Method Article

Isolierung von Zwischenfilamentproteinen aus mehreren Mausgeweben zur Untersuchung von altern-assoziierten posttranslationalen Modifikationen

DOI:

10.3791/55655

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May 18th, 2017

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1Department of Cell Biology and Physiology, School of Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill

In This Article

Summary

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In diesem Verfahren stellen wir biochemische Verfahren zur schnellen und effizienten Isolierung von Zwischenfilament (IF) Proteinen aus mehreren Mausgeweben vor. Isolierte IFs können verwendet werden, um Veränderungen in posttranslationalen Modifikationen durch Massenspektrometrie und andere biochemische Assays zu untersuchen.

Abstract

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Zwischenfilamente (IFs) bilden zusammen mit Aktinfilamenten und Mikrotubuli das Zytoskelett - ein kritisches Strukturelement jeder Zelle. Normal funktionierende IFs liefern Zellen mit mechanischer und Belastungsstabilität, während ein dysfunktionelles IF-Zytoskelett die zelluläre Gesundheit beeinträchtigt und mit vielen menschlichen Krankheiten assoziiert wurde. Posttranslationale Modifikationen (PTMs) kritisieren die IF-Dynamik kritisch als Reaktion auf physiologische Veränderungen und unter Stressbedingungen. Daher kann die Fähigkeit, Änderungen in der PTM-Signatur von IFs zu überwachen, zu einem besseren funktionalen Verständnis und letztlich Konditionierung des IF-Systems als Stress-Responder bei zellulären Verletzungen beitragen. Allerdings ist die große Anzahl von IF-Proteinen, die von über 70 einzelnen Genen codiert und gewebeabhängig ausgedrückt werden, eine große Herausforderung, die relative Bedeutung verschiedener PTMs zu lokalisieren. Zu diesem Zweck werden Methoden, die die Überwachung von PTMs auf IF-Proteinen ermöglichenAuf einer organismusweiten Ebene, anstatt für isolierte Familienmitglieder, kann den Forschungsfortschritt in diesem Bereich beschleunigen. Hier präsentieren wir biochemische Methoden zur Isolierung der gesamten, detergenzlöslichen und detergenzresistenten Fraktion von IF-Proteinen aus 9 verschiedenen Mausgeweben (Gehirn, Herz, Lunge, Leber, Dünndarm, Dickdarm, Bauchspeicheldrüse, Niere und Milz). Wir zeigen weiterhin ein optimiertes Protokoll zur schnellen Isolierung von IF-Proteinen unter Verwendung von Lysing-Matrix und automatisierter Homogenisierung verschiedener Mausgewebe. Das automatisierte Protokoll ist nützlich für die Profilierung von IFs in Experimenten mit hohem Probenvolumen (wie bei Krankheitsmodellen mit mehreren Tieren und experimentellen Gruppen). Die resultierenden Proben können für verschiedene nachgeschaltete Analysen verwendet werden, einschließlich massenspektrometrischer PTM-Profilierung. Unter Verwendung dieser Methoden liefern wir neue Daten, um zu zeigen, dass IF-Proteine ​​in verschiedenen Mausgeweben (Gehirn und Leber) parallele Veränderungen in Bezug auf ihre Expres unterliegenUnd PTMs während des Alterns.

Introduction

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IFs sind eine Familie von Proteinen, die beim Menschen von 73 Genen kodiert und in sechs Haupttypen kategorisiert sind: Die Typen I-IV sind zytoplasmatisch ( zB Epithel- und Haarkeratine (K), Myozyten desmin, Neurofilamente, gliales fibrilläres saures Protein (GFAP), und andere); Typ V sind die nuklearen Lamine; Und Typ VI sind IFs in der Augenlinse 1 . In Bezug auf ihre molekulare organisation haben IF-Proteine ​​drei gemeinsame Domänen: eine hochkonservierte Coiled-Coil-"Stab" -Domäne und globuläre "Head" und "tail" Domains. Wenn Protein-Tetramere zusammengesetzt werden, um kurze Filamentvorläufer zu bilden, die letztlich in reife Filamente eingebaut werden, die dynamische zytoskeletale und nukleoskeletale Strukturen, die an mechanischem Schutz 2 , Stress-Sensing 3 , 4 , Regulierung der Transkription 5 und Wachstum und anderen kritischen zellulären Funktionen beteiligt sind,"> 1 , 6 , 7 .

