Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Isolering af Intermediate Filament Proteiner fra Multiple Musvæv til Studie Aging-associerede Post-translationelle Modifikationer

Published: May 18, 2017 doi: 10.3791/55655
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Cell Biology and Physiology, School of Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

I denne metode præsenterer vi biokemiske procedurer til hurtig og effektiv isolering af intermediære filament (IF) proteiner fra flere musevæv. Isolerede IF'er kan anvendes til at studere ændringer i posttranslationelle modifikationer ved massespektrometri og andre biokemiske analyser.

Abstract

Mellemliggende filamenter (IF'er) sammen med actinfilamenter og mikrotubuli danner cytoskelettet - et kritisk strukturelt element i hver celle. Normal funktion IF'er tilvejebringer celler med mekanisk og spændingsfasthed, mens en dysfunktionel IF cytoskelet kompromitterer cellulær sundhed og har været forbundet med mange menneskelige sygdomme. Post-translationelle modifikationer (PTM) regulerer kritisk IF-dynamik som reaktion på fysiologiske ændringer og under stressbetingelser. Derfor kan evnen til at overvåge ændringer i PTM-signaturen af ​​IF'er bidrage til en bedre funktionel forståelse og i sidste ende konditionering af IF-systemet som en stressrespons under cellulær skade. Imidlertid er det store antal IF-proteiner, som er kodet af over 70 individuelle gener og udtrykt på en vævsafhængig måde, en stor udfordring ved at sortere den relative betydning af forskellige PTM'er. Til dette formål, metoder, der muliggør overvågning af PTM'er på IF-proteinerPå et organismer-bredt niveau, snarere end for isolerede familiemedlemmer, kan fremskynde forskningsfremskridt på dette område. Her præsenterer vi biokemiske metoder til isolering af det totale, detergentopløselige og vaskemiddelresistente brøkdel af IF-proteiner fra 9 forskellige musevæv (hjerne, hjerte, lunge, lever, tyndtarme, tyktarm, bugspytkirtel, nyre og milt). Vi demonstrerer yderligere en optimeret protokol til hurtig isolering af IF proteiner ved hjælp af lyseringsmatrix og automatiseret homogenisering af forskellige musevæv. Den automatiske protokol er nyttig til profilering af IF'er i eksperimenter med højt prøvevolumen (såsom i sygdomsmodeller involverende flere dyr og eksperimentelle grupper). De resulterende prøver kan anvendes til forskellige downstream analyser, herunder massespektrometri-baseret PTM profilering. Ved anvendelse af disse metoder giver vi nye data til at vise, at IF-proteiner i forskellige musevæv (hjerne og lever) undergår parallelle ændringer med hensyn til deres ekspresSion niveauer og PTMs under aldring.

Introduction

IF'er er en familie af proteiner, som i humane er kodet af 73 gener og er kategoriseret i seks hovedtyper: Type I-IV er cytoplasmatisk ( fx epitel- og hårkeratiner (K), myocyt desmin, neurofilamenter, glialfibrillære sure proteiner (GFAP), og andre); Type V er nukleare laminer; Og type VI er IF'er i øjelinsen 1 . Med hensyn til deres molekylære organisation har IF-proteiner tre almindelige domæner: et stærkt bevaret "coiled-coil" -stang-domæne og globulære "hoved" og "hale" domæner. Hvis proteintetramerer samles for at danne korte filamentprecursorer, som i sidste ende indgår i modne filamenter, der former dynamiske cytoskeletale og nukleoskeletale strukturer involveret i mekanisk beskyttelse 2 , spændingsføler 3 , 4 , regulering af transkription 5 og vækst og andre kritiske cellulære funktioner"> 1 , 6 , 7 .

Den funktionelle betydning af IF-systemet fremhæves af eksistensen af ​​mange humane sygdomme forårsaget af missense-mutationer i IF-gener, herunder neuropatier, myopatier, hudfraglighedsforstyrrelser, metaboliske dysfunktioner og for tidlig aldringssyndrom 8 . Nogle IF-genmutationer forårsager ikke, men prædisponerer deres bærere for sygdomsprogression, såsom de enkle epitelkeratiner i leversygdom 9 . Sidstnævnte skyldes de kritiske stressbeskyttende funktioner af IF'er i epithelia. IF'er generelt er blandt de mest almindelige cellulære proteiner under basale betingelser, men er yderligere stærkt induceret under forskellige typer stress 10 . For eksempel viste nylige undersøgelser, der evaluerede proteom-brede ændringer i nematoden C. elegans, at flere IF'er er stærkt upregulerede og tilbøjelige til aggregeringPå under organisatorisk aldring 11 , 12 . Da vedligeholdelse af en ordentlig IF-struktur er afgørende for cellulær modstandsdygtighed over for forskellige former for stress 10 , kan IF-aggregering også bidrage til det funktionelle fald under aldring. Imidlertid mangler undersøgelser af organismer på niveau med flere pattedyr IF-proteiner på tværs af forskellige væv under stress.

IF'er er stærkt dynamiske strukturer, der tilpasser sig til at opfylde cellulære krav. Keratiner gennemgår for eksempel en biosyntese-uafhængig cykling mellem opløselig (ikke-filamentøs) og uopløselig (trådformet) proteinpulje 13 . Under normale fysiologiske forhold kan ca. 5% den samlede K8 / K18 pool ekstraheres i vaskemiddelfri buffer i forhold til ca. 20%, der kan opløses i det nonioniske vaskemiddel Nonidet P-40, som er biokemisk sammenlignelig med Triton- X100 14 , 15 . Under mitose er der en bemærkelsesværdig stigning i opløseligheden af ​​epitel K8 og K1814 af simple type, hvilket er mindre tydeligt i epidermale keratiner, men mere tydeligt i vimentin og andre type III IF-proteiner 15 , 16 . Opløselighedsegenskaber for IF-proteiner reguleres tæt ved phosphorylering, en nøgle post-translationel modifikation (PTM) til filamentomlægning og opløselighed 17 , 18 , 19 , 20 . De fleste IF'er gennemgår omfattende regulering af en række PTM'er på konserverede steder, hvilket resulterer i funktionelle ændringer 17 .

