grün); LC3-AF647 (rot); DAPI (blau); Und ein Komposit der p62-AF488-, LC3-AF647- und DAPI-Bilder von repräsentativen Zellen für den mittleren BDC3 ist für die Starved + Chloroquin-Probe gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

figure-results-6
Abbildung 7: Bivariate Plots von LC3 Spot Count gegen BDC3 p62 / LAMP1 / LC3. ( A ) Bivariate Plots der LC3-Spotzahl gegenüber BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 für Control, Control + Chloroquine, Starved und Starved + Chloroquine Jurkat-Zellen. ( B ) BF; P62-AF488 (Grün); LAMP1-PE (gelb); LC3-AF647 (rot); Und ein Verbund der p62-AF488-, LAMP1-PE- und LC3-AF647-Bilder aus drei Regionen ( dh Low Spots, High Spots / Low BDC3 und High Spots / High BDC3) sind für die Starved + Chloroquine-Probe gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Anzahl der Zellen Helles Detail Kolokalisierung 3 Mittelwert Spot Count LC3 Mittler % Niedriger Punkt % High Spot / Low BDC3 % High Spot / High BDC3
Steuern 439 0,57 0,07 98.2 1.8 0,0
Kontrolle + Chloroquin 1432 0,82 1.13 68,9 19.5 11.7
Verhungert 1204 0,74 0.10 98.4 0,6 1,0
Verhungert + Chloroquin 1811 0,98 2.77 32.1 36,9 31.0

Tabelle 1: Zusammenfassung der Jurkat LC3 Spotzählung gegenüber BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 Bivariate Plot

Diskussion

Bei der Durchführung dieser Analyse gibt es ein paar Dinge zu beachten. Es ist wichtig, entsprechende Kontrollproben zu haben. Für dieses Experiment wurden zwei verschiedene Kontrollen verwendet: Kontrolle und Kontrolle + Chloroquin. Die Kontrollprobe wurde verwendet, um die Schwelle für die Regionen festzulegen. Es stellt die Grundstufe der Autophagie dar, ohne den lysosomalen Abbau zu stoppen und ist die Kontrolle für die verstorbene Probe. Allerdings ist die Kontrollprobe keine geeignete Kontrolle, um mit den Ergebnissen der Starved + Chloroquine Probe zu vergleichen, da Chloroquin selbst die Kontrollprobe beeinflusst. Daher war es notwendig, eine Kontrolle + Chloroquin Probe zu haben.

Vor der Durchführung einer Analyse für Autophagie, ist es wichtig, nur analysieren / Gate auf einzelne Zellen, die im Fokus sind ( dh Gradient RMS größer als 60), da die Ergebnisse betroffen sein könnten, wenn es mehr als eine Zelle oder die Bilder sind unscharf. Es ist entscheidend, dass das AutophagosomEs und Lysosomen sind im Fokus für die richtige Punktzählung und BDC3-Analyse. Apoptotische Zellen müssen vor der Autophagie-Analyse entfernt werden, da sie Ergebnisse schneiden können und nicht aufgenommen werden sollten. Es sollte eine angemessene Färbung für alle drei Marker ( dh LC3, p62 und LAMP1) geben. Zum Beispiel sind alle drei Marker intrazellulär und sollten ein punktuelles Signal haben; Wenn das Signal nicht punktiert ist oder ob es sich auf der Oberfläche der Zelle befindet, wäre die Färbung nicht angemessen und das Experiment / Färben sollte erneuert werden. Darüber hinaus, für BDC3 genau zu sein, ist es wichtig, auf Zellen, die hell sind für alle drei fluoreszierenden Marker von Interesse. Gating auf positive Ereignisse ist erforderlich, um die Messung von BDC3 auf unspezifische Bindung, Bildgebung Artefakte und / oder Rauschen zu verhindern. Dies ist entscheidend, da BDC3 potenziell Artefakte verstärken kann, die keine wahren Signale sind. Da BDC3 nur bei hellen positiven Ereignissen durchgeführt werden kann, können viele Zellen nicht in die endgültige Analyse einbezogen werden; Das ist especEcht für Kontrollzellen, die keine Akkumulation von LC3, p62 und / oder LAMP1 haben. Eine Einschränkung dieses Assays besteht also darin, dass BDC3 nur Zellen untersucht, die für alle drei Marker positiv sind, die für alle Autophagieexperimente nicht geeignet sind.