Die funktionelle Bedeutung des IF-Systems wird durch die Existenz vieler menschlicher Erkrankungen hervorgerufen, die durch Missense-Mutationen in IF-Genen verursacht werden, einschließlich Neuropathien, Myopathien, Hautzerstörungsstörungen, metabolische Dysfunktionen und vorzeitige Alterungssyndrome 8 . Einige IF-Gen-Mutationen verursachen nicht, sondern prädisponieren ihre Träger zur Krankheitsprogression, wie die einfachen epithelialen Keratine in der Lebererkrankung 9 . Letzteres ist auf die kritischen Stress-Schutzfunktionen von IFs in Epithelien zurückzuführen. IFs gehören im Allgemeinen zu den am häufigsten vorkommenden zellulären Proteinen unter basalen Bedingungen, sind aber bei verschiedenen Belastungsarten weiter stark induziert 10 . Zum Beispiel haben neuere Studien, die proteomweite Veränderungen im Nematoden C. elegans untersuchten, gezeigt, dass mehrere IFs hoch hochreguliert und anfällig für Aggregat sindWährend der organisatorischen Alterung 11 , 12 . Da die Aufrechterhaltung einer geeigneten IF-Struktur für die zelluläre Resistenz gegenüber verschiedenen Formen von Stress 10 wesentlich ist, kann die IF-Aggregation auch bei der Alterung zum funktionellen Rückgang beitragen. Allerdings fehlt es an organismalen Studien, die mehrere Säugetier-IF-Proteine ​​über verschiedene Gewebe untersuchen, die sich einer Belastung unterziehen.

IFs sind hochdynamische Strukturen, die sich an zellulare Anforderungen anpassen. Keratine werden beispielsweise einem biosyntheseunabhängigen Zyklus zwischen löslichem (nicht filamentösem) und unlöslichem (filamentösen) Protein-Pool 13 unterzogen. Unter normalen physiologischen Bedingungen kann etwa 5% der gesamte K8 / K18-Pool in reinigungsmittelfreiem Puffer extrahiert werden, im Vergleich zu etwa 20%, der im nichtionischen Detergens Nonidet P-40 solubilisiert werden kann, das biochemisch mit Triton- X100 14 , 15 Während der Mitose gibt es eine bemerkenswerte Erhöhung der Löslichkeit von einfachem Epithel K8 und K18 14 , was bei epidermalen Keratinen weniger offensichtlich ist, aber deutlicher in Vimentin und anderen Typ III IF-Proteinen 15 , 16 ist . Die Löslichkeitseigenschaften von IF-Proteinen werden durch Phosphorylierung, eine Schlüssel-posttranslationale Modifikation (PTM) für die Fadenumlagerung und Löslichkeit 17 , 18 , 19 , 20 , geregelt. Die meisten IFs unterliegen einer umfangreichen Regulierung durch eine Reihe von PTMs an konservierten Standorten, was zu funktionalen Veränderungen führt.

Der Zweck dieser Methode ist es, Ermittler einzuführen, die neu im IF-Feld sind, um biochemische Extraktion und analytische Methoden für die Untersuchung von IF-Proteinen über mehrere Maus-Gewebe. SpezifischWir konzentrieren uns auf die Isolierung von IF-Proteinen unter Verwendung einer Hochsalz-Extraktionsmethode und Bewertung von Veränderungen in PTMs durch Massenspektrometrie und durch PTM-Targeting-Antikörper. Diese Methoden bauen auf den zuvor veröffentlichten Prozeduren 21 auf , umfassen jedoch Modifikationen zum Extrahieren verschiedener IF-Protein-Typen, um einen gemeinsamen Mechanismus für die Regulierung über die IF-Familie aufzudecken. Beispielsweise reguliert die K8-Acetylierung an einem spezifischen Lysinrest die Filamentorganisation, während die Hyperacetylierung die K8-Unlöslichkeit und die Aggregatbildung 22 fördert. Jüngste globale Proteom-Profiling-Studien haben zusätzlich gezeigt, dass die meisten gewebespezifischen IF-Proteine ​​auch Ziele für die Acetylierung sind und dass die meisten IF-Acetylierungsstellen auf die hoch konservierte Stab-Domäne beschränkt sind. Dies unterstreicht die Notwendigkeit von Methoden, die für die globale Profilierung des IF-Systems geeignet sind. Wir führen auch eine schnelle Methode zur Isolierung von IF-Proteinen aus mehreren Geweben mit automatisierter Homogenisierung in opti einGemischte lysing matrix Die resultierenden Präparate eignen sich für die nachgeschaltete PTM-Analyse über Massenspektrometrie und andere Methoden.

