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Methodenartikel

Neonatal Murine Cochlear Explant Technik als

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⸱

DOI:

10.3791/55704

⸱

8. Juni 2017

 ,  , 
1Eaton Peabody Laboratories, Department of Otolaryngology, Massachusetts Eye and Ear, 2Department of Otolaryngology, Harvard Medical School, 3Department of Otolaryngology, Vienna General Hospital, Medical University of Vienna, 4Harvard Program in Speech and Hearing Bioscience and Technology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Vorbereitung, Kultur, Behandlung und Immunfärbung von neonatalen murinen Cochlea-Explantaten zu demonstrieren. Die Technik kann als In-vitro- Screening-Tool in der Hörforschung genutzt werden.

Zusammenfassung

Während es in den vergangenen Jahrzehnten bemerkenswerte Fortschritte in der Hörforschung gegeben hat, gibt es noch keine Heilung für den sensorineuralen Hörverlust (SNHL), eine Bedingung, die typischerweise eine Beschädigung oder einen Verlust der empfindlichen mechanosensorischen Strukturen des Innenohrs beinhaltet. Ausgefeilte In-vitro- und Ex-vivo- Assays haben sich in den letzten Jahren entwickelt, was es ermöglicht, eine zunehmende Anzahl von potentiell therapeutischen Verbindungen zu screenen und gleichzeitig die Ressourcen zu minimieren und die Bemühungen um die Entwicklung von Kuren für SNHL zu beschleunigen. Obwohl homogene Kulturen bestimmter Zelltypen weiterhin eine wichtige Rolle in der aktuellen Forschung spielen, verlassen sich viele Wissenschaftler nun auf komplexere organotypische Kulturen von murinen inneren Ohren, die auch als Cochlea-Explantate bekannt sind. Die Erhaltung organisierter Zellstrukturen im Innenohr erleichtert die in situ- Bewertung verschiedener Komponenten der Cochlea-Infrastruktur, einschließlich innerer und äußerer Haarzellen, Spiralganglion-Neuronen, NeurItes und unterstützende Zellen. Hier präsentieren wir die Vorbereitung, Kultur, Behandlung und Immunfärbung von neonatalen murinen Cochlea-Explantaten. Die sorgfältige Vorbereitung dieser Explantate erleichtert die Identifizierung von Mechanismen, die zu SNHL beitragen und ein wertvolles Instrument für die Hörforschungsgemeinschaft darstellen.

Einleitung

Sensorineural Hörverlust (SNHL) spiegelt Schäden am Innenohr oder aufsteigender Gehörgang. Während Hörverlust das häufigste sensorische Defizit bei Menschen 1 ist , existieren heilende Therapien noch nicht 2 . Obgleich Cochlear- oder auditorische Hirnstammimplantate ein gewisses Maß an Hörvermögen für Patienten mit schwerer bis tiefgehender SNHL wiederherstellen können, ist das Hören, das von diesen Geräten zur Verfügung gestellt wird, immer noch sehr verschieden von dem "natürlichen" Gehör, vor allem bei Versuchen, die Sprache im Lärm zu verstehen oder Musik zu hören.

Während die Haarzelldegeneration seit langem als die primäre Konsequenz traumatischer auditorischer Ereignisse ( z. B. Exposition gegenüber lautem Rauschen) angesehen wird, gibt es wachsende Hinweise darauf, dass die Synapsen, die Informationen von Haarzellen zum Hörnerv übermitteln, mindestens ebenso anfällig für akustisches Trauma 3 sind , 4 , 5 > , 6 Da menschliche audiometrische Schwellenwerte, der aktuelle Goldstandard für die Auswertung der Hörfunktion, keine spezifische Zellschädigung im Innenohr vorhersagen, sind so bald wie möglich raffinierte Werkzeuge erforderlich, um die zelluläre Degeneration so schnell wie möglich zu erkennen und eine adäquate Behandlung einzuleiten 7 .

