Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Vorbereitung, Kultur, Behandlung und Immunfärbung von neonatalen murinen Cochlea-Explantaten zu demonstrieren. Die Technik kann als In-vitro- Screening-Tool in der Hörforschung genutzt werden.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Neonatal Murine Cochlear Explant Technik als
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Während es in den vergangenen Jahrzehnten bemerkenswerte Fortschritte in der Hörforschung gegeben hat, gibt es noch keine Heilung für den sensorineuralen Hörverlust (SNHL), eine Bedingung, die typischerweise eine Beschädigung oder einen Verlust der empfindlichen mechanosensorischen Strukturen des Innenohrs beinhaltet. Ausgefeilte In-vitro- und Ex-vivo- Assays haben sich in den letzten Jahren entwickelt, was es ermöglicht, eine zunehmende Anzahl von potentiell therapeutischen Verbindungen zu screenen und gleichzeitig die Ressourcen zu minimieren und die Bemühungen um die Entwicklung von Kuren für SNHL zu beschleunigen. Obwohl homogene Kulturen bestimmter Zelltypen weiterhin eine wichtige Rolle in der aktuellen Forschung spielen, verlassen sich viele Wissenschaftler nun auf komplexere organotypische Kulturen von murinen inneren Ohren, die auch als Cochlea-Explantate bekannt sind. Die Erhaltung organisierter Zellstrukturen im Innenohr erleichtert die in situ- Bewertung verschiedener Komponenten der Cochlea-Infrastruktur, einschließlich innerer und äußerer Haarzellen, Spiralganglion-Neuronen, NeurItes und unterstützende Zellen. Hier präsentieren wir die Vorbereitung, Kultur, Behandlung und Immunfärbung von neonatalen murinen Cochlea-Explantaten. Die sorgfältige Vorbereitung dieser Explantate erleichtert die Identifizierung von Mechanismen, die zu SNHL beitragen und ein wertvolles Instrument für die Hörforschungsgemeinschaft darstellen.
Einleitung
Sensorineural Hörverlust (SNHL) spiegelt Schäden am Innenohr oder aufsteigender Gehörgang. Während Hörverlust das häufigste sensorische Defizit bei Menschen 1 ist , existieren heilende Therapien noch nicht 2 . Obgleich Cochlear- oder auditorische Hirnstammimplantate ein gewisses Maß an Hörvermögen für Patienten mit schwerer bis tiefgehender SNHL wiederherstellen können, ist das Hören, das von diesen Geräten zur Verfügung gestellt wird, immer noch sehr verschieden von dem "natürlichen" Gehör, vor allem bei Versuchen, die Sprache im Lärm zu verstehen oder Musik zu hören.
Während die Haarzellde....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Das Studienprotokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) von Massachusetts Eye und Ear genehmigt. Die Experimente wurden nach dem Ethikkodex der World Medical Association durchgeführt.
1. Vorbereitung der Dissektion
- Vorbereitung der chirurgischen Tabelle
- Verwenden Sie 70% Ethanol, um den chirurgischen Tisch zu desinfizieren.
- Lege zwei unversöhnliche Vorbereitungspads neben dem Mikroskop auf.
- Bereiten Sie das Instrumentenfach vor, einschließlich der hitze-sterilisierten Bedienschere, eines Skalpellgriffes, eines Mikromessers und einer Pinzette (jeweils zwei ....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Während viele Protokolle auf Orgel von Corti explants konzentrieren, versucht diese Technik, die Anatomie der gesamten Cochlear-Umdrehung zu bewahren, einschließlich der SGNs. Dies gibt den Forschern die Möglichkeit, die Auswirkungen einer gegebenen Behandlung auf Neuriten und Somata von SGNs zusätzlich zu dem Organ von Corti zu analysieren. Die Durchführung einer Sektion, die einen Teil des Modiolus bewahrt, wie hier beschrieben, ist technisch anspruchsvoller, als das Organ von Corti al.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Die Forscher müssen die Dissektionstechnik perfektionieren, bevor sie Experimente mit Cochlea-Explantaten durchführen. Haarzellen werden häufig während der Sezierungen, die früh in der Lernkurve durchgeführt wurden, beschädigt, und ein besonders problematisches Moment für ihre Integrität ist die Entfernung der tectorialen Membran, die ständige Hände, richtige Werkzeuge und Erfahrung erfordert. Um Zeit und Ressourcen zu sparen, sollte eine visuelle Kontrolle unter dem Sektionsmikroskop durchgeführt werden und möglicherwe.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Institute of Deafness und anderen Kommunikationsstörungen Zuschüsse R01DC015824 (KMS) und T32DC00038 (Unterstützung SD), die Abteilung für Verteidigung gewähren W81XWH-15-1-0472 (KMS), die Bertarelli Foundation (KMS), die Nancy Sayles Day Foundation (KMS) und das Lauer Tinnitus Research Center (KMS). Wir danken Jessica E. Sagers, BA für aufschlussreiche Kommentare zum Manuskript.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Ampicillin, Natriumsalz | Invitrogen | 11593-027 | |