Formålet med denne metode er at introducere efterforskere, der er nye for IF-området til biokemisk udvinding og analysemetoder til undersøgelse af IF-proteiner på tværs af flere musevæv. BestemtAllieret fokuserer vi på isolering af IF-proteiner ved anvendelse af en højsaltekstraktionsmetode og vurdering af ændringer i PTM'er via massespektrometri og ved PTM-målretningsantistoffer. Disse fremgangsmåder bygger på tidligere offentliggjorte procedurer 21, men indbefatter modifikationer til ekstraktion af forskellige IF-proteintyper for at afdække fælles mekanisme for regulering over IF-familien. For eksempel regulerer K8-acetylering ved en specifik lysinrest en filamentorganisation, medens hyperacetylering fremmer K8-uløselighed og aggregatdannelse 22 . Nylige globale proteomiske profileringsundersøgelser har desuden afsløret, at de fleste vævsspecifikke IF-proteiner også er mål for acetylering, og at de fleste IF-acetyleringssteder er begrænset til det stærkt konserverede stangdomæne. Dette fremhæver behovet for metoder, der er egnede til global profilering af IF-systemet. Vi introducerer også en hurtig metode til at isolere IF proteiner fra flere væv ved hjælp af automatiseret homogenisering i optiMiseret lyseringsmatrix. De resulterende præparater er egnede til nedstrøms PTM analyse via massespektrometri og andre fremgangsmåder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollen godkendes og udføres i overensstemmelse med Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of North Carolina.

1. Forberedelser

  1. Fremstil Triton-X-buffer (1% Triton X-100, 5 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), opsaml volumen i phosphatpufret saltvand (PBS), pH 7,4). For at gøre 500 ml: omrør 5 ml hver af Triton X-100 og 500 mM EDTA i 490 ml PBS, pH 7,4. Opbevar Triton-X bufferopløsning ved 4 ° C.
  2. Fremstil høj saltbuffer (10 mM Tris-HCI, pH 7,6, 140 mM NaCl, 1,5 M KCl, 5 mM EDTA, 0,5% Triton X-100, bring opvolumen i dobbeltdestilleret (dd) H20). Til fremstilling af 500 ml omrøres 10 ml 0,5 M Tris-HCI (pH 7,6), 14 ml 5 M NaCl, 55,9 g KCl, 5 ml 0,5 M EDTA og 2,5 ml Triton X-100, juster volumen til 500 Ml ved anvendelse af dobbeltdestilleret vand). Opbevar høj saltbufferopløsning ved 4 ° C.
  3. Lige forud for brug suppleres en passende mængde Triton-X og High Salt Buffer (
  4. Forbered 5 mM EDTA i 1x PBS, pH 7,4. For at gøre 500 ml: omrør 5 ml 0,5 M EDTA i 495 ml 1x PBS, pH 7,4.
  5. Isolér forskellige musegrupper (hjerne, hjerte, lunge, lever, bugspytkirtlen, tyktarm, tarm, nyre, milt) ved hjælp af godkendte protokoller, der overholder veterinærretningslinjer og institutionelle standarder 23 . Vævsopsamlingsproceduren bør ikke tage mere end 5 minutter for at bevare RNA og proteinintegritet af proteaserige væv ( fx pankreas bør behandles først).
  6. Skær en lille mængde væv (~ 5-20 mg) og læg i RNA-opbevaringsopløsning til efterfølgende RNA-ekstraktion, cDNA-syntese og kvantitativ real-time PCR-analyse for IF-genekspression. Placer RNA opbevaringsopløsningsrør med væv ved 4 ° C natten over og følg producentens protokol for yderligere sTorage og isolation trin.
  7. Klip resten af ​​vævet i mindre fragmenter ( f.eks. 0,5 cm) og læg i kryogen. Snapfryse og opbevar hætteglas ved -80 ° C eller flydende nitrogen til længerevarende opbevaring.

2. Hvis genekspressionanalyse

  1. Ekstraher RNA fra væv bevaret i RNA opbevaringsopløsningsreagenset. Brug enhver egnet / foretrukket RNA-ekstraktionsmetode i henhold til producentens protokol.
  2. Kvantificer RNA-koncentration og anvend 2 μg RNA til dannelse af cDNA ved anvendelse af et egnet revers transkriptionssæt ifølge producentens protokol.
  3. Ved anvendelse af det genererede cDNA og muse-IF-genspecifikke primere opstilles qPCR-reaktioner, herunder tre tekniske replikater af hver prøve samt tom kontrol ifølge producentens protokol.
  4. Kvantificer IF-genekspression som foldsændring sammenligner forskellige tilstande ( fx ung mod gammelt væv).

3. PReparation af samlede vævslysater for immunoblot

  1. Homogeniser 25 mg væv i 1 ml 2x ikke-reducerende SDS prøvebuffer. Omgå bromphenolblåt farvestof fra prøvebufferen, hvis et kolorimetrisk proteinassay skal udføres for at kvantificere proteinkoncentration.
  2. Tilsæt 5% (v / v) 2-mercaptoethanol (2-ME) for at gøre reducerede prøver. Til 200 μl af de ikke-reducerende prøver tilsættes 10 μl 2-ME.
  3. Bestem proteinkoncentration ved brug af detergent- og reduktionsmiddelkompatibelt proteinassay. Hvis farvestof allerede er inkluderet i prøvebufferen, kan proteinmængden estimeres efter at have kørt en gel via en række teknikker, inklusiv Coomassie-baseret plet 24 .
  4. Vortex alle prøver og varme ved 95 ° C i 5 minutter.
  5. Udfør western blotting under både reducerende og ikke-reducerende betingelser. Eksponeringsmembran kort (<1 min) for at afsløre monomere arter og længere (> 1 min) for at afsløre komplekser med høj molekylvægt indeholdendeNg IF proteiner. Hvis overvågning aggregering undersøges hele gel / membran (herunder bunden af ​​gelbrøndene).
  6. Kør en parallel gel og pletter med en proteinfarve som en belastningskontrol 24 . I sygdomsmodeller eller skadeseksperimenter bør totalproteinfarve anvendes som en belastningskontrol, i modsætning til immunblots til "housekeeping" -proteiner ( f.eks. Actin, GAPDH), fordi sidstnævnte ændres under forskellige stressbetingelser.