Vielversprechende pharmazeutische Behandlungen für Hörverlust werden oft in homogenen Zellkulturen in vitro getestet, aber solche Systeme präzisieren die Cochlea-Mikroumgebung nicht genau. Cochlear-Zellen sind bekannt, um trophische Faktoren zu sezern, die andere Zelltypen innerhalb der Cochlea 8 , 9 beeinflussen, ein entscheidendes in vivo- Verfahren, das verloren geht, wenn das Organ von Corti 10 , 11 oder Spiral-Ganglion-Neuronen (SGNs) 12 isoliert oder kultiviert wird Molekulare Marker werden analysiertEf "> 13. In vivo- Studien, die für die Validierung von In-vitro- Daten notwendig sind, um neue, personalisierte Behandlungen für Hörverlust bei der Verfolgung von" Präzisionsmedizin "zu schaffen, erfordern erhebliche Ressourcen und Zeit. Dies ist besonders wichtig bei der Betrachtung Wie viel Aufwand für die Vervollkommnung und Durchführung von Mittelohr- oder Rundfenster-Membran-Injektionen mit Hörtests und die anschließende Zerlegung von Cochlear-Vollmontagen erforderlich ist. Das effiziente Screening von vielversprechenden Verbindungen in organotypischen Ex-vivo- Kulturen, die als Cochlea-Explantate bekannt sind, bietet eine wirtschaftliche und zuverlässige Alternative 14 , 15 , 16 , 17 .

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll, mit dem bearbeitete Cochlea-Explantate erzeugt, gepflegt und ausgewertet werden können. Spezielle Anwendungen für dieses Modell werden unterstrichen, einschließlich seiner Verwendung in der ScreeningVon potentiell therapeutischen Verbindungen und der vergleichenden Bewertung von Virusvektoren für die Gentherapie. Ein Ex-vivo- Explantat-Ansatz ermöglicht es Forschern, die Effekte einer gegebenen Behandlung auf verschiedene Zellpopulationen in situ zu visualisieren, die Identifizierung von zelltypspezifischen Mechanismen und die anschließende Verfeinerung von zielgerichteten Therapeutika zu erleichtern.

Insgesamt bietet diese Technik ein Modell, um die Cochlea ex vivo zu studieren, während sie ein vitales Übersprechen zwischen den sehr unterschiedlichen Zelltypen, die in der Cochlea koexistieren, bewahrt werden.

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Protokoll

Das Studienprotokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) von Massachusetts Eye und Ear genehmigt. Die Experimente wurden nach dem Ethikkodex der World Medical Association durchgeführt.

1. Vorbereitung der Dissektion

  1. Vorbereitung der chirurgischen Tabelle
    1. Verwenden Sie 70% Ethanol, um den chirurgischen Tisch zu desinfizieren.
    2. Lege zwei unversöhnliche Vorbereitungspads neben dem Mikroskop auf.
    3. Bereiten Sie das Instrumentenfach vor, einschließlich der hitze-sterilisierten Bedienschere, eines Skalpellgriffes, eines Mikromessers und einer Pinzette (jeweils zwei # 4 & # 55). Legen Sie die Instrumententafel und eine 50 mm breitblättrige Petrischale auf eine nicht sterile Unterlage.
    4. Erhalten Sie eine sterile # 15 Skalpell Klinge; Ein abdichtbarer Plastikbeutel oder -behälter (zur Entsorgung der Schlachtkörper im Einklang mit den institutionellen Richtlinien); Eis in einem Eimer; Und kalte, sterile Hank's Balanced Salt Solution (HBSS). Lege diese Gegenstände auf dieAndere nonsterile Pad
    5. Übertragen Sie die HBSS in ein 50 ml Plastiklaborrohr und legen Sie es auf Eis.
  2. Vorbereitung der Kultur
    1. Bereiten Sie alle Materialien in einer laminaren Strömungshaube vor. Für jede vier Exemplare, setzen vier autoklavierte 10 mm runde Glasabdeckungen in die vier Einlagen der 35 mm 4-well Petrischale.
    2. Für jede 4 Exemplare wird ein Gesamtvolumen von 300 μl, bestehend aus folgendem in einem Mikrozentrifugenröhrchen, vermischt: 10 μl Gewebeklebstoff, 285 μl NaHCO 3 und 5 μl NaOH.
    3. 40 μl der resultierenden Lösung auf jeden Deckzettel geben und dort mindestens 20 min bei RT ablassen; Diese Lösung kann für mehrere Stunden auf dem Deckglas belassen werden, kann aber nicht O / N bleiben.
    4. Legen Sie eine oder zwei 35 mm 4-well Petrischale in einer 10 cm Petrischale, um zwei Barrieren gegen Verschmutzung zu schaffen.
    5. Bereiten Sie Kulturmedium mit 98% Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1% N-2 und 1% Ampicillin (65 μl pro Vertiefung in einem (Mikro-) Zentrifugenröhrchen). Die Lösung vor 25 ° C auf 25 ° C erwärmen.