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Protocol

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Das Protokoll wird gemäß dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of North Carolina genehmigt und durchgeführt.

1. Vorbereitungen

  1. Triton-X-Puffer (1% Triton X-100, 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) vorbereiten, Volumen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4) aufbringen. Um 500 ml zu ergeben: 5 ml Triton X-100 und 500 mM EDTA in 490 ml PBS, pH 7,4, umrühren. Triton-X-Pufferlösung bei 4 ° C aufbewahren.
  2. Vorbereitung des Salzsalzes (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 140 mM NaCl, 1,5 M KCl, 5 mM EDTA, 0,5% Triton X-100, Volumen in doppelt destilliertem (dd) H 2 O). Zur Herstellung von 500 ml: Rühren Sie 10 ml 0,5 M Tris-HCl (pH 7,6), 14 ml 5 M NaCl, 55,9 g KCl, 5 ml 0,5 M EDTA und 2,5 ml Triton X-100, um das Volumen auf 500 einzustellen Ml mit doppelt destilliertem Wasser). Hochsalzpufferlösung bei 4 ° C aufbewahren.
  3. Vor der Verwendung, ergänzen Sie eine entsprechende Menge an Triton-X und High Salt Buffer ( ZB 1 ml für jede 25 mg Gewebeprobe) mit einem Protease- oder Protease / Phosphatase-Inhibitor-Cocktail und verwerfen jeglichen unbenutzten Puffer, der die Inhibitoren enthält.
  4. Vorbereitung von 5 mM EDTA in 1x PBS, pH 7,4. Um 500 ml zu ergeben: 5 ml 0,5 M EDTA in 495 ml von 1x PBS, pH 7,4, umrühren.
  5. Isoliere verschiedene Mausorgane (Gehirn, Herz, Lunge, Leber, Bauchspeicheldrüse, Dickdarm, Darm, Niere, Milz) unter Verwendung genehmigter Protokolle, die Veterinärrichtlinien und institutionellen Standards entsprechen 23 . Das Gewebsammelverfahren sollte nicht mehr als 5 min dauern, um die RNA- und Proteinintegrität von Protease-reichen Geweben zu bewahren ( z. B. Pankreas sollte zuerst verarbeitet werden).
  6. Schneiden Sie eine kleine Menge an Gewebe (~ 5-20 mg) und legen Sie in RNA-Speicherlösung, für die anschließende RNA-Extraktion, die cDNA-Synthese und die quantitative Echtzeit-PCR-Analyse für die IF-Genexpression. Platzieren Sie RNA-Speicher-Lösungsrohre mit Gewebe bei 4 ° C über Nacht und folgen Sie dem Hersteller-Protokoll für weitere sTorage und isolationsschritte
  7. Den Rest des Gewebes in kleinere Fragmente ( z. B. 0,5 cm) schneiden und in Kryovial stellen. Snap-Freeze und Lagerung von Durchstechflaschen bei -80 ° C oder flüssigem Stickstoff für längerfristige Lagerung.

2. IF Genexpressionsanalyse

  1. Extrahieren Sie RNA aus Geweben, die in dem RNA-Speicherlösungsreagenz konserviert sind. Verwenden Sie eine geeignete / bevorzugte RNA-Extraktionsmethode gemäß dem Protokoll des Herstellers.
  2. Quantifizierung der RNA-Konzentration und Verwendung von 2 μg RNA zur Erzeugung von cDNA unter Verwendung eines geeigneten Reverse Transkriptionskits gemäß Herstellerprotokoll.
  3. Die Verwendung der erzeugten cDNA- und Maus-IF-Gen-spezifischen Primer stellte qPCR-Reaktionen auf, darunter drei technische Replikate jeder Probe sowie eine Blindkontrolle gemäß dem Protokoll des Herstellers.
  4. Quantifizierung der IF-Genexpression als Faltenveränderung, die verschiedene Bedingungen vergleicht ( z. B. junges gegen Altgewebe).

