Die Isolierung der Seiten Bevölkerung in Myc-induzierte T-Zell akute lymphatische Leukämie in Zebrabärbling

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine Technik, die die Seitenpopulation Zellen aus einem Zebrabärbling Modell der myc-induzierten T-Zell-akuter lymphatischer Leukämie (T-ALL) zu isolieren. Diese Seite Bevölkerung Test ist hochempfindlich und wird für Zebrabärbling T-ALL beschrieben, aber es kann auch auf andere maligne und nicht-maligne Zebrabärbling Zelltypen anwendbar.

Zusammenfassung

Heterogene Zellpopulationen, aus entweder gesund oder malignes Geweben, enthalten können eine Population von Zellen durch eine Differential Fähigkeit gekennzeichnet können den DNA-bindenden Farbstoff Hoechst 33342 Diese „Neben population“ von Zellen Efflux durchflusszytometrischen Verfahren nach dem Hoechst 33342 identifiziert werden, unter Verwendung von Farbstoff wird durch ein Ultraviolett (UV) Laser angeregt. Die Seiten Bevölkerung vieler Zelltypen enthält Stamm- oder Vorläuferähnlichen Zellen. Allerdings sind nicht alle Zelltypen haben eine identifizierbare Seiten Bevölkerung. Danio rerio, Zebrafisch, hat eine robusten in vivo Modell der T-Zell - akuter lymphatischer Leukämie (T-ALL), aber ob dieser Zebrabärbling T-All hat eine Seitenpopulation ist unbekannt. Das hier beschriebene Verfahren beschreibt, wie die Seiten Bevölkerung Zellen in Zebrabärbling T-ALL zu isolieren. Um zu beginnen, die T-ALL in Zebrabärbling wird über die Mikroinjektion von TOL2 Plasmide in eine Zellstadium Embryonen erzeugt. Sobald die Tumoren, bei denen auf eine Stufe gewachsen erweitern sie in mehr als der Hälfte des animal der Körper, die T-ALL-Zellen können geerntet werden. Die Zellen werden dann mit Hoechst 33342 und untersucht durch Durchflußzytometrie für Seitenpopulation Zellen gefärbt. Dieses Verfahren hat breite Anwendungen in Zebrabärbling T-ALL-Forschung. Zwar gibt es keine bekannten Zelloberflächenmarker in Zebrabärbling , dass diese Nebenpopulation Zellen Krebsstammzellen-like, in vivo Transplantation funktionelle Assays sind möglich sind , bestätigen , ob. Darüber hinaus könnte Single-Cell-Transkriptomik die genetischen Merkmale dieser Seite Bevölkerung Zellen zu identifizieren, angewandt werden.

Einleitung

Die Seiten Population Assay nutzt die verbesserte Fähigkeit bestimmter Zellen in einem Gewebe, das den DNA-bindenden Farbstoff Hoechst 33342 aufgrund des hohen Niveaus von der ATP-Bindungskassette (ABC) -Transporter-Proteine ​​auf der Zellmembran Efflux. Die Zellen, die den Farbstoff Hoechst 33342 Efflux können duale Wellenlänge Durchflusszytometrieanalyse identifiziert werden, nachdem der Farbstoff durch einen UV-Laser angeregt wird. Dieser Test wurde zuerst ¹ murinen hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) zu identifizieren , verwendet, aber es seither verwendet Stamm- / Vorläuferzellpopulationen in vielen Geweben und Krebserkrankungen zu identifizieren (in Bezug auf 2 überprüft). Allerdings sind nicht alle Populationen von Zellen haben eine Seitenpopulation, und nicht alle sind für die Populationen Seiten Stamm- / Vorläuferzellen angereichert ist.