4. Fremstilling af detergentopløselige og højsaltekstrakter af vævsspecifikke IF'er

  1. Tilsæt 1 ml iskold Triton X-100 buffer i en glasrør-homogenisator og læg den på is.
  2. Fjern et lille stykke væv (~ 25 mg) fra flydende nitrogenopbevaring og læg direkte ind i glashomogenisatoren. Brug en polytetrafluorethylenpestle til at homogenisere (50 slag) og undgå at lave bobler. Hold homogenisatoren og lysaten kold altid.
  3. Overfør lysat til en 1,5 ml mikrOcentrifugerør på is og centrifuge ved 20.000 xg i 10 minutter i en forkølet centrifuge (4 ° C).
  4. Opsaml supernatantfraktionen i et separat rør. Dette er den Triton X-opløselige fraktion, som kan anvendes til immunpræcipitation (ip) og analyse af det vaskemiddelopløselige pulje af IF-proteiner. Bemærk, at trin 4.1-4.4 gentages for at opnå et renere IF-ekstrakt fra hjernevæv.
  5. Tilsæt 1 ml High Salt Buffer til vævspelleten, overfør til en ren homogenisator og dråbe 100 slag. Overfør homogenatet tilbage til mikrocentrifugerøret, og rør røret på en roterende rystemaskine i det kolde rum i 1 time.
  6. Centrifuger homogenaterne ved 20.000 xg i 20 minutter ved 4 ° C. Kassér supernatanten.
  7. Tilsæt 1 ml iskold PBS / EDTA puffer til pelleten og homogeniser pelleten (20 slag) i en ren homogenisator som et slutligt oprensningstrin *. Overfør til et nyt rør og centrifuger ved 20.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C for at opnå IF-protein-Højt højt saltekstrakt (HSE).
    * Eventuelt hvirvel i stedet for homogenisering ved dette trin.
  8. Kassér supernatanten og opløs pellets i 300 μL ikke-reducerende SDS prøvebuffer, som er blevet forvarmet. Opbrud pelletet oprindeligt ved pipettering og hvirveling, og opvarm derefter prøverne i 5 minutter ved 95 ° C.
  9. Vortex og pipette som nødvendigt for at sikre pelleten er opløst. Det kan tage flere minutter at opløse pellets fuldt ud.
  10. Opbevar alle prøver ved -20 ° C indtil analyse.

5. Automatiseret vævslysis til IF Protein Extraction i High Volume Experiments

  1. Til RNA-ekstraktion anbringes lysisbuffer (600 μl puffer pr. 25 mg væv) i et rør indeholdende lyseringsmatrix D (bruger små keramiske kugler) og puls to gange i 25 s i vævslyseren. Separat lysat fra matrixen ved centrifugering ved 20.000 xg og fortsæt til det næste trin i isolation.
  2. Til proteinekstraktion sættes TritPå X-100 (eller SDS prøvebuffer ved fremstilling af totalt lysat) i et lysørrør med lyseringsmatrix SS (brug en enkelt rustfrit stål). Efter testning af flere matricer blev dette valgt fordi det producerer IF-proteinekstrakter, der er af samme kvalitet som den traditionelle douncing-metode. Bemærk, at den automatiserede metode ikke er optimal for bugspytkirtel og milt, og standardhomogeniseringsprotokollen skal anvendes til disse væv.
  3. For at fortsætte med forberedelse af High Salt Extract, fjerner rustfrit stålperlen fra røret ved hjælp af en magnet og centrifuger rørene ved 20.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
  4. Fortsæt med trin 4.4 (over) i den manuelle protokol.
  5. Opbevar alle prøver ved -20 ° C indtil analyse.

6. Immunberigelse af posttranslationelt modificerede IF proteiner

  1. Klargør PBST-buffer (0,02% Tween-20 i PBS). For at gøre 50 ml tilsættes 10 μl Tween-20 til 50 ml PBS, pH 7,4.
  2. Forbered PTM antistofOpløsning (1-10 μg antistof i 200 μl PBST). Generelt er 3 μg antistof / reaktion en god starttilstand, der kan optimeres yderligere, hvis det er nødvendigt.
  3. Til hver reaktion placeres alikvot 50 μl magnetiske perler i et mikrocentrifugerør på magneten og aspirerer perloplagringsopløsningen.
  4. Konjuger perlerne til immunpræcipitationsantistoffet ved at suspendere i antistofopløsningen og inkuberer på rotator (ende-over-ende for at sikre blanding af små volumener) ved stuetemperatur i 20 minutter.
  5. Placer rørene på magnet og aspirer antistofopløsning.
  6. Skyl de antistof-konjugerede perler en gang i 200 μl PBST og fjern vaskbufferen.
  7. Tilsæt 0,6-1 ml af vævslysatet til perlerne, bland ved forsigtig pipettering og inkuber i 3 timer på rotatoren i et koldt rum.
  8. Placer rør på magnet, fjern lysat, og vask perlerne fem gange med 200 μl PBST. Efter det sidste vaske trin, saml perlerne i 100 _6; L af PBS (ingen Tween-20) og overfør til et rent nyt rør. Placer røret på magneten.
  9. Aspirere PBS'en og tilsæt 100 μL ikke-reducerende prøvebuffer. Fjern 50 μL og tilsæt 2-ME (5%) for at reducere prøver. Opvarm prøverne til 95 ° C i 5 minutter.
  10. Adskil ip fraktionen fra perlerne på magneten og saml den ind i et nyt rør.
  11. Opbevar prøver ved -20 ° C indtil analyse.