Wie BDS, die bereits gemeldet wurde, 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , BDC3 allein, berücksichtigt nicht die Anzahl der autophagischen Organellen, die sich lokalisieren, was zu einem großen Teil führt Der Variabilität in der Anzahl der Autophagosomen. Daher ist der bivariate Ansatz von Rajan et al. war angestellt. Wenn man die bivariate Plots betrachtet, könnte man fragen, obDie Zellen müssen positiv für LC3, p62 und LAMP1 sein; Warum gibt es so viele Zellen, die 0 Spots haben? Dies liegt daran, dass das LC3-Signal für die Co-Lokalisierung hell genug sein könnte, aber es könnte nicht die von der Peak-Maske eingestellte Schwelle (Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)) erfüllen, die für die Verwendung als a erforderlich ist Stelle.

Das hier vorgestellte Protokoll verwendete MIFC, um LC3 puncta zu zählen und die Co-Lokalisierung von drei Autophagie-Markern zur Messung des autophagischen Flusses. Unter basalen Bedingungen (Kontrollprobe) war die Anzahl der Autophagosomen niedrig, und wenige Zellen wurden mit "High Spots" gefunden. Mit der Zugabe von Chloroquin, das die Autophagosom / Lysosomen-Fusion hemmt, kam es zu einer Erhöhung der Anzahl der LC3-Spots. Da das Lysosom nicht in der Lage ist, das Autophagosom zu brechen und das p62, das im Autophagosom liegt, führt dies zu einer Erhöhung der Co-Lokalisation der LC3-, p62- und LAMP1-Autolysosomen-Akkumulation. Dieser Effekt wurde unter Nährstoff-Starvat verstärktIonen, die Autophagie induziert. Allerdings, ohne die Zugabe von Chloroquin, gab es keine signifikante Erhöhung der Anzahl der Autophagosomen, wahrscheinlich aufgrund einer Erhöhung der Rate der autophagischen Umsatz. Als die Zellen in Gegenwart von Chloroquin verhungert wurden, gab es eine Zunahme der Co-Lokalisierung und Anzahl der Autophagosomen, die die Schlussfolgerung unterstützt, dass der Hunger den autophagischen Fluss erhöht. EBSS ist bekannt als ein leistungsfähiger Induktor der Autophagie. Daher ist zu erwarten, dass die Zunahme groß wäre. Wenn ein anderes Verfahren, wie z. B. Arzneimittelinduktion, verwendet wird, um Autophagie zu induzieren, kann der Unterschied zwischen der Kontrolle und den behandelten Proben subtiler sein.

Dieses spezielle Protokoll wurde entwickelt, um Autophagie in menschlichen Zelllinien zu messen, aber der Assay könnte an andere Spezies angepasst werden, indem er auf Antikörper für diese spezielle Spezies umschaltet. Darüber hinaus könnte die Analyse-Methode für jede intrazelluläre Anwendung, die die Co-Lokalisierung erfordert verwendet werdenVon drei Sonden / Markern.

Offenlegungen

Ich bin bei MilliporeSigma beschäftigt, dem Hersteller der Amnis-Marke ImageStream, die in dieser Studie verwendet wurde.