3. P.Reparation von Gesamt-Gewebe-Lysaten für Immunoblot

  1. Homogenisieren Sie 25 mg Gewebe in 1 ml 2x nicht reduzierendem SDS-Probenpuffer. Weichen Bromphenolblau-Farbstoff aus dem Probenpuffer, wenn ein kolorimetrischer Protein-Assay durchgeführt werden soll, um die Proteinkonzentration zu quantifizieren.
  2. Füge 5% (v / v) 2-Mercaptoethanol (2-ME) hinzu, um reduzierte Proben zu machen. Zu 200 & mgr; l der nicht-reduzierenden Proben werden 10 & mgr; l 2-ME gegeben.
  3. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration unter Verwendung von Detergenz- und Reduktionsmittel-kompatiblen Protein-Assay. Wenn der Farbstoff bereits in dem Probenpuffer enthalten ist, kann die Proteinmenge nach dem Laufen eines Gels über eine Anzahl von Techniken, einschließlich des Coomassie-basierten Flecks 24 , geschätzt werden.
  4. Vortex alle Proben und Hitze bei 95 ° C für 5 min.
  5. Führen Sie Western-Blotting unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen. Belichtungsmembran kurz (<1 min), um monomere Spezies zu zeigen, und länger (> 1 min), um hochmolekulare komplexe Komplexe zu enthüllenNg IF-Proteine. Bei der Überwachung der Aggregation, untersucht die gesamte Gel / Membran (einschließlich der Böden der Gel-Wells).
  6. Führen Sie ein paralleles Gel und Fleck mit einem Protein Fleck als Ladesteuerung 24 . Bei Krankheitsmodellen oder Verletzungsversuchen sollte der gesamte Proteinfleck als Ladungskontrolle verwendet werden, im Gegensatz zu Immunoblots für "Housekeeping" Proteine ​​( zB Actin, GAPDH), da diese sich unter verschiedenen Stressbedingungen ändern.

4. Herstellung von Detergenz-löslichen und hochsalzigen Extrakten von tissenspezifischen IFs

  1. Füge 1 ml eiskaltes Triton X-100 Puffer in einen Glasröhrchen-Homogenisator und lege ihn auf Eis.
  2. Entfernen Sie ein kleines Stück Gewebe (~ 25 mg) aus der Flüssigkeits-Stickstoff-Lagerung und legen Sie direkt in den Glas-Homogenisator. Verwenden Sie eine Polytetrafluorethylen-Pistille zu homogenisieren (50 Schläge) und vermeiden, um Blasen. Halten Sie den Homogenisator und lysieren Sie jederzeit kalt.
  3. Übertragen Sie Lysat auf ein 1,5 ml-GemischZentrifugenröhrchen auf Eis zentrifugieren und bei 20.000 xg für 10 min in einer vorgekühlten Zentrifuge (4 ° C) zentrifugieren.
  4. Sammle die überstehende Fraktion in ein separates Röhrchen. Dies ist die Triton-X-lösliche Fraktion, die für die Immunpräzipitation (ip) und die Analyse des Detergens-löslichen Pools von IF-Proteinen verwendet werden kann. Beachten Sie, dass die Schritte 4.1-4.4 wiederholt werden können, um einen saubereren IF-Extrakt aus Hirngewebe zu erreichen.
  5. Füge 1 ml starker Salzpuffer zum Gewebepellet hinzu, transferiere auf einen sauberen Homogenisator und springe 100 Hübe. Übertragen Sie das Homogenat wieder in das Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie das Röhrchen für 1 h auf einen rotierenden Schüttler im kalten Raum.
  6. Die Homogenate bei 20.000 xg für 20 min bei 4 ° C zentrifugieren. Den Überstand verwerfen.
  7. Füge 1 ml eiskaltes PBS / EDTA-Puffer zum Pellet hinzu und homogenisiere das Pellet (20 Hübe) in einem sauberen Homogenisator als Endreinigungsschritt *. Überführung in ein neues Röhrchen und Zentrifugieren bei 20.000 xg für 10 min bei 4 ° C, um das IF-Protein-Reicher Hochsalz-Extrakt (HSE).
    * Gegebenenfalls vortexen statt der Homogenisierung bei diesem Schritt.
  8. Den Überstand verwerfen und die Pellets in 300 μl nicht reduzierendem SDS-Probenpuffer auflösen, der vorgewärmt wurde. Das Pellet zunächst durch Pipettieren und Vortexen auflösen und dann die Proben 5 min bei 95 ° C erhitzen.
  9. Vortex und Pipette nach Bedarf, um sicherzustellen, dass das Pellet aufgelöst wird. Es kann einige Minuten dauern, bis die Pellets vollständig aufgelöst sind.
  10. Alle Proben bei -20 ° C bis zur Analyse aufbewahren.