7. Fremstilling af IF-proteinprøver til massespektrometri-analyse

  1. Planlæg en høring med en proteomikksekspert forud for initiering af en undersøgelse, da der er betydelig tid og omkostninger involveret i massespektrometrianalyse.
  2. Sørg for særlige forholdsregler for at undgå forurening. Håndter alle geler med rene handsker og inkuber i rene beholdere, vask kun med ddH 2O (undgå sæbe).
  3. Kør 20-50 μl af HSE-prøven (fra sektionerne 4 og 5) på en SDS-PAGE-gel i overensstemmelse med standardbetingelserne. Stain med en protein plet i 1 time. Skyl flere gange og de-pletter i ddH20 natten over. IF-proteinbåndene skal være let synlige efter de-farvning.
  4. Placer gelen mellem plastikbeskyttere, scan og markér de bånd, der skal udskæres og sendes til analyse.
  5. Punk IF-båndene ved hjælp af en ny ren barbermaskine.
  6. Placer gelbåndene i rene mikrocentrifugerør og overfør til et massespektrometrianlæg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En ny hurtig metode til høj saltbaseret ekstraktion af IF-proteiner fra flere musevæv under anvendelse af lyseringsmatrix.

Den traditionelle metode 25 , 26 til isolering af hovedparten af ​​den mellemliggende filamentproteinfraktion fra epitelvæv blev modificeret her for at indbefatte 9 forskellige organer og en hurtigere procedure til vævslys. Mens 3 manuelle homogeniseringstrin er nødvendige for den traditionelle metode, har den ændrede procedure kun 1 manuel homogeniseringstrin, hvilket forkorter proceduren med flere timer, især ved behandling af mere end 6 prøver. Figur 1A viser et typisk resultat af HSE fra 9 musevæv, mens tabellen af ​​forventede proteiner i vævet og molekylvægten af ​​hvert protein er vist i figur 1B

Lever K8 og K18 styrkes stærkt og undergår øget phosphorylering og lysinacetylering i lever fra gamle mus.

Figur 2 viser typiske resultater fra flere af analyserne beskrevet i denne protokol. Panel A viser ekspressionsanalyse af de to store IF-gener i leveren, keratin 8 ( KRT8 )Og keratin 18 ( KRT18 ), som koder for henholdsvis IF-proteinerne K8 og K18. Epithelialkeratiner styrkes stærkt under forskellige stressforhold. I det viste resultat sker dette under aldring, da KRT8 er signifikant opreguleret i leverne af 24 m gamle mus sammenlignet med 3 m gamle mus. Resultaterne på proteinniveauet er mere slående, som observeret af den dramatiske stigning i K8-monomer såvel som højmolekylære komplekser i de gamle (24m) lever. Coomassie-baseret proteinfarve tjener her som en belastningskontrol for at sikre lige indlæsning af protein på tværs af prøver. Bemærk at med det samlede vævslysat er det let at overbelaste protein på en gel, som det er i dette tilfælde. Ved at lægge et mindre volumen eller fortynding af prøven yderligere i buffer med natriumdodecylsulfat (SDS) vil dette problem afhjælpes (især hvis det virker viskøst og vanskeligt at pipette). Panel C afbilder et typisk resultat fra et højt Salt Extract-lever opnået ved anvendelse af den automatiserede protokol, demOnstrating den stærke berigelse af keratinerne 8 og 18 på gelen. De røde linjer afgrænser det område, der blev udskåret og indsendt til massespektrometrianalyse. I panel D viser resultaterne af massespektanalysen af ​​prøverne i panel C, at K8 og K18 i den gamle lever har flere phosphorylerings- og acetyleringssteder, der ikke er til stede i den unge lever.

GFAP er stærkt opreguleret og lysin acetyleres i hjernen fra gamle mus.

Figur 3 demonstrerer, at fremgangsmåderne anvendt til ekstraktion af IF'er fra epithelia også kan anvendes på ikke-epitelvæv. Desuden afslører resultaterne et generelt mønster for aldersafhængig opregulering af IF-gener og proteiner. QPCR-resultatet i figur 2A afslører en 5 gange induktion af GFAP mRNA i hjernen hos 24 m gamle mus sammenlignet med 3 m gamle mus. Figur 2BAfslører samlede proteiner til stede i Triton X-100 fraktionen og den IF-berigede HSE. Bemærk stigningen i båndintensiteten ved 50 kDa markeret med pilen (svarende til GFAP) i den gamle hjerne. Western blot-analyse i figur 2C afslører endvidere opreguleringen af ​​GFAP og signifikant tilstedeværelse af GFAP-monomer og potentielt højmolekylært kompleks i Triton X-100 fraktionen (begge markeret med pile). Western blot-analyse af de samme prøver med et pan-acetyllysinantistof viser, at antistoffet genkender et bånd ved ~ 50 kDa i HSE fra den gamle mushjerne og ved ~ 250 kDa i Triton X-100 fraktionen ( Figur 2D ). Immunforsyning af acetylerede proteiner fra Triton X-100-fraktionerne afslører øget tilstedeværelse af GFAP-protein i lysatet opnået fra den gamle hjerne. Reduktions- og ikke-reducerende betingelser er vist at fremhæve GFAP-monomer og højmolekylære komplekser. Massespektrometrianalyse (ligner figur 1

figur 1
Figur 1: Automatiseret lysis og ekstraktion af IF-proteiner fra flere musevæv. ( A ) Coomassie-baseret gel-plet af HSE'er fra de udpegede musevæv. De viste væv blev opnået fra den samme voksne (3 m gamle) mandlige CBA-mus. Prøver blev behandlet som beskrevet i afsnit 5. Hjerne : bemærk at NFL, NFM og NFH er stærkt fosforylerede 27 og migrere langsommere end forventet, henholdsvis på henholdsvis 70, 145 og 200 kDa. Hjerte : Ud over 53 kDa båndet svarende til desmin og vimentin) indeholder hjerteprøver også et ~ 42 kDa bånd, der mest sandsynligt repræsenterer actin, som vides at co-oprense med desmin 28 . LArge-intestin: Identiteten af ​​de fremtrædende bånd over 25 kDa, der samekstraheres med K8 / K18, er ikke kendt, men disse bånd er ikke til stede, hvis vævene behandles ved anvendelse af den traditionelle dounce homogenisator metode. Bukspyttkjertel og milt : Bemærk, at den automatiserede homogenisering ikke er egnet til isolering af keratiner fra bugspytkirtlen og vimentin fra milt, formodentlig på grund af lysatets følsomhed til den lille temperaturstigning under pulsen i vævslyseren. ( B ) Tabel, der viser de vigtigste IF-proteintyper, der er til stede i de forskellige væv og deres forudsagte molekylvægt som reference for panel A. Klik venligst her for at se en større version af denne figur.