Der Zebrabärbling ist ein leistungsfähiges wirbel genetisches Modellsystem zur Untersuchung von menschlichem Krebs ^{3, 4,} mit einer Reihe von Vorteilen gegenüber herkömmlichem Maus - models von Krebs. Zebrabärblingembryonen werden extern befruchtet und sind optisch klar, erleichtert und die Transgenese in vivo Beobachtung von pathologischen Prozessen, einschließlich Krebs Initiierung und Progression. Bis heute zu den Seiten Population Assay potentiellen Stamm- oder Vorläuferzellen erkennen wurde lediglich an der Nierenmark in Zebrabärbling angewendet worden HSCs zu identifizieren, und nicht auf irgendwelche Zebrabärbling Krebsmodellen ^{5, 6.}

Der Zebrafisch Modell der T-Zell - akute lymphatische Leukämie (T-ALL) ist morphologisch und genetisch ähnlich der menschlichen T-ALL ^{7, 8, 11.} T-ALL ist eine aggressive Bösartigkeit , die beim Menschen macht 10-15% der Kinder und 25% der erwachsenen alle Fälle ^9. Während die Behandlung von T-ALL verbessert hat, ist Rückfall immer noch üblich und ist mit einer schlechten Prognose verbunden. T-ALL-Tumoren sind heterogeneous und enthält viele verschiedene Subpopulationen von Tumorzellen, einschließlich Leukämie initiierende Zellen (LICs). LICs ist durch ihre Fähigkeit definiert, um den gesamten Tumor aus einer einzelnen Zelle, und die Frequenz des LICs in einer Tumorzellpopulation nachwachsen kann durch Verpflanzen unterschiedliche Zell Dosen in Empfänger über eine Grenzverdünnung Transplantation Assay (LDA) berechnet werden. Während LDA Experimente haben in Zebrabärbling durchgeführt worden , um die Häufigkeit des LICs ^{8, 10, 11} zu berechnen, wird diese Feststellung im Nachhinein gemacht und für die Isolierung von prospektiven LICs nicht gestattet. Deshalb, um ein Verfahren prospektiv eine Population von Krebsstammzellaktivität angereichert zu isolieren fehlt. Identifizierung und Isolierung von Nebenpopulation Zellen von Zebrabärbling T-All ist der erste Schritt auf dem Weg, diesen Mangels Adressierung.

Das Protokoll hier vorgestellten, wie effizient T-ALL-Tumoren in Zebr erzeugenafish Verwendung TOL2-vermittelte Transgenese, ernten die T-ALL-Zellen Tumoren und verfärben sie mit Hoechst 33342 die Seiten Population von Zellen zu identifizieren. Zukunft in - vivo - Experimente mit Zebrabärbling T-ALL könnten , ob die Seitenpopulation Zellen für LICs angereichert oder andere Stamm- oder Vorläuferähnlichen Eigenschaften.

Protokoll

Alle Verfahren mit Zebrabärbling wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der University of Chicago genehmigt. Die University of Chicago wird von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) akkreditiert.