2. Murine Cochlear Explant Dissection

  1. Enthauptung der neonatalen Maus
    1. Erhalten Sie eine 60-mm-Plastik-Petrischale und sprühen Sie 70% Ethanol in den Deckel, so dass die Oberfläche nass ist.
    2. Gießen Sie kaltes HBSS aus dem Kunststoff-Laborrohr in den unteren Teil des 60-mm-Plastiks und die 50 mm klare Wand aus Glas-Petrischale. Lagern Sie das Plastiklaborrohr und beide Petrischalen auf Eis, um das Gewebe kalt zu halten, wann immer es nicht zerlegt wird.
    3. Lege eine P3 - P5 - gealterte neonatale Maus auf Eis in einen Cutoff - Finger eines Latexhandschuhs und warte, bis die Hypothermie den Verlust des Bewusstseins (ca. 1-3 min) induziert.
    4. Entkuppeln Sie die Maus schnell mit einer Arbeitsschere und entsorgen Sie den Körper in der versiegelbaren Plastiktüte. Setzen Sie den abgetrennten Neugeborenenkopf in die70% Ethanol im Deckel der 60 mm Plastik-Petrischale.
  2. Makroskopische Dissektion des Schläfenbeins
    1. Entfernen Sie die Haut des Schädels, indem Sie einen oberflächlichen Schnitt vom vorderen bis zum hinteren Ende (direkt über die Sagittalnaht) mit dem Skalpellblatt machen.
    2. Schneiden Sie beide äußeren Gehörgänge mit dem Skalpellblatt und falten Sie die Haut nach vorne, um den ganzen Schädel auszusetzen.
      HINWEIS: Obwohl für dieses Schritt kein Dissektionsmikroskop benötigt wird, kann es für eine verbesserte Visualisierung verwendet werden.
    3. Öffnen Sie den Schädel entlang der Sagittal Naht mit dem # 15 Skalpell Klinge. Achten Sie darauf, den Schädel zu schneiden, indem Sie die Klinge vorsichtig von vorne nach hinten nach oben bewegen und die Kompression der Cochleae vermeiden.
      HINWEIS: Der Schädel sollte in diesem Alter nicht verknöchert werden und sollte leicht schneiden.
    4. Entfernen und verwerfen Sie die Schnauze, indem Sie einen vertikalen Schnitt direkt hinter den Umlaufbahnen mit dem # 15 Skalpell machenKlinge.
      HINWEIS: Der hintere Teil des Schädels sollte noch das Gehirn und die Cochleae enthalten.
    5. Entsorgen Sie das Vorderhirn, Kleinhirn und Hirnstamm durch stumpfe Dissektion mit # 4 Pinzette.
  3. Mikroskopische Extraktion der Cochleae
    1. Stellen Sie das Mikroskop (6,5fache Vergrößerung) und die Lichtquelle ein, indem Sie die Pinzette unter den Geltungsbereich stellen und die Beleuchtung und den Fokus optimieren.
    2. Legen Sie die beiden Hälften des Schädels in die 60 mm Plastik-Petrischale, die mit kaltem HBSS gefüllt ist.
    3. Vollständig die Cochlea / e ausstellen, die als angrenzend an die umgebende Stapedialarterie (eine gewundene Arterie innerhalb des Schläfenbeins) identifizierbar ist, und das Orgel aus dem Schläfenbein mit Hilfe der # 4 Pinzette unverblümt trennen.
    4. Übertragen Sie die Cochlea in die 50 mm, klarwandige, Petrischale mit Glasboden und legen Sie die Schale unter das Mikroskop.
    5. Legen Sie die 60 mm Plastik Petrischale mit der anderen Hälfte des Schädels auf Eis.
    6. Entfernen Sie die Cochlea aus dem Vestibularsystem und zerlegen Sie sorgfältig die Cochlear-Otic-Kapsel (typisch knorpelig in diesem Alter) mit # 4 Pinzette. Verwenden Sie # 55 Pinzette für alle weiteren Schritte.
  4. Endschritte der Gewebeverarbeitung
    1. Weiter mit der Verarbeitung des Innenohrgewebes durch sorgfältiges Trennen des Spiralbandes an das Orgel von Corti aus dem Rest der Cochlea und dem Modiolus mit dem Mikromesser oder zwei Pinzetten.
      1. In den dunkleren, lichtdurchlässigen Bereich an der Felsspalte zwischen dem Spiralband und dem Haarzellenbereich schneiden und mit dem darauffolgenden Entfernen des Spiralbandes fortfahren, indem man ihn am grundsätzlichsten anfängt und ihn bei gleichzeitiger Verschiebung sanft abwickelt.
    2. Positionieren Sie die Probe, um eine längliche, sagittale Ansicht der Cochlea zu erhalten und die Cochlea in zwei bis drei Abschnitte unter Verwendung des Mikromessers zu schneiden, wobei diese Abschnitte als die apikale (mittlere) und b klassifiziert werdenAsal dreht sich Entfernen Sie das Gewebe überlegen und unterhalb der tatsächlichen Schicht von Haarzellen und Neuriten, um ein Cochlea-Explantatstück zu erreichen, das horizontal auf der Petrischale liegen kann.
      HINWEIS: Eine angemessene Größe für eine stabile Haftung an der Kulturschale ist etwa die Hälfte einer Cochlear-Umdrehung.
    3. Entfernen Sie die Tectorialmembran, eine sehr dünne lichtdurchlässige Schicht, die dem Organ des Corti unmittelbar überlegen ist, indem Sie sie sanft mit einer Pinzette abschälen.
    4. Entfernen Sie die Membran von Reissner, die den SGNs überlegen ist, indem Sie sie mit einer Pinzette auf beiden Seiten berühren und sie abschälen.
      HINWEIS: Entfernen Sie alle seitlich angeordneten beschädigten Haarzellen, indem Sie sie mit dem Mikromesser abschneiden.