Figur 2
Figur 2: MoleculAr og biokemiske forskelle i leverkeratiner fra unge og gamle mus. ( A ) Analyse af KRT8 og KRT8 mRNA ved anvendelse af standardprocedure (protokol 1) afslører signifikant induktion i KRT8 transkript i leverne fra gamle mus. N = 6 for hver tilstand (3 mandlige og 3 hunlige CBA-mus blev anvendt pr. Gruppe). ** p <0,01; Envejs ANOVA. ( B ) Totale leverlysater blev opnået fra 3 unge (3 måneder gamle) og 3 gamle (24 måneder gamle) hanlige CBA-mus ved anvendelse af protokol 2, og prøverne blev analyseret under ikke-reducerende betingelser. TS1-antistof blev anvendt til probe for K8-ekspression, og Coomassie-baseret proteinfarvning blev anvendt som en belastningskontrol. ( C ) Høje saltekstrakter fra unge og gamle muselever, svarende til mus nr. 1 og nr. 4 fra panel B. De to pile peger på K8 og K18 på gelen, og den røde boks angiver den del af gelen, der var Udskåret og indsendt til massespektrometri analyse. ( D Klik venligst her for at se en større version af denne figur.

Figur 3
Figur 3: Molekylære og biokemiske forskelle i GFAP fra hjerne hos unge og gamle mus. ( A ) Analyse af GFAP mRNA ved anvendelse af standardprocedure (protokol 1) afslører signifikant induktion i hjernen fra gamle mus. N = 6 for hver tilstand (3 mandlige og 3 hunlige CBA-mus blev anvendt pr. Gruppe). ** p <0,01; Envejs ANOVA. ( B ) Coomassie-baseret proteinfarvning af Triton X-100- og HSE-fraktioner fra hjernevæv af ung (3 måneder gammel) og gammel (24 måneder gammel) mus. Bemærk stigningen i ~ 50 kDa GFAP bånd i HSE fra gammel hjerne (pil). ( C ) GFAP-immunoblot (musmonoklonal; GA5-klon) af de samme prøver som panel B. ( D ) Acetyl-lysinimmunoblot (kaninpolyklonal; Abcam ab80178) af de samme prøver som i panel B. ( E ) GFAP-blot efter immunpræcipitation med acetyl- Lysin antistof. Prøver blev analyseret under ikke-reducerende (NR) og reducerende (R) tilstande, og pile peger på at forøge tilstedeværelsen af ​​GFAP i immunpræcipitatet fra den gamle hjerne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoder, der muliggør biokemisk karakterisering af IF-proteiner, kan være nyttige til at forstå talrige patofysiologiske fænomener i pattedyrsystemer, da IF-proteiner er både markører og modulatorer af cellulær og vævsspænding 29 . Princippet bag den nuværende metode er baseret på de indledende procedurer udviklet i 1970'erne og 1980'erne for at isolere, adskille og rekonstruere IF-proteiner fra celler og væv, som generelt anvender lav- og højt saltopløsninger og Triton-X100-vaskemiddel 25 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 . For historisk indsigt i de undersøgelser, der understøttede den biokemiske isolering af IF-proteiner, se venligst de seneste anmeldelser 36 , 37 . Den nuværende metodeEr baseret på nyere protokoller udviklet til undersøgelse af simple epithelialkeratiner 26 . Fordelen ved metoden er, at den kan fungere som et indledende trin for at muliggøre forskere, der er nye for IF-feltet, for effektivt at isolere IF-proteiner fra de fleste pattedyrvæv. Det repræsenterer en visuel vejledning til beslægtede procedurer, der i vid udstrækning anvendes af efterforskere på området for at studere IF-proteinregulering 21 , 38 .

Denne teknik kan bruges til at studere regulering og funktion af IF'er i stresskommunikationsmekanismer mellem pattedyrvæv 39 , 40 . Det bliver værdsat, at stress i et væv kan påvirke funktionen af ​​andre væv, for eksempel under betingelser af ernæringsspænding 41 , proteinfoldfolding 42 , metabolisk stress 43 og othEr ændringer. Bemærk, at det meste af det arbejde, der i øjeblikket foregår på dette område, findes i Drosophila og C. elegans modeller, mens der mangler undersøgelser af omfattende stressresponser i pattedyrsystemer. Som hovedregulator for cellulær stress 10 kan IF-systemet låse op for spor til responsniveauer på organisationsniveau, hvilket kan have vigtige sygdomsimplikationer. Som sådan kan den nuværende protokol bruges til at studere globale patofysiologiske mekanismer i forskellige musemodeller af stress, skade og sygdom.

En begrænsning af den nuværende teknik er, at de høje saltekstrakter betragtes som "rå" IF-præparater, da de også indeholder andre IF-associerede proteiner, såsom plectin for eksempel 44 . Som vist tidligere kan HSE'er denatureres i 8 M urinstofpuffer til opnåelse af højt rene IF-proteiner, som er i stand til in vitro-samling i phosphatbuffer 44 . Efter to sådanne cykler afDemontering og genmontering forblev støkiometrien af ​​IF-proteiner (isoleret fra HeLa-celler) den samme, medens urinbehandlingen fjernede plektin 44 . Under desminoprensning kan actin fjernes ved solubilisering af HSE i eddikesyre 45 . Hvorvidt yderligere rensningstrin bør inkluderes afhænger af det ultimative mål for eksperimentet. For eksempel, hvis målet er at karakterisere samlingstilstanden og generere in vitro rekonstituerede IF'er, kræves ureastrinet for at opnå meget rene IF-proteiner. På den anden side, hvis målet er at identificere kontekstafhængige associationer mellem IF'er og andre cellulære proteiner, kan de "rå" præparater anvendes. Interagerende proteiner kan identificeres ved massespektrometri ved anvendelse af enten in-gel fordøjelse for høje overflodmål, der er synlige ved gelfarvning eller opløsning i opløsning for lave overflodmål. Tidligere undersøgelser ved anvendelse af immunopræcipitation af detergentopløselige IF'er og HSE'erIndeholdende IF-proteiner identificerede funktionelt vigtige specifikke interaktioner mellem keratiner 8/18 og varmchokprotein 70 (Hsp70), som potenseres efter varmestrøm 46 , adapterproteinet 14-3-3 efter phosphorylering 47 og K8 / K18 Raf-1-kinase Under normale fysiologiske forhold 48 blandt andre. Den nuværende protokol kan muliggøre lignende undersøgelser af andre IF-proteiner.