Danksagungen

Ich möchte meinen Mitarbeitern bei MilliporeSigma, Philip J. Morrissey und Sherree L. Friend, für ihre Unterstützung und Führung im Laufe der Jahre danken. Ich möchte auch Vidya Venkatachalam und Bryan R. Davidson für ihre Hilfe bei der BDC3-Funktion in der IDEAS-Software , Ryan P. Jessup für die Bearbeitung dieses Manuskripts, Raymond Kong für Hilfe am Tag des Schießens und ein besonderes Dankeschön danken Zum Maskenbildner Cynthia Xamonthiene.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
15 mL ZentrifugenröhrchenFalcon352096
50 mL ZentrifugenröhrchenFalcon352070
AF647 beschriftet Esel Anti-Maus - IgG InvitrogenA-31571Esel-Anti-Maus-IgG (H+L) Sekundärantikörper, Alexa Fluor 647. Konzentration: 2 mg/ml. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571
Anti-Human-CD107a-PE (LAMP1)BioLegend328607Klon H4A3. Konzentration 400 &Mikro; g/ml. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html
Anti-Human-CD45- AF488BioLegend304017Klon HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html
Anti-Human-CD45-PE BioLegend304008Klon HI30.  http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html
Anti-Human-CD45-AF647 BioLegend304018Klon HI30.  http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html
Anti-LC3 (Mensch) mAb Klon 4E12MBL International CorporationM152-3Klon 4E+12.  Konzentration 2 mg/ml.  https://www.mblintl.com/products/m152-3
Anti-SQSTM1 / p62 Antikörper [EPR4844] - Autophagosomenmarker (Alexa Fluor 488)abcamab185015Klon EPR4844.  Konzentration 0,5 mg/ml.  http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html
Chloroquindiphosphat SalzSigma-AldrichC6628-25G
Reiniger - Schar Clenz Beckman Coulter8546931Füllen Sie den Behälter mit 200 mL Reiniger. 
https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ DAPI Stain 5 mg/mLMilliporeSigma508741http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741
Debubbler - 70% IsopropanolMilliporeSigma1.3704Behälter mit 200 mL Debubbler füllen.  http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 10xMilliporeSigmaBSS-2010-B  Ca++Mg++ frei 
Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 1xMilliporeSigmaBSS-1006-BPBS Ca++Mg++ frei 
Earle's Balanced Salt Solution 1xGibco14155
Fötales RinderserumHyCloneSH30071.03
Formaldehyd, 10%, methanolfrei, Ultra PurePolysciences, Inc.04018Dies wird für das 4%ige und 1%ige Formalin verwendet. ACHTUNG: Formalin/Formaldehyd giftig beim Einatmen und Verschlucken. Reizt die Augen, die Atemwege und die Haut. Kann durch Einatmen oder Hautkontakt eine Sensibilisierung verursachen. Gefahr schwerer Augenschäden  Potentielle Krebsgefahr. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Hanks' Balanced Salt Solution 1xGibco14175
Jurkat, Klon E6-1 (ATCC TIB-152)ATCCTIB-152https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx
MEM Nicht-essentielle Aminosäuren 100xHyCloneSH30238.01
MIFC - ImageStreamX Mark IIMilliporeSigma100220Einsatz kam eine ImageStreamX Mark II mit 2 Kameras, die mit den Lasern 405nm, 488nm und 642nm ausgestattet waren. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006
MIFC Analysesoftware - IDEAS 6.2MilliporeSigma100220Die Begleitsoftware zum MIFC (ImageStreamX MKII).  IDEAS Version 6.2
MIFC Software - INSPIREMilliporeSigma100220Dies ist die Software, die die MIFC (ImageStreamX MKII) ausführt. INSPIRE Version 200.1.388.0
PE Anti-Human-CD107a (LAMP-1) Antikörper-Klon H4A3BioLegend328608http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html
Penicllin/Streptomycin/Glutamin Lösung 100xHyCloneSV30082.1
Spülung - Reinstwasser oder deionisiertes WasserNANASie können jedes Reinstwasser oder entionisiertes Wasser verwenden. Füllen Sie den Behälter mit 900 mL Spülung.
RPMI-1640 Medium 1xHyCloneSH30027.01
Hülle - PBSMilliporeSigmaBSS-1006-BDies ist das gleiche wie Dulbecco's Phosphate Buffered Kochsalzlösung 1X  Ca++MG++ kostenlos.  Füllen Sie den Behälter mit 900 mL Mantel.
Mikrozentrifugenröhrchen aus silikonisiertem PolypropylenFisherbrand02-681-320Fisherbran Silikonisierte Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Retention 1,5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936
Natriumpyruvatlösung (100 mM)HyCloneSH30239.01
Sterilisator - 0,4 - 0,7 % HypochloritVWRJT9416-1Dies sind grundsätzlich 10% Clorox-Bleichmittel, das durch Entlüren von Clorox-Bleiche mit Wasser hergestellt werden kann. Füllen Sie den Behälter mit 200 mL Sterilisator.
Reagenz für die Systemkalibrierung - SpeedBeadMilliporeSigma400041Jedes Röhrchen fasst ~10 mL.  https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav 
T75 FlascheFalcon353136
TRITON X-100, PROTEIN GRADE Reinigungsmittel, 10% Lösung, steril gefiltertMilliporeSigma648463-50MLhttp://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463
Wasser, Zellkulturqualität HyCloneSH30529.03
Zum

Referenzen

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