3. Übertragen von Exemplaren auf die Kulturplatten

  1. Entfernen Sie die 45 μl Gewebeklebstofflösung aus den vier Deckgläschen. Waschen Sie jeden Deckel mit 50 μl sterilem H 2 O. Aspirieren Sie das Wasser.
  2. Hebe die 1-ml-Pipette auf. Die Pipettenspitze mit ca. 120 μl DMEM benetzen, um zu verhindern, dass die Probe an der Innenseite der Spitze anhaftet.
  3. Übertragen Sie die Proben einzeln mit der 1-ml-Pipette. Pipettieren Sie maximal 70 μl aus der HBSS-gefüllten, kleinen, klarwandigen, mit Petritornen versehenen Petrischale und legen Sie die Probe zusammen mit der Flüssigkeit auf eine der 4 Inlays (vorbereitet mit Deckgläschen) in die 4-Well-Petrischale .
  4. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop (50fache Vergrößerung), dass sich die Probe in der richtigen Ausrichtung befindet. Stellen Sie sicher, dass der Bereich der Haarzellen, von dem die Tectorialmembran entfernt wurde, nach oben zeigt. Sicherstellen, dass die Basilarmembran zusammen mit dem beschnittenen, basalen Teil des Modiolus nach unten weist und an dem Deckglas haftet.
    1. Wenn die Probe bei der Inspektion umgedreht wird, legen Sie die HBSS ab, die in der Pipettenspitze in die Einlage verbleibt, und positionieren Sie das Stück, bis es richtig ausgerichtet ist.
      NEINTE: Dies verhindert, dass Haarzellen in Kulturmedium ohne strukturelle Unterstützung aus dem Deckglas schweben, was zu Degeneration führen könnte.
  5. Setzen Sie überschüssiges HBSS mit der 1-ml-Pipette ein. Warten auf 15 s.
  6. 25 μl des vorbereiteten warmen Kulturmediums (98% DMEM, 1% N-2 und 1% Ampicillin) direkt auf die Probe pipettieren. Achten Sie darauf, das Exemplar nicht mit der Pipette zu berühren. Ersetzen Sie die inneren und äußeren Petrischalenabdeckungen und inkubieren Sie O / N bei 37 ° C.
  7. Setzen Sie alle Lagerlösungen an ihre richtigen Stellen zurück, entsorgen Sie Schlachtkörper und Restmüll, dekontaminieren Sie den chirurgischen Tisch nach institutionellen Richtlinien ( z. B. mit Ethanol oder Hypochlorit), reinigen und autoklavieren Sie die Instrumente und entsorgen Sie die Scharfe im entsprechenden Behälter .

4. Hinzufügen von endgültigen Kulturmedien und Substanzen von Interesse

ANMERKUNG: Cochlea-Explantate sind für 10-16 Stunden später bereit.