| Anti-CtBP2-Antikörper, Maus (IgG1) | BD Transduction Laboratories | 612044 | |
| Anti-Myo7A-Antikörper, Kaninchen | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Anti-NF-H-Antikörper, Huhn | EMD Millipore | AB5539 | |
| Anti-PSD95 Antikörper, Maus (IgG2a) | Antikörper Inc. | 75-028 | |
| Anti-TuJ1 Antikörper, Maus | BioLegend | 801202 | |
| Cell-Tak Zell- und Gewebekleber, 5 mg | Corning | 354241 | |
| CELLSTAR 15 mL Zentrifugenröhrchen, konischer Boden, Graduierung, steril | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR Zellkulturschale, 100 x 20 mm | Greiner Bio-One | 664160 | |
| CELLSTAR Zellkulturschale, 35 x 10 mm, 4 Innenringe | Greiner Bio-One | 627170 | |
| CELLSTAR Zellkulturschale, 60 x 15 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| CELLSTAR 50 mL Zentrifugenröhrchen, konischer Boden, Graduierung, steril | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Klarlack | Elektronenmikroskopie Sciences | 72180 | |
| Klarwand-Schalen mit Glasboden (Glas 40 mm), PELCO®, Hülse/20, 50 x 7 mm | Ted Pella Inc. | 14027-20 | |
| Deckgläser, rund, Glas, 10 mm Durchmesser, Dicke #1, 0,13 - 0,16 mm | Ted Pella Inc. | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Destilliertes Wasser, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 15230-162 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), hoher Glukosegehalt, Pyruvat, kein Glutamin, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| Dumont #4 Pinzetten | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #55 Pinzette (Dumostar) | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Ethylalkohol (EtOH), rein, 200 Proof, wasserfrei, ≥ 99,5 % | Sigma-Aldrich | 459836-1 l | |
| fötales Kälberserum (FBS), qualifiziert, USDA-zugelassene Regionen, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 mL Röhrchen und Lagerung in -20 ° G; C Gefrierschrank |
| Ziege Anti-Chicken-647 Sekundärantikörper | Thermo Fisher Scientific | A-21469 | |
| Ziege Anti-Maus (IgG)-568 Sekundärantikörper | Thermo Fisher Scientific | A-11004 | |
| Ziege Anti-Maus (IgG1)-568 Sekundärantikörper | Thermo Fisher Scientific | A-21124 | |
| Ziege Anti-Maus (IgG2a)-488 Sekundärantikörper | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| Anti-Kaninchen-488 Sekundärantikörper | Thermo Fisher Scientific | R37116 | |
| H2O, steril, EmbryoMax Reinstwasser, 500 mL | EMD Millipore | TMS-006-B | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), Calcium, Magnesium, kein Phenolrot, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Instrumententablett mit Deckel Edelstahl | Mountainside Medical | TechMedMed4255 | |
| Mikromesser (Präpariermesser) – abgewinkelt 30°; | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Objektträger, VistaVision, farbcodiert, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm dick, weiß, 72 Stück | VWR | 16004-382 | |
| N-2 Supplement (100X), 5 mL | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| NaHCO3, Natriumbicarbonat 7,5% Lösung, 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 25080-094 | |
| NaOH, Natronlauge, 1 L | Thermo Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Normales Pferdeserum (NHS) | Invitrogen | 16050130 | |
| Operationsschere | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6806 | |
| Paraformaldehyd (PFA), Reagenzqualität, kristallines | Sigma-Aldrich | P6148 | Vor der Verwendung: Festlegung von Standardarbeitsanweisungen auf der Grundlage online verfügbarer Protokolle |
| PBS, pH 7,4, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoklav vor dem Gebrauch |
| Phalloidin, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Vorbereitungspad, unsteril | Medline | 05136CS | |
| Safe-Lock Mikrozentrifugenröhrchen, Polypropylen, 0,5 mL | Eppendorf | 022363719 | Autoklav vor dem Gebrauch |
| Safe-Lock Mikrozentrifugenröhrchen, Polypropylen, 1,5 mL | Eppendorf | 022363204 | Autoklav vor dem Gebrauch |
| Skalpellklingen - #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Skalpellgriff - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Stemi 2000-C Stereomikroskop | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| TCS SP5 Konfokalmikroskop | Leica | N/A | |
| Triton-X (nichtionisches Tensid) | Integra | T756.30.30 | |
| VectaShield Antifading-Eindeckmedium für Fluoreszenz | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Reißverschlusstasche, wiederverschließbar, 4 x 6'' - 2 mm stark | Zipline | 0609132541599 |
Referenzen
- Mathers, C., Smith, A., Concha, M. Global burden of hearing loss in the year. World Health Organization (WHO). , Available from: http://www.who.int/healthinfo/statistics/bod_hearingloss.pdf (2000).
- Geleoc, G. S., Holt, J. R. Sound strategies for hearing restoration). Science. 344 (6184), 1241062(2014).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