5. Automatisierte Gewebe-Lyse für IF-Proteinextraktion in Hochvolumen-Experimenten

  1. Zur RNA-Extraktion platzieren Sie Lysepuffer (600 μl Puffer pro 25 mg Gewebe) in ein Röhrchen, das die Lysierungsmatrix D enthält (verwendet kleine Keramikkugeln) und pulsiert für 25 s im Gewebelyser zweimal. Trennen Sie das Lysat aus der Matrix durch Zentrifugation bei 20.000 xg und fahren Sie mit dem nächsten Schritt in Isolation fort.
  2. Zur Proteinextraktion platzieren Sie TritAuf X-100 (oder SDS-Probenpuffer bei der Herstellung von Gesamtlysat) in einem Lysierröhrchen mit Lysing-Matrix SS (verwenden Sie eine einzelne Edelstahlperle). Nach dem Testen mehrerer Matrizen wurde dies ausgewählt, weil es IF-Proteinextrakte produziert, die in ähnlicher Qualität wie die herkömmliche Douncing-Methode sind. Beachten Sie, dass die automatisierte Methode nicht optimal für Bauchspeicheldrüse und Milz ist, und das Standard-Homogenisierungsprotokoll sollte für diese Gewebe verwendet werden.
  3. Um mit der Vorbereitung des Hochsalz-Extraktes fortzufahren, entfernen Sie den Edelstahl-Wulst aus dem Röhrchen mit einem Magneten und zentrifugieren die Röhrchen bei 20.000 xg für 10 min bei 4 ° C.
  4. Fahren Sie mit Schritt 4.4 (oben) des manuellen Protokolls fort.
  5. Alle Proben bei -20 ° C bis zur Analyse aufbewahren.

6. Immun-Anreicherung von posttranslational modifizierten IF-Proteinen

  1. Vorbereitung PBST-Puffer (0,02% Tween-20 in PBS). Um 50 ml zu ergeben, werden 10 & mgr; l Tween-20 bis 50 ml PBS, pH 7,4, zugegeben.
  2. PTM-Antikörper vorbereitenLösung (1-10 μg Antikörper in 200 μl PBST). Im Allgemeinen sind 3 μg Antikörper / Reaktion eine gute Ausgangsbedingung, die bei Bedarf weiter optimiert werden kann.
  3. Für jede Reaktion werden 50 μl magnetische Perlen in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, auf den Magneten gelegt und die Wulstaufbewahrungslösung angesaugt.
  4. Konjugieren Sie die Perlen zum Immunpräzipitations-Antikörper durch erneutes Suspendieren in der Antikörperlösung und inkubieren auf Rotator (End-over-End, um das Mischen von kleinen Volumina zu gewährleisten) bei Raumtemperatur für 20 min.
  5. Legen Sie die Röhrchen auf Magnet und aspirieren Antikörper-Lösung.
  6. Spülen Sie die Antikörper-konjugierten Perlen einmal in 200 μl PBST und entfernen Sie Waschpuffer.
  7. Füge 0,6-1 ml des Gewebslysats zu den Perlen hinzu, mischen durch sanftes Pipettieren und inkubiere für 3 h auf Rotator in einem kalten Raum.
  8. Legen Sie die Röhrchen auf den Magneten, entfernen Sie Lysat und waschen Sie die Perlen fünfmal mit 200 μl PBST. Nach dem letzten Waschschritt sammle die Perlen in 100 _6; L von PBS (kein Tween-20) und Transfer zu einem sauberen neuen Röhrchen. Legen Sie den Schlauch auf den Magneten.
  9. Absaugen des PBS und Zugabe von 100 & mgr; l nicht reduzierendem Probenpuffer. 50 μl entfernen und 2-ME (5%) dazugeben, reduzierende Proben zu machen. Die Proben auf 95 ° C für 5 min erhitzen.
  10. Trennen Sie die IP-Fraktion von den Perlen auf den Magneten und sammeln Sie sie in eine neue Röhre.
  11. Proben bei -20 ° C bis zur Analyse aufbewahren.