  1. Vorbereitung einer MischungVon 97% DMEM, 1% fötalem Rinderserum (FBS), 1% N-2 und 1% Ampicillin (65 μl pro Vertiefung in einem Mikrozentrifugenröhrchen, Erwärmen der Lösung auf 25 ° C vor Gebrauch).
  2. Fügen Sie andere Substanzen für die Lösungen für die jeweiligen Behandlungsgruppen hinzu. Wenn fluoreszierende Substanzen zugegeben werden ( zB grün fluoreszierende Proteine ​​(GFP) -exprimierende Viren, wurde in einer neueren Publikation eine Konzentration von 10 10 GC Adeno-assoziierten Viren (AAVs) für 48 h in 50 μl) verwendet Licht.
  3. Übertragen Sie die Cochlea-Explantat-haltigen Petrischalen aus dem Inkubator und legen Sie sie unter die laminare Strömungshaube.
  4. Aspirieren Sie das alte Kulturmedium (ohne FBS) mit der Pipette aus den Inlays.
  5. Fügen Sie 60 μl pro Vertiefung des vorbereiteten Warmkultur- (Behandlungs-) Mediums (97% DMEM, 1% FBS, 1% N-2, 1% Ampicillin und die interessierenden Stoffe) hinzu.
  6. Legen Sie die Petrischale wieder in den Inkubator (37 ° C).
  7. Ansicht rEgal unter dem Mikroskop, um Anzeichen einer Kontamination, zelluläre Migration oder Ablösung des Cochlea-Explantats zu identifizieren und Färbung nach maximal 7 Tagen durchzuführen.

5. Immunfluoreszenz - Tag 1

  1. Vorbereitung der Blockierungslösung (94% Phosphat-gepufferte Saline (PBS), 5% normales Ziegen- oder Pferdeserum (NGS / NHS, abhängig von den sekundären Antikörpern) und 1% nichtionisches Tensid (siehe Tabelle der Materialien )) und Bestand Antikörper-Lösung (98,6% PBS, 1% NHS und 0,4% nichtionisches Tensid mit den jeweiligen Antikörpern).
    ANMERKUNG: Antikörper umfassen Kaninchen anti-Myo7A bei einer Konzentration von 1: 400+ (Myosin 7A, für innere und äußere Haarzellen) und Maus anti-TuJ1 1: 200+ (β-Tubulin, für SGNs) ODER Maus (IgG1) anti -CtBP2 1: 200+ (C-terminales Bindungsprotein, für Presynapse), Maus (IgG2a) anti-PSD95 1: 50+ (postsynaptische Dichte, für postsynapse) und Hühner anti-NF-H 1: 1000+ (Neurofilament, Für SGNs und Nervenfasern). "+" MeaNs "oder höher".
  2. Das Kulturmedium mit einer Pipette ausspülen. Achten Sie darauf, das Exemplar nicht zu berühren.
  3. Unter der Laminar-Flow-Kapuze spülen Sie die Cochlea-Explantate zweimal mit sterilem PBS aus und legen die Exemplare für 5 min nach jeder Wäsche auf einen Shaker.
  4. Fixieren Sie das Gewebe in 4% Paraformaldehyd (PFA - VORSICHT) für 20 min auf dem Shaker (unter der Kapuze). Aspirieren Sie die PFA.
  5. Tragen Sie 60 μl PBS auf die Cochlea-Explantate und legen Sie die Petrischale auf einen Shaker für 5 min. Aspirieren Sie die PBS. Wiederholen Sie 3x.
  6. Legen Sie die Cochlea-Explantate in eine präparierte Sperrlösung (94% PBS, 5% NHS und 1% nichtionisches Tensid) für 30 min auf Shaker.
  7. Legen Sie die Cochlea-Explantate in eine vorbereitete Antikörper-Lösung (98,6% PBS, 1% NHS und 0,4% nichtionisches Tensid) mit den jeweiligen primären Antikörpern (Vortex vor Gebrauch) O / N auf einem Zähler bei RT.
    HINWEIS: Wickeln Sie die Petrischalen mit feuchten Papiertüchern ein, die in Plastikfolie eingeschlossen sind (oder Aluminiumfolie, wenn das hinzugefügte SolutIon enthält fluoreszierende Materialien wie GFP-exprimierende Viren), um das Geschirr feucht zu halten und die Verdampfung der Antikörperlösung O / N zu verhindern.