Anvendelse af lyseringsmatrixen er en nøgleændring fra tidligere metoder og bør muliggøre hurtig ekstraktion af IF'er fra flere væv, med undtagelse af bugspytkirtlen og milt. Automatiseringen af ​​de indledende trin kan være særlig nyttig til højvolumen mus eksperimenter. For eksempel vil isolering af IF-proteiner fra 3 forskellige væv fra 10 mus pr. Tilstand ( f.eks. Normal og en eller anden form for systemisk stress eller sygdom) kræve behandling af 60 individuelle væv. Brug den traditionelle manuelle metode denne woUld skal udføres i partier og kan tage flere dage. Men ved hjælp af den automatiserede metode med lyseringsmatrix kan proceduren udføres på få timer. Kritiske trin i proceduren omfatter: at sikre at prøven forbliver kold under hele proceduren; Inkubation i høj saltbuffer i 1 time (trin 4.5); Ved hjælp af varm buffer og omfattende vortex for at sikre fuldstændig resuspension af pelleten før analyse (trin 4.8); Og træffe alle forholdsregler for at undgå forurening af prøver, som skal analyseres ved massespektrometri (trin 7.2).

Den største ulempe ved massespektrometri-baseret identifikation af PTM-steder er, at det virker meget godt for visse PTM'er - fosforylering og lysinacetylering er førende eksempler - men andre, såsom sumoylering, er langt mere udfordrende 49 . Ikke desto mindre er proteomics et kraftfuldt værktøj til at studere proteinregulering i normale og syge væv. Agnetti et al. Samlet en omfattende opbygning-til-dato oversigt over fremskridt proteomiske teknikker, som i øjeblikket er i brug for at studere forskellige PTM'er i sammenhæng med vævs-udtrykte proteiner 50 . Formålet med den nuværende metode er at generere prøver, der kan anvendes til forskellige typer analyser. For eksempel kan in vitro- sumoylering udføres på immunpræcipiterede IF-proteiner, og samlet sumoylering kan vurderes på isolerede IF'er i HSE-præparater under anvendelse af sumospecifikke antistoffer 18 , 21 . Anvendelsen af ​​denne fremgangsmåde er derfor ikke begrænset til generering af prøver alene til massespektrometrianalyse, men kan anvendes til at probere flere IF-egenskaber ved anvendelse af en række nedstrøms teknikker.