1. Erstellen und Isolierkanne fluoreszenzmarkierten T-ALL-Zellen in Zebrabärbling

1. Mikroinjektion in syngenen Zebrabärblingembryonen
   1. Im Handel erhältlichen Kits, Isolat Kreis rag2: c-myc und rag2: green fluorescent protein (rag2: GFP) Plasmid - DNA - invertierte terminale Repeats von TOL2 Transposase (siehe die Tabelle von Materialien für die Quelle von Plasmid - DNA) ¹² und Eluieren der DNA erfasst enthaltend in sterilem Wasser.
      HINWEIS: GFP wird in dieser Studie verwendet wurden, aber jedes fluoreszierendes Protein funktioniert.
   2. Bereiten Sie pCS2-Transposase (TOL2) RNA
      1. Isolieren TOL2 Plasmid DNA im Handel erhältlichen Kits (siehe ter Tabelle von Materialien für die Quelle von Plasmid - DNA) ¹² und die DNA in sterilem Wasser eluieren.
      2. Inkubiere 1 ug TOL2 DNA bei 37 ° C für 1 h mit 5 Einheiten Restriktionsenzym NotI in dem geeigneten Puffer das Plasmid linearisieren. Wärme-Inaktivierung der NotI bei 65 ° C für 20 min.
      3. Transkribieren der RNA TOL2 mit SP6 RNA - Polymerase aus dem linearisierten DNA mit einer handelsüblichen RNA - Transkription unter Verwendung von ¹³ - Kit. Lagern Sie die RNA in Einweg- Aliquots bei -80 ° C.
   3. Bereiten Sie die Einspritzmischung auf Eis durch Zugabe von 250 ng rag2: c-myc - Plasmid - DNA, 250 ng von rag2: GFP - Plasmid - DNA, 150 ng von TOL2 RNA und 0,5 & mgr; l Phenolrot. Stellen Sie die Lautstärke auf 10 & mgr; l mit Nuklease-freien Wasser.
   4. Einzuzuspritzen ~ 1 nL Injektionsmischung in die Zelle von einem Ein-Zell-Stadium syngenen Zebrafischembryo mit einem Mikroinjektor und die Nadel aus einer Glaskapillare gezogen, folgenden zuvor estabVerfahren ^{8 , 14} .
      HINWEIS: Synogene Zebrafiken, die durch Parthenogenese ^{15 erzeugt} werden, werden hier verwendet, um genetische Heterogenität und Immunabstoßung nach der Transplantation zu eliminieren. Jedoch kann auch Wildtyp-Zebrafisch oder irgendein gewünschter Stamm verwendet werden.
   5. Entfernen Sie tote, unterentwickelte oder fehlerhafte Embryonen bei 24 h und 48 h nach der Injektion ¹⁶ .
   6. Legen Sie den Spritzfisch auf das Fischsystem bei 6 Tagen nach der Injektion und heben Sie sie nach Standardprotokoll ^{6 an} .
2. Screening injiziert Zebrafisch und Überwachung des Tumorwachstums
   1. Nach 21 Tagen nach der Injektion eine einzelne injizierte Larve in ein Tröpfchen Embryo-Medium auf eine Petrischale geben und GFP-Fluoreszenz mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop (Anregungsbandpass: 470/40, Emissionsbandpass: 525/50) ⁸ auftragen.
      HINWEIS: Zebrafisch-Larven, die have integriert sowohl rag2: c-myc und rag2: GFP wird einen grün fluoreszierenden Thymus (positiver Fisch) hat und bereits die Expansion maligner grün fluoreszierender Zellen außerhalb des Thymus aufweist. Alle Fische mit einem GFP + Thymus wird weitergehen ein GFP + T-ALL zu entwickeln. Die Larven, die keine grün fluoreszierenden Zellen (negativer Fisch) haben keine Integration der Plasmide demonstrieren.
   2. Trennen Sie den negativen Fisch (basierend auf einem Mangel an Fluoreszenz) in einen anderen Tank und Monitor wieder die Fische bei 28 und 35 Tagen nach der Injektion. Bei 28 und 35 Tage nach der Injektion, betäuben die Fische mit 0,02% gepuffertem Tricaine (MS-222) in Fischsystemwasser vor dem Screening.
   3. Platzieren Sie jede Zebrabärbling Larve, die für ein fluoreszierend markiertes Thymus oder einen fluoreszierend markierten Tumor in einem einzelnen Tank zur Überwachung von Tumorwachstum dreimal pro Woche positiv ist.
3. Sammlung von fluoreszenz T-ALL - Zellen aus dem Primärtumor Fisch markierte
   1. Vorbereiten mindestens 20 ml 10% hitzeinaktiviertem fötalen Rinderserum in 0.9x phosphatgepufferter Salzlösung (FBS / PBS).
   2. 1 ml FBS / PBS auf ein Fläschchen von Heparin-Natriumsalz (300 Einheiten).
   3. Wählen Sie Fisch Lager Tumoren in mehr als 50% des Körpers, oder jene Fische, die Schwierigkeiten beim Essen oder Schwimmen. Opfern, um die Fische, indem sie mit Tricaine oder durch Eiswasser Tauchdosierung. Bestätigen Tod durch Mangel eines Kiemen Bewegung und Herzschlag.
   4. Verwenden Sie eine Rasierklinge den Kopf des Fisches zu entfernen.
   5. Wäscht den Hohlraum des Fisches mit der Heparin-Lösung überschüssige rote Blutzellen zu entfernen.
      1. Mit einer Pipette injiziert 100 ul Heparin-Lösung (hergestellt in Schritt 1.3.2) in die Körperhöhle des Fisches. Entfernt alle Flüssigkeit, die aus Leckagen (es wird Blutzellen enthalten) und Pipetten es in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
      2. Verwenden Sie eine frische Pipettenspitze wieder in den Körper zu waschen. Führen mindestens drei Wäschen, oder bis die Flüssigkeit, die frei schwappt aus bl erscheintOod
      3. Verwerfen Sie alle Flüssigkeiten aus den Waschungen in den Schritten 1.3.5.1 und 1.3.5.2, da sie nicht in weiteren Analysen verwendet werden.
   6. Sammle die Leukämiezellen.
      1. 100 μl FBS / PBS in die Körperhöhle des Fisches injizieren.
      2. Tragen Sie sanften Druck auf die Außenseite des Körpers des Fisches mit der Pipettenspitze, um die Tumorzellen zu quetschen / herauszudrücken.
         HINWEIS: Wenn dieser Schritt mit einem Seziermikroskop durchgeführt wird, sind die aus der Körperhöhle verschütteten Tumorzellen offensichtlich.
      3. Sammeln Sie die Flüssigkeit und die Zellen aus jeder Waschung in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen.
      4. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.6.1-1.3.6.3 bis die meisten Tumorzellen gesammelt werden (meist 5-10 mal). Sammle alle Tumorzellen in das gleiche 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen. Halten Sie die Zellen bei Raumtemperatur.
   7. Mischen Sie die gesammelten Tumorzellen aus Schritt 1.3.6 durch sanftes Pipettieren, um die Klumpen der Zellen zu dissoziieren. Filtriere die Zellsuspension durch eine 40 & mgr; m-Mesh-Filter. Das Filter wird 1-2 mal mit 100 ul FBS / PBS. Halten Sie die Zellen bei Raumtemperatur.
   8. Mix 2 & mgr; l der Zellsuspension mit 18 ul Trypanblau (0,4%, 1:10 verdünnt und filtriert) in einem neuen Röhrchen. Last 10 & mgr; l auf einem Hämozytometer und zählen die Anzahl der lebenden (non-blue) fluoreszierende Zellen die Anzahl der isolierten Tumorzellen zu berechnen.
      HINWEIS: Nicht-blau GFP-negative Zellen sind wahrscheinlich normal, nicht-malignen T-Zellen und nicht gezählt werden sollen. Mindestens 2 x 10 ⁶ Zellen benötigt , um die Zellen mit Hoechst 33342 zu färben.