6. Immunfluoreszenz - Tag 2

  1. Bereiten Sie den 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) -Färbung (300 nM) vor und verwenden Sie die Stamm-Antikörper-Lösung, um die richtigen sekundären Antikörper-Mischungen zu erhalten, die komplementär zu den primären Antikörpern in Schritt 5.1 sind. (IgG1) 488 1: 200+ und Ziegen-Anti-Maus 568 1: 200+ ODER Ziegen-Anti-Maus (IgG1) 568 1: 1000+, Ziegen-Anti-Maus (IgG2a) 488 1: Und Ziegen-Anti-Huhn 647 1: 200+ ODER Phalloidin 568 1: 200+ (für innere und äußere Haarzellen)).
  2. Ansaugen der primären Antikörperlösung.
  3. Tragen Sie 60 μl PBS auf die Cochlea-Explantate und legen Sie die Petrischale auf einen Shaker für 5 min. Aspirieren Sie die PBS. Wiederholen Sie 3x.
  4. Legen Sie die Cochlea-Explantate in die vorbereitete Antikörper-Lösung (98,6% PBS, 1% NHS und 0,4% nichtionisches Tensid) mit der ResPektive sekundäre Antikörper (Vortex vor Gebrauch) für 1,5 h auf einem Theke und vor Licht schützen.
  5. Aspirieren Sie die sekundäre Antikörperlösung und spülen Sie die Cochlea-Explantate mit einem DAPI-Fleck aus (Platzieren auf einem Shaker für 1 Minute und dann aspirieren).
  6. Tragen Sie 60 μl PBS auf die Cochlea-Explantate und legen Sie die Petrischale auf einen Shaker für 5 min. Aspirieren Sie die PBS. Wiederholen Sie 3x.
  7. Verwenden Sie Pinzetten, um Deckgläser mit Proben aus der 4-Well-Platte zu entfernen, tauchen Sie sie in einen mit destilliertem H 2 O gefüllten Empfänger und trocknen Sie die Deckgläser, indem Sie sie vertikal mit Papiertüchern in Berührung bringen.
  8. Legen Sie einen Tropfen Antifade-Montagemedium auf den Objektträger und umdrehen Sie die Deckgläser, um das nach unten gerichtete Gewebe in das Medium einzutauchen.
  9. Dichtung des Deckglases mit klarem Nagellack, der den Rand umgibt (ohne die Probe unter dem Glas zu zerkleinern). Lassen Sie die Rutschen flach in einem überdachten Bereich weg von Licht für 15 - 20 min bis trocken und thSie in eine Schachtel legen oder unter dem konfokalen Mikroskop untersuchen.
    HINWEIS: Die Fluoreszenzfärbung wird am besten durch die Aufbewahrung der Objektträger bei 4 oder -20 ° C erhalten.

7. Konfokale Bildgebung

  1. Erhalten Sie einen Überblick und gezoomte Bilder für die Orgel der Region Corti, einschließlich Neuriten und SGNs.
    HINWEIS: Standardeinstellungen für den Imaging-Prozess: Format von 1.024 x 1.024 Pixeln, Geschwindigkeit von 400 Hz, Frame-Durchschnitt von 3, 20% Gesamt-Laserintensität und meist 20X und 63X Objektiv mit Öleintritt (potentiell kombiniert mit 2fachem Digitalzoom). Die Kanaleinstellungen für das DAPI-, Myo7A- und TuJ1-Färbeprotokoll sind oben skizziert: 405 5% DAPI, "Smart Gain" 766.8V, "Smart Offset" 0,0% - 488 15% Fluoresceinisothiocyanat (FITC), "Smart Gain" 622.2V , "Smart Offset" 0,0% - 561 13% Tetramethylrhomadinisothiocyanat (TRITC), "Smart Gain" 562.4V, "Smart Offset" 0,0%.
  2. Fügen Sie die Bilder in einem Z-Stack mit demSoftware, um eine z-Achsenprojektion zu erhalten.

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Ergebnisse

Während viele Protokolle auf Orgel von Corti explants konzentrieren, versucht diese Technik, die Anatomie der gesamten Cochlear-Umdrehung zu bewahren, einschließlich der SGNs. Dies gibt den Forschern die Möglichkeit, die Auswirkungen einer gegebenen Behandlung auf Neuriten und Somata von SGNs zusätzlich zu dem Organ von Corti zu analysieren. Die Durchführung einer Sektion, die einen Teil des Modiolus bewahrt, wie hier beschrieben, ist technisch anspruchsvoller, als das Organ von Corti al...