7. Herstellung von IF-Proteinproben für die Massenspektrometrie-Analyse

  1. Planen Sie eine Beratung mit einem Proteomik-Experten vor der Einleitung einer Studie, da es erhebliche Zeit und Kosten in der Massenspektrometrie-Analyse beteiligt ist.
  2. Besondere Vorsichtsmaßnahmen treffen, um eine Kontamination zu vermeiden. Behandle alle Gele mit sauberen Handschuhen und inkubiere in sauberen Behältern, nur mit ddH 2 O gewaschen (Seife vermeiden).
  3. Führen Sie 20-50 μl der HSE-Probe (aus den Abschnitten 4 und 5) auf einem SDS-PAGE-Gel gemäß Standardbedingungen aus.
  4. Fleck mit einem Proteinfleck für 1 h. Spülen Sie mehrmals und entfärben Sie in ddH 2 O über Nacht. Die IF-Proteinbanden sollten nach dem Entfärben leicht sichtbar sein.
  5. Legen Sie das Gel zwischen Plastikfolienschützer, scannen Sie und markieren Sie die Bänder, die herausgeschnitten werden und zur Analyse gesendet werden.
  6. Verbrauchen Sie die IF-Proteinbänder mit einem neuen, sauberen Rasiermesser.
  7. Legen Sie die Gelbänder in saubere Mikrozentrifugenröhrchen und übertragen Sie sie in eine Massenspektrometrie.

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Results

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Eine neue Schnellmethode für die hochsalzbasierte Extraktion von IF-Proteinen aus mehreren Mausgeweben mittels Lysing-Matrix.

Die traditionelle Methode 25 , 26 der Isolierung der Masse der Zwischenfilamentproteinfraktion aus Epithelgewebe wurde hier modifiziert, um 9 verschiedene Organe und ein schnelleres Verfahr...

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Discussion

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Methoden, die die biochemische Charakterisierung von IF-Proteinen ermöglichen, können nützlich sein, um zahlreiche pathophysiologische Phänomene in Säugetiersystemen zu verstehen, da IF-Proteine ​​sowohl Marker als auch Modulatoren von Zell- und Gewebedressen sind 29 . Das Prinzip der aktuellen Methode basiert auf den in den 1970er und 1980er Jahren entwickelten Initialverfahren zur Isolierung, Trennung und Rekonstituierung von IF-Proteinen aus Zellen und Geweben, die in der Regel niedrige und ho...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von den NIH-Stipendien NIH R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS] und P30 DK034987 [an UNC-Chapel Hill] unterstützt. Die Autoren danken Deekshita Ramanarayanan für Unterstützung bei qPCR und Western-Blot-Experimenten.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Dynabeads Protein GThermoFisher Scientific10009Immunpräzipitationskügelchen
PBSThermoFisher Scientific10010049für
Puffer Purelink RNA Mini-KitThermoFisher Scientific12183018 RNA-Extraktionaus Gewebe
Purelink DNAse SetThermoFisher Scientific12185010Aauf der Säule DNA-Verdau
Dynamag-2ThermoFisher Scientific12321DMagnet zur Verwendung mit Dynabeads
GelCode Blue FleckenreagenzThermoFisher Scientific24592massenspektrometrisch kompatibler Gelfleck
Pierce ECL Western Blotting SubstratThermoFisher Scientific32106für den Einsatz in Western Blot
Capacity cDNA Reverse TranskriptionskitThermoFisher Scientific4368813für den Einsatz in der Genexpressionsanalyse
Proflex 3 x 32-Well-PCR-SystemThermoFisher Scientific4484073PCR-System
PVDF-TransfermembranThermoFisher Scientific88520für Western Blot
Power Up SYBR MastermixThermoFisher ScientificA25778für die qPCR-Analyse
RNAlaterThermoFisher ScientificAM7020Lösung für die Gewebelagerung vor der RNA-Isolierung
Novex 4-20% Tris Glycin GelThermoFisher ScientificXP04205BOXPrecast Protein Gel
Anti-Keratin 8 Antikörper (TS1)ThermoFisher ScientificMA514428für den Western-Blot-Nachweis von K8
Anti-VimentinThermoFisher ScientificMA511883für den Western-Blot-Nachweis von Vimentin
Tris Glycine Transfer Buffer (25x)ThermoFisher ScientificLC3675für den Nasstransfer von Proteingelen
2x SDS ProbenpufferThermoFisher ScientificLC2676zur Vorbereitung Protein-Gelproben
Tris Glycine SDS Running Buffer (10x)ThermoFisher ScientificLC26755für die Herstellung von Proteingelen
Lysing-Kügelchen - Matrix DMP Biomedicals116913100Lysekügelchen und Matrixröhrchen für den Gewebeaufschluss und die RNA-Extraktion
Lysing-Kügelchen - Matrix SSMP Biomedicals116921100Lysekügelchen und Matrixröhrchen für den Gewebeaufschluss und die Proteinextraktion
NanoDrop Lite SpektralphotometerThermoFisher ScientificND-LITEMessung von Proteinen und Nukleinsäuren
Precellys 24 HomogenisatorBertin InstrumentsEQ03119Automatisierter Gewebehomogenisator
High

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