2. Die Färbung der fluoreszenzmarkierten T-ALL-Zellen mit Hoechst 33342 identifizieren die Seiten Bevölkerung

1. Man verdünnt im Verhältnis 1:10 mit Hoechst 33342 Nuklease-freien H ₂ O , die 1 mg / ml Arbeitskonzentration zu bilden. Speichert den Farbstoff bei 4 ° C und im Dunkel.
2. Vorbereiten eine 100-mM-Lösung von Verapamil durch Auflösen von 49,1 mg in 1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO).
   HINWEIS: Verapamil ist ein Inhibitor von ABC-Transportern und ist eine wichtige Kontrolle für Nebenbevölkerungsexperimente. Das Hinzufügen von Verapamil zu Proben hemmt die Fähigkeit der ABC-Transporter, den Hoechst 33342-Farbstoff auszulöschen. Daher wird eine wahre Seitenpopulation verschwinden, wenn Verapamil dem Stichprobe hinzugefügt wird.
3. Wasserbad auf 28 ° C stellen.
4. Bereiten Sie Proben und Kontrollen im Dunkeln vor, indem Sie Zellen und Lösungen für fluoreszenzaktivierte Zellsortierer (FACS) Röhrchen hinzufügen.
   1. Bereiten Sie die Proben durch Zugabe von 10 ⁶ Zellen, 15 μl 1 mg / ml Hoechst 33342 und 2,5 μl DMSO zu einem FACS-Röhrchen vor. Stellen Sie die Lautstärke auf 1 mL mit FBS / PBS ein.
   2. Bereiten Sie die Kontrollen vor, indem Sie 10 ⁶ Zellen, 15 μl 1 mg / ml Hoechst 33342 und 2,5 μl 100 mM Verapamil zu einem FACS-Röhrchen hinzufügen. Stellen Sie die Lautstärke auf 1 mL mit FBS / PBS ein.
      HINWEIS: Es wird ein Minimum von 10 ⁶ Zellen / Probe empfohlen, aber die Färbung von mehr Zellen wird bevorzugt, besonders wenn die Seitenbevölkerung bevorzugt istIonen-Zellen werden zur weiteren Analyse sortiert. 10 ⁶ Zellen / ml nicht überschreiten und die Hoechst 33342-Konzentration bei 15 μg / ml aufrechterhalten. Wenn 10 x 10 & ^sup6; Zellen gefärbt sind, beträgt das Gesamtreaktionsvolumen 10 ml.
5. In einem 28 ° C Wasserbad im Dunkeln für 120 min inkubieren.
6. Nach der Inkubation legen Sie die Zellen sofort auf Eis und halten sie im Dunkeln.
7. Pellet die Zellen bei 4 ° C für 6 min bei 300 x g. Den Überstand entfernen. Mit 1 ml FBS / PBS waschen.
8. Pellet die Zellen bei 4 ° C für 6 min bei 300 x g. Den Überstand entfernen. Resuspendieren der Zellen in 1 ml FBS / PBS.
9. Bei 4 ° C bis zur Zellsortierung aufbewahren.
10. 15 min vor der Zellsortierung 2 μl Propidiumjodid (PI) -Stand (1 mg / ml) zu je 1 ml FBS / PBS (Endkonzentration: 2 μg / ml) zugeben. Gut mischen.

3. Verwenden Sie FACS, um die Seitenbevölkerung innerhalb der fluoreszenzbeschrifteten T-ALLE Zellpopulation zu finden

1. Analysieren Sie die gefärbten Zebrafisch-T-ALL-Zellsuspensionen auf einem Zellsortierer, der mit einem UV-Laser für Hoechst 33342-Farbstoffanregung und einem 488-nm-Laser für die PI-Anregung und zum Nachweis der GFP + T-ALL-Zellen ausgestattet ist.
2. Bestimmen Sie ein Tor für die Live, GFP + T-ALL Zellen.
   1. Verwenden Sie Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC), um Schutt zu verteilen.
      HINWEIS: FSC wird verwendet, um Zellgröße zu unterscheiden und SSC wird verwendet, um die Granularität der Zelle zu unterscheiden.
   2. Verwenden Sie FSC und SSC Breite, um Dubletten zu unterscheiden.
      HINWEIS: Es gibt drei Komponenten, die durch die Durchflusszytometer-Detektoren identifiziert werden: Fläche, Höhe und Breite. Der Bereich wird typischerweise verwendet, um die Fluoreszenz der Zelle zu messen. Breite misst die Flugzeit und ist doppelt so breit, wenn zwei Zellen zusammengeklammert sind.
   3. Für lebende Tumorzellen zeichnen Sie ein Gate um die Zellen positiv für GFP und negativ für PI mit den entsprechenden Detektoren ( zB FITC für GFP und PerCP Cy5-5 für PI).
3. Im Live-Zelltor messen Sie die Hoechst 33342 Fluoreszenz durch die Hoechst Blue und Hoechst Red Bandpassfilter (450/50 bzw. 670/30).
   HINWEIS: Die Seitenpopulation, falls vorhanden, wird nach dem Aufstellen offensichtlich sein. Wichtig ist, dass die Seitenpopulation in der Verapamil-Kontrolle verschwinden muss, damit sie als eine echte Seitenpopulation angesehen wird.
4. Bei der Sortierung der Seitenpopulationszellen für weitere Experimente die große Düsenspitze (100 μm) verwenden und die Zellen in ein FACS-Röhrchen sammeln, das 3 ml 100% FBS enthält. Verwenden Sie eine größere Düsenspitze (100 μm) anstelle der kleineren Spitze (70 μm), um die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Sortierung zu verbessern.

Ergebnisse

Um effizient zu fluoreszierenden myc-induzierte T-ALL-Tumoren in Zebrabärbling, zirkuläre DNA-Konstrukte, flankiert von TOL2 Transposase Seiten zu erzeugen kann mit TOL2 RNA coinjiziert. Frühere Studien von der Injektion von linearisierter DNA in Zebrabärblingembryonen berichten über eine 5% Transgene Rate ^8. Mit dem Protokoll TOL2-vermittelte Transgenese umfassen angepasst und reicht Transgenität Raten von 10 bis 44% kann (Tabelle 1) beobachtet w...

Diskussion

Die Seiten Population Assay ist hochempfindlich; Daher kleine Änderungen an dem Protokoll kann in Nachweisseitenpopulation