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Diskussion

Die Forscher müssen die Dissektionstechnik perfektionieren, bevor sie Experimente mit Cochlea-Explantaten durchführen. Haarzellen werden häufig während der Sezierungen, die früh in der Lernkurve durchgeführt wurden, beschädigt, und ein besonders problematisches Moment für ihre Integrität ist die Entfernung der tectorialen Membran, die ständige Hände, richtige Werkzeuge und Erfahrung erfordert. Um Zeit und Ressourcen zu sparen, sollte eine visuelle Kontrolle unter dem Sektionsmikroskop durchgeführt werden und möglicherwe...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Institute of Deafness und anderen Kommunikationsstörungen Zuschüsse R01DC015824 (KMS) und T32DC00038 (Unterstützung SD), die Abteilung für Verteidigung gewähren W81XWH-15-1-0472 (KMS), die Bertarelli Foundation (KMS), die Nancy Sayles Day Foundation (KMS) und das Lauer Tinnitus Research Center (KMS). Wir danken Jessica E. Sagers, BA für aufschlussreiche Kommentare zum Manuskript.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Ampicillin, NatriumsalzInvitrogen11593-027
Anti-CtBP2-Antikörper, Maus (IgG1)BD Transduction Laboratories612044
Anti-Myo7A-Antikörper, KaninchenProteus Biosciences25-6790
Anti-NF-H-Antikörper, HuhnEMD MilliporeAB5539
Anti-PSD95 Antikörper, Maus (IgG2a)Antikörper Inc.75-028
Anti-TuJ1 Antikörper, MausBioLegend801202
Cell-Tak Zell- und Gewebekleber, 5 mgCorning354241
CELLSTAR 15 mL Zentrifugenröhrchen, konischer Boden, Graduierung, sterilGreiner Bio-One188161
CELLSTAR Zellkulturschale, 100 x 20 mmGreiner Bio-One664160
CELLSTAR Zellkulturschale, 35 x 10 mm, 4 InnenringeGreiner Bio-One627170
CELLSTAR Zellkulturschale, 60 x 15 mmGreiner Bio-One628160
CELLSTAR 50 mL Zentrifugenröhrchen, konischer Boden, Graduierung, sterilGreiner Bio-One227261
KlarlackElektronenmikroskopie Sciences72180
Klarwand-Schalen mit Glasboden (Glas 40 mm), PELCO®, Hülse/20, 50 x 7 mmTed Pella Inc.14027-20
Deckgläser, rund, Glas, 10 mm Durchmesser, Dicke #1, 0,13 - 0,16 mmTed Pella Inc.
DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid)Thermo Fisher ScientificD1306
Destilliertes Wasser, 500 mLThermo Fisher Scientific15230-162 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), hoher Glukosegehalt, Pyruvat, kein Glutamin, 500 mLThermo Fisher Scientific10313-039
Dumont #4 PinzettenFine Science Tools11241-30
Dumont #55 Pinzette (Dumostar)Fine Science Tools11295-51
Ethylalkohol (EtOH), rein, 200 Proof, wasserfrei, ≥ 99,5 %Sigma-Aldrich459836-1 l
fötales Kälberserum (FBS), qualifiziert, USDA-zugelassene Regionen, 500 mLThermo Fisher Scientific10437-028Aliquot in 50 mL Röhrchen und Lagerung in -20 ° G; C Gefrierschrank
Ziege Anti-Chicken-647 SekundärantikörperThermo Fisher ScientificA-21469
Ziege Anti-Maus (IgG)-568 SekundärantikörperThermo Fisher ScientificA-11004
Ziege Anti-Maus (IgG1)-568 SekundärantikörperThermo Fisher ScientificA-21124
Ziege Anti-Maus (IgG2a)-488 SekundärantikörperThermo Fisher ScientificA-21131
Anti-Kaninchen-488 SekundärantikörperThermo Fisher ScientificR37116
H2O, steril, EmbryoMax Reinstwasser, 500 mLEMD MilliporeTMS-006-B
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), Calcium, Magnesium, kein Phenolrot, 500 mLThermo Fisher Scientific14025-092
Instrumententablett mit Deckel EdelstahlMountainside MedicalTechMedMed4255
Mikromesser (Präpariermesser) – abgewinkelt 30°;Fine Science Tools10056-12
Objektträger, VistaVision, farbcodiert, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm dick, weiß, 72 StückVWR16004-382
N-2 Supplement (100X), 5 mLThermo Fisher Scientific17502-048
NaHCO3, Natriumbicarbonat 7,5% Lösung, 100 mLThermo Fisher Scientific25080-094
NaOH, Natronlauge, 1 LThermo Fisher ScientificSS266-1
Normales Pferdeserum (NHS)Invitrogen16050130
OperationsschereRoboz Surgical Instruments Co.RS-6806
Paraformaldehyd (PFA), Reagenzqualität, kristallinesSigma-AldrichP6148Vor der Verwendung: Festlegung von Standardarbeitsanweisungen auf der Grundlage online verfügbarer Protokolle
PBS, pH 7,4, 500 mLThermo Fisher Scientific10010-023 Autoklav vor dem Gebrauch
Phalloidin, Alexa Fluor 568 Thermo Fisher ScientificA12380
Vorbereitungspad, unsteril Medline05136CS
Safe-Lock Mikrozentrifugenröhrchen, Polypropylen, 0,5 mLEppendorf022363719Autoklav vor dem Gebrauch
Safe-Lock Mikrozentrifugenröhrchen, Polypropylen, 1,5 mLEppendorf022363204Autoklav vor dem Gebrauch
Skalpellklingen - #15Fine Science Tools10015-00
Skalpellgriff - #4Fine Science Tools10004-13
Stemi 2000-C StereomikroskopZeiss 000000-1106-133
TCS SP5 KonfokalmikroskopLeicaN/A
Triton-X (nichtionisches Tensid)IntegraT756.30.30
VectaShield Antifading-Eindeckmedium für FluoreszenzVector Laboratories, Inc.H-1000
Reißverschlusstasche, wiederverschließbar, 4 x 6'' - 2 mm starkZipline0609132541599
260368