IF-proteiner reguleres i vid udstrækning af talrige PTM'er på konserverede steder, hvilket resulterer i ændret opløselighed, filamentmontering og proteininteraktioner 17 . Nylige teknologiske fremskridt har afsløret tHan utrolig storhed, kompleksitet og sygdomsbetydning af posttranslationelle modifikationer (PTM'er) på cellulære proteiner 51 , 52 , 53 . Forbedring af detektionsmetoder til fælles PTM'er, såsom phosphorylering 54 og acetylering 51 , har givet store katalogkataloger, men forståelsen af ​​deres biologiske betydning - krakning af "PTM-koden" - er en vigtig resterende udfordring 55 , 56 . En måde at vurdere de funktionelle roller og den relative betydning af hver PTM er at bestemme, hvor godt den er bevaret på tværs af flere medlemmer af IF-proteinet. For eksempel afslørede identifikation af et nyt phospho-tyrosinsted på K8, at dette site er indeholdt i et QYE-motiv, der findes i i det væsentlige alle cytoplasmatiske IF-proteiner og kritisk til regulering af IF-proteinopløselighed og filament dyNamikker 57 . Det er vigtigt, at mutation af den konserverede tyrosinrest på GFAP til en negativt ladet "phosphomimic" asparaginsyre (Y242D) forårsager Alexander Disease 58 . De repræsentative data, der er vist her, viser, hvordan to forskellige vævsspecifikke IF-proteintyper (K8 og GFAP) undergår et lignende opreguleringsmønster og øget acetylering under aldring, hvilket kan være en effekt af ændret metabolisme 22 , 51 . Dette eksempel illustrerer anvendeligheden af ​​fremgangsmåden til forståelse af IF-proteins funktion på en global fysiologisk skala.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH-bevillingerne NIH R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS] og P30 DK034987 [til UNC-Chapel Hill]. Forfatterne takker Deekshita Ramanarayanan for hjælp med qPCR og western blot-eksperimenter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dynabeads Protein G ThermoFisher Scientific 10009 immunoprecipitation beads
PBS ThermoFisher Scientific 10010049 for buffers
Purelink RNA mini kit ThermoFisher Scientific 12183018 RNA extraction from tissue
Purelink DNAse set ThermoFisher Scientific 12185010A on column DNA digestion
Dynamag-2 ThermoFisher Scientific 12321D magnet for use with dynabeads
GelCode Blue Stain Reagent ThermoFisher Scientific 24592 mass spectrometry-compatible gel stain
Pierce ECL Western Blotting Substrate ThermoFisher Scientific 32106 for use in western blot
High Capacity cDNA reverse transcription kit ThermoFisher Scientific 4368813 for use in gene expression analysis
Proflex 3 x 32-well PCR System ThermoFisher Scientific 4484073 PCR system
PVDF transfer membrane  ThermoFisher Scientific 88520 for western blot
Power Up SYBR master mix ThermoFisher Scientific A25778 for qPCR analysis
RNAlater ThermoFisher Scientific AM7020 solution for tissue storage prior to RNA isolation
Novex 4-20% Tris Glycine Gel ThermoFisher Scientific XP04205BOX Precast protein gel
Anti-Keratin 8 antibody (TS1) ThermoFisher Scientific MA514428 for western blot detection of K8
Anti-Vimentin ThermoFisher Scientific MA511883 for western blot detection of vimentin
Tris Glycine Transfer Buffer (25x) ThermoFisher Scientific LC3675 for wet transfer of protein gels
2x SDS Sample Buffer ThermoFisher Scientific LC2676 for preparing protein gel samples
Tris Glycine SDS Running Buffer (10x) ThermoFisher Scientific LC26755 for running protein gels
Lysing beads - Matrix D MP Biomedicals 116913100 Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction
Lysing beads - Matrix SS MP Biomedicals 116921100 Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction
NanoDrop Lite Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-LITE measurement of protein and nucleic acid
Precellys 24 homogenizer Bertin Instruments EQ03119 Automated tissue homogenizer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eriksson, J. E., et al. Introducing intermediate filaments: from discovery to disease. J Clin Invest. 119 (7), 1763-1771 (2009).
  2. Lowery, J., Kuczmarski, E. R., Herrmann, H., Goldman, R. D. Intermediate Filaments Play a Pivotal Role in Regulating Cell Architecture and Function. J Biol Chem. 290 (28), 17145-17153 (2015).
  3. Perez-Sala, D., et al. Vimentin filament organization and stress sensing depend on its single cysteine residue and zinc binding. Nat Commun. 6, 7287 (2015).
  4. Dialynas, G., et al. Myopathic lamin mutations cause reductive stress and activate the nrf2/keap-1 pathway. PLoS Genet. 11 (5), e1005231 (2015).
  5. Hobbs, R. P., et al. Keratin-dependent regulation of Aire and gene expression in skin tumor keratinocytes. Nat Genet. , (2015).
  6. Chung, B. M., Rotty, J. D., Coulombe, P. A. Networking galore: intermediate filaments and cell migration. Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 600-612 (2013).
  7. Gruenbaum, Y., Aebi, U. Intermediate filaments: a dynamic network that controls cell mechanics. F1000 Prime Rep. 6, (2014).
  8. Omary, M. B. "IF-pathies": a broad spectrum of intermediate filament-associated diseases. J Clin Invest. 119 (7), 1756-1762 (2009).
  9. Omary, M. B., Ku, N. O., Strnad, P., Hanada, S. Toward unraveling the complexity of simple epithelial keratins in human disease. J Clin Invest. 119 (7), 1794-1805 (2009).
  10. Toivola, D. M., Strnad, P., Habtezion, A., Omary, M. B. Intermediate filaments take the heat as stress proteins. Trends Cell Biol. 20 (2), 79-91 (2010).
  11. Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging. C. elegans. Cell. 161 (4), 919-932 (2015).
  12. David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in. C. elegans. PLoS Biol. 8 (8), (2010).
  13. Windoffer, R., Beil, M., Magin, T. M., Leube, R. E. Cytoskeleton in motion: the dynamics of keratin intermediate filaments in epithelia. J Cell Biol. 194 (5), 669-678 (2011).
  14. Chou, C. F., Riopel, C. L., Rott, L. S., Omary, M. B. A significant soluble keratin fraction in 'simple' epithelial cells. Lack of an apparent phosphorylation and glycosylation role in keratin solubility. J Cell Sci. 105 ( Pt. 2, 433-444 (1993).
  15. Omary, M. B., Ku, N. O., Liao, J., Price, D. Keratin modifications and solubility properties in epithelial cells and in vitro). Subcell Biochem. 31, 105-140 (1998).
  16. Lowthert, L. A., Ku, N. O., Liao, J., Coulombe, P. A., Omary, M. B. Empigen BB: a useful detergent for solubilization and biochemical analysis of keratins. Biochem Biophys Res Commun. 206 (1), 370-379 (1995).
  17. Snider, N. T., Omary, M. B. Post-translational modifications of intermediate filament proteins: mechanisms and functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 163-177 (2014).
  18. Snider, N. T., Weerasinghe, S. V., Iniguez-Lluhi, J. A., Herrmann, H., Omary, M. B. Keratin hypersumoylation alters filament dynamics and is a marker for human liver disease and keratin mutation. J Biol Chem. 286 (3), 2273-2284 (2011).
  19. Eriksson, J. E., et al. Specific in vivo phosphorylation sites determine the assembly dynamics of vimentin intermediate filaments. J Cell Sci. 117 (Pt. 6, 919-932 (2004).
