Ganzzellige Patch-Clamp Aufnahmen von isolierten primären Epithelzellen aus dem Epididymis

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein Protokoll, das Zellisolation und Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung kombiniert, um die elektrischen Eigenschaften der primär dissoziierten Epithelzellen aus den Ratten-Cauda-Epididymiden zu messen. Dieses Protokoll erlaubt die Untersuchung der funktionellen Eigenschaften von primären epididymalen Epithelzellen, um die physiologische Rolle des Nebenhodens weiter zu erforschen.

Zusammenfassung

Das Nebenhoden ist ein wesentliches Organ für die Spermienreifung und die reproduktive Gesundheit. Das epididymale Epithel besteht aus aufwendig verbundenen Zelltypen, die sich nicht nur in molekularen und morphologischen Merkmalen, sondern auch in physiologischen Eigenschaften unterscheiden. Diese Unterschiede spiegeln ihre vielfältigen Funktionen wider, die zusammen die notwendige Mikroumgebung für die post-testikuläre Spermienentwicklung im epididymalen Lumen bilden. Das Verständnis der biophysikalischen Eigenschaften der epididymalen Epithelzellen ist entscheidend für die Aufdeckung ihrer Funktionen in der Spermien- und Reproduktionsgesundheit, sowohl unter physiologischen als auch pathophysiologischen Zuständen. Während ihre funktionellen Eigenschaften noch nicht vollständig aufgeklärt sind, können die epididymalen Epithelzellen unter Verwendung der Patch-Clamp-Technik, einem Werkzeug zur Messung der zellulären Ereignisse und der Membraneigenschaften einzelner Zellen, untersucht werden. Hier beschreiben wir die Methoden der Zellisolation und der Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung auf meaSicher die elektrischen Eigenschaften der primär dissoziierten Epithelzellen aus der Ratte cauda epididymide.

Einleitung

Die Nebenhoden im männlichen Fortpflanzungstrakt sind ein Organ, das mit einer Schicht von Mosaik-Epithelzellen ausgekleidet ist. Wie in anderen Epithelgeweben arbeiten die verschiedenen Zelltypen des epididymalen Epithels, einschließlich der Hauptzellen, klaren Zellen, Basalzellen und Zellen aus den immunologischen und lymphatischen Systemen, in einer konzertierten Weise als Barriere an der Tubulusfront und als die Stützzellen für die Spermienreifung und Physiologie ^{1 , 2 , 3} . So spielen diese Epithelzellen eine wesentliche Rolle in der reproduktiven Gesundheit.

Protokoll

Alle Tierversuche werden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des ShanghaiTech University Institutional Animal Care and Use Committee durchgeführt, die die lokalen und internationalen Anforderungen erfüllen.

1. Experimentelle Tiere

1. Verwenden Sie erwachsene männliche Sprague-Dawley-Ratten (~ 300-450 g) zwischen 8-12 Wochen alt. In diesem Alter bei den Ratten ist das Sperma in den Cauda-Nebenhoden angekommen.

2. Isolierung von Epithelzellen aus Ratten Cauda Epididymiden

HINWEIS: Die folgenden Schritte werden unter nicht-aseptischen Bedingungen durchgeführt, sofern ni....

Ergebnisse

Das beschriebene enzymatische Aufschlussverfahren für die Isolierung von Epithelzellen aus den Ratten-Cauda-Epididymiden ist ein modifiziertes Protokoll aus unseren bisherigen Studien ^{9 , 12} . Diese Methode erzeugt eine Mischung von Einzelzellen mit über 90% Lebensfähigkeit und ohne Oberflächenblasen oder gequollenes Zellvolumen. Die heterogene Zellmischung besteht hauptsächlich aus Hauptzellen, klaren Zellen und Basalzellen, wie.......

Diskussion

In diesem Protokoll führte die enzymatische Dispersion der Ratten-Cauda-Epididymide konsequent zu gesunden Epithelzellen. Die Qualität der epididymalen Epithelzellen für die Patch-Clamp-Experimente hängt von einigen kritischen Schritten im Protokoll ab. Zum Beispiel ist die Zentrifugation der Zellmischung bei einer niedrigen Zentrifugalkraft (30 xg) für die Entfernung der Spermatozoen und des epididymalen Lumeninhalts wichtig; Die epididymalen Epithelzellen werden in Gegenwart der Spermatozoen in der Zellkultur ungesund.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Instrument des AXON-Systems
computergesteuerter Verstärker	Molecular Devices - Axon	Multiclamp 700B Patch-Clamp-Verstärker
Digitales Erfassungssystem	Molecular Devices - Axon	Digidata 1550 Konverter
Mikroskop	Olympus	BX-61WI
Mikromanipulator	Sutter Instruments	MPC-325
Aufnahmekammer und Inline-Heizung	Warner Instruments	TC-324C
Instrument des HEKA Systems
Patch Clamp Verstärker	Harvard Bioscience - HEKA	EPC-10 USB Doppelmikroskop
	Olympus	IX73
Mikromanipulator	Sutter Instruments	MPC-325
Aufnahmekammer und Inline-Heizung	Warner Instruments	TC-324C
Anderes Instrument
Mikropipettenabzieher	Sutter Instrument	P-1000
Aufnahmekammer	Warner Instruments	RC-26G oder hausgemachte Kammer
Borosilikat-Kapillarglas mit Filament	Sutter Instrument / Harvard Apparatur	BF150-86-10
Schwingungsisolationstisch	TMC	63544
Digital Camare	HAMAMASTU	ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU
strong>Reagenzien zur Isolierung
RPMI 1640 medium	Gibco	22400089
Penicillin/Streptomycin	Gibca	15140112
IMDM	ATCC	30-2005
IMDM	Gibco	C12440500BT
Kollagenase I	Sigma	C0130
Kollagenase II	Sigma	C6885
5-α-Dihydrotestosteron	Medchemexpress	HY-A0120
Fötales Rinderserum	Steinbock	FBS-12A
Mikropipetten interne Lösungen (K+-basierte Lösung) (pH 7,2, 280-295 mOsm)
KCl, 35mM	Sigma/diverse	V900068
MgCl2 · 6H2O, 2mM	Sigma/diverse	M2393
EGTA, 0,1mM	Sigma/diverse	E4378
HEPES, 10mM	Sigma/ diverse	V900477
K-Gluconat, 100mM	Sigma/diverse	P-1847
Mg-ATP, 3mM	Sigma/diverse	A9187<
strong>Die standardmäßige externe Aufzeichnung physiologischer Salzlösung (PSS) (pH 7,4, 300-310 mOsm)
NaCl, 140mM	Sigma/diverse	V900058
KCl, 4,7mM	Sigma/diverse	V900068
CaCl2, 2,5mM	Sigma/diverse	V900266
MgCl2 · 6H2O, 1,2mM	Sigma/diverse	M2393
NaH2PO4, 1,2mM	Sigma/diverse	V900060
HEPES, 10mM	Sigma/diverse	V900477
Glukose, 10mM	Sigma/diverse	V900392
Zur pH-Einstellung
NaOH	Sigma/diverse	V900797	Reinheit >=97%
KOH	Sigma/diverse	60371	Reinheit >=99,99%

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