Referenzen

  1. Mathers, C., Smith, A., Concha, M. Global burden of hearing loss in the year. World Health Organization (WHO). , Available from: http://www.who.int/healthinfo/statistics/bod_hearingloss.pdf (2000).
  2. Geleoc, G. S., Holt, J. R. Sound strategies for hearing restoration). Science. 344 (6184), 1241062(2014).
  3. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
  4. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).
  5. Makary, C. A., Shin, J., Kujawa, S. G., Liberman, M. C., Merchant, S. N. Age-related primary cochlear neuronal degeneration in human temporal bones. J Assoc Res Otolaryngol. 12 (6), 711-717 (2011).
  6. Jensen, J. B., Lysaght, A. C., Liberman, M. C., Qvortrup, K., Stankovic, K. M. Immediate and delayed cochlear neuropathy after noise exposure in pubescent mice. PLoS One. 10 (5), (2015).
  7. Landegger, L. D., Psaltis, D., Stankovic, K. M. Human audiometric thresholds do not predict specific cellular damage in the inner ear. Hear Res. , 83-93 (2016).
  8. Wang, H. C., et al. Spontaneous Activity of Cochlear Hair Cells Triggered by Fluid Secretion Mechanism in Adjacent Support Cells. Cell. 163 (6), 1348-1359 (2015).
  9. Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development. Neural Dev. 6, (2011).
  10. Dinh, C., et al. Short interfering RNA against Bax attenuates TNFalpha-induced ototoxicity in rat organ of Corti explants. Otolaryngol Head Neck Surg. 148 (5), 834-840 (2013).
  11. Mazurek, B., Yu, Y., Haupt, H., Szczepek, A. J., Olze, H. Salicylate modulates Hsp70 expression in the explanted organ of Corti. Neurosci Lett. 501 (2), 67-71 (2011).
  12. Kao, S. Y., et al. Loss of osteoprotegerin expression in the inner ear causes degeneration of the cochlear nerve and sensorineural hearing loss. Neurobiol Dis. 56, 25-33 (2013).
  13. Jan, T. A., Chai, R., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. Isolating LacZ-expressing cells from mouse inner ear tissues using flow cytometry. J Vis Exp. (58), e3432(2011).
  14. Haque, K. D., Pandey, A. K., Kelley, M. W., Puligilla, C. Culture of embryonic mouse cochlear explants and gene transfer by electroporation. J Vis Exp. (95), e52260(2015).
  15. Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. J Vis Exp. (36), (2010).
  16. Mulvaney, J. F., Dabdoub, A. Long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants. J Vis Exp. (93), e52101(2014).
  17. Wang, Q., Green, S. H. Functional role of neurotrophin-3 in synapse regeneration by spiral ganglion neurons on inner hair cells after excitotoxic trauma in vitro. J Neurosci. 31 (21), 7938-7949 (2011).
  18. Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
  19. Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage. Sci Rep. 5, 18599(2015).
  20. Soares, V. Y., et al. Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells. Neuro Oncol. , (2016).
  21. Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (3), 321-329 (2013).
  22. Yuan, Y., et al. Ouabain-induced cochlear nerve degeneration: synaptic loss and plasticity in a mouse model of auditory neuropathy. J Assoc Res Otolaryngol. 15 (1), 31-43 (2014).
  23. Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears. J Neurosci. 35 (19), 7509-7520 (2015).
  24. Barclay, M., Constable, R., James, N. R., Thorne, P. R., Montgomery, J. M. Reduced sensory stimulation alters the molecular make-up of glutamatergic hair cell synapses in the developing cochlea. Neuroscience. , 50-62 (2016).
  25. Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).
  26. Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).
  27. Shu, Y., et al. Identification of Adeno-Associated Viral Vectors That Target Neonatal and Adult Mammalian Inner Ear Cell Subtypes. Hum Gene Ther. , (2016).
  28. Kao, S. Y., Soares, V. Y., Kristiansen, A. G., Stankovic, K. M. Activation of TRAIL-DR5 pathway promotes sensorineural degeneration in the inner ear. Aging Cell. 15 (2), 301-308 (2016).

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