  20. Sahlgren, C. M., et al. Mitotic reorganization of the intermediate filament protein nestin involves phosphorylation by cdc2 kinase). J Biol Chem. 276 (19), 16456-16463 (2001).
  21. Snider, N. T., Omary, M. B. Assays for Posttranslational Modifications of Intermediate Filament Proteins. Methods Enzymol. 568, 113-138 (2016).
  22. Snider, N. T., et al. Glucose and SIRT2 reciprocally mediate the regulation of keratin 8 by lysine acetylation. J Cell Biol. 200 (3), 241-247 (2013).
  23. Danneman, P., Suckow, M. A., Brayton, C., Suckow, M. A. The laboratory mouse. , 2nd edn, CRC Press. (2013).
  24. Weiss, W., Weiland, F., Gorg, A. Protein detection and quantitation technologies for gel-based proteome analysis. Methods Mol Biol. 564, 59-82 (2009).
  25. Achtstaetter, T., Hatzfeld, M., Quinlan, R. A., Parmelee, D. C., Franke, W. W. Separation of cytokeratin polypeptides by gel electrophoretic and chromatographic techniques and their identification by immunoblotting. Methods Enzymol. 134, 355-371 (1986).
  26. Ku, N. O., et al. Studying simple epithelial keratins in cells and tissues. Methods Cell Biol. 78, 489-517 (2004).
  27. Julien, J. P., Mushynski, W. E. Multiple phosphorylation sites in mammalian neurofilament polypeptides. J Biol Chem. 257 (17), 10467-10470 (1982).
  28. Hubbard, B. D., Lazarides, E. Copurification of actin and desmin from chicken smooth muscle and their copolymerization in vitro to intermediate filaments. J Cell Biol. 80 (1), 166-182 (1979).
  29. Ku, N. O., Strnad, P., Bantel, H., Omary, M. B. Keratins: Biomarkers and modulators of apoptotic and necrotic cell death in the liver. Hepatology. 64 (3), 966-976 (2016).
  30. Huiatt, T. W., Robson, R. M., Arakawa, N., Stromer, M. H. Desmin from avian smooth muscle. Purification and partial characterization. J Biol Chem. 255 (14), 6981-6989 (1980).
  31. Zackroff, R. V., Goldman, R. D. In vitro assembly of intermediate filaments from baby hamster kidney (BHK-21) cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (12), 6226-6230 (1979).
  32. Franke, W. W., Schmid, E., Osborn, M., Weber, K. The intermediate-sized filaments in rat kangaroo PtK2 cells. II. Structure and composition of isolated filaments. Cytobiologie. 17 (2), 392-411 (1978).
  33. Small, J. V., Sobieszek, A. Studies on the function and composition of the 10-NM(100-A) filaments of vertebrate smooth muscle. J Cell Sci. 23, 243-268 (1977).
  34. Dahl, D., Bignami, A. Glial fibrillary acidic protein from normal human brain. Purification and properties. Brain Res. 57 (2), 343-360 (1973).
  35. Steinert, P. M., Idler, W. W., Zimmerman, S. B. Self-assembly of bovine epidermal keratin filaments in vitro. J Mol Biol. 108 (3), 547-567 (1976).
  36. Goldman, R. D., Cleland, M. M., Murthy, S. N., Mahammad, S., Kuczmarski, E. R. Inroads into the structure and function of intermediate filament networks. J Struct Biol. 177 (1), 14-23 (2012).
  37. Oshima, R. G. Intermediate filaments: a historical perspective. Exp Cell Res. 313 (10), 1981-1994 (2007).
  38. Mashukova, A., Forteza, R., Salas, P. J. Functional Analysis of Keratin-Associated Proteins in Intestinal Epithelia: Heat-Shock Protein Chaperoning and Kinase Rescue. Methods Enzymol. 569, 139-154 (2016).
  39. Schinzel, R., Dillin, A. Endocrine aspects of organelle stress-cell non-autonomous signaling of mitochondria and the ER. Curr Opin Cell Biol. 33, 102-110 (2015).
  40. Taylor, R. C., Berendzen, K. M., Dillin, A. Systemic stress signalling: understanding the cell non-autonomous control of proteostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 211-217 (2014).
  41. Lemieux, G. A., et al. Kynurenic acid is a nutritional cue that enables behavioral plasticity. Cell. 160 (1-2), 119-131 (2015).
  42. Oosten-Hawle, P., Porter, R. S., Morimoto, R. I. Regulation of organismal proteostasis by transcellular chaperone signaling. Cell. 153 (6), 1366-1378 (2013).
  43. Ulgherait, M., Rana, A., Rera, M., Graniel, J., Walker, D. W. AMPK modulates tissue and organismal aging in a non-cell-autonomous manner. Cell Rep. 8 (6), 1767-1780 (2014).
  44. Aynardi, M. W., Steinert, P. M., Goldman, R. D. Human epithelial cell intermediate filaments: isolation, purification, and characterization. J Cell Biol. 98 (4), 1407-1421 (1984).
  45. Shea, J. M., et al. Purification of desmin from adult mammalian skeletal muscle. Biochem J. 195 (2), 345-356 (1981).
  46. Liao, J., Lowthert, L. A., Ghori, N., Omary, M. B. The 70-kDa heat shock proteins associate with glandular intermediate filaments in an ATP-dependent manner. J Biol Chem. 270 (2), 915-922 (1995).
  47. Liao, J., Omary, M. B. 14-3-3 proteins associate with phosphorylated simple epithelial keratins during cell cycle progression and act as a solubility cofactor. J Cell Biol. 133 (2), 345-357 (1996).
  48. Ku, N. O., Fu, H., Omary, M. B. Raf-1 activation disrupts its binding to keratins during cell stress. J Cell Biol. 166 (4), 479-485 (2004).
  49. Hendriks, I. A., Vertegaal, A. C. A comprehensive compilation of SUMO proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (9), 581-595 (2016).
  50. Agnetti, G., Lindsey, M. L., Foster, D. B. Manual of cardiovascular proteomics. , Springer. (2016).
  51. Choudhary, C., Weinert, B. T., Nishida, Y., Verdin, E., Mann, M. The growing landscape of lysine acetylation links metabolism and cell signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 536-550 (2014).
  52. Herhaus, L., Dikic, I. Expanding the ubiquitin code through post-translational modification. EMBO Rep. 16 (9), 1071-1083 (2015).
  53. Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists. Mol Biol Cell. 24 (5), 535-542 (2013).
  54. Choudhary, C., Mann, M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (6), 427-439 (2010).
  55. Creixell, P., Linding, R. Cells, shared memory and breaking the PTM code. Mol Syst Biol. 8, 598 (2012).
  56. Minguez, P., et al. Deciphering a global network of functionally associated post-translational modifications. Mol Syst Biol. 8, (2012).
  57. Snider, N. T., Park, H., Omary, M. B. A conserved rod domain phosphotyrosine that is targeted by the phosphatase PTP1B promotes keratin 8 protein insolubility and filament organization. J Biol Chem. 288 (43), 31329-31337 (2013).
  58. Gorospe, J. R., et al. Molecular findings in symptomatic and pre-symptomatic Alexander disease patients. Neurology. 58 (10), 1494-1500 (2002).

Tags

Biochemistry intermediary filamenter post-translationel modifikation massespektrometri immunpræcipitation aldring stress dyremodeller vævsfraktionering
Isolering af Intermediate Filament Proteiner fra Multiple Musvæv til Studie Aging-associerede Post-translationelle Modifikationer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Battaglia, R. A., Kabiraj, P.,… More

Battaglia, R. A., Kabiraj, P., Willcockson, H. H., Lian, M., Snider, N. T. Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications. J. Vis. Exp. (123), e55655, doi:10.3791/55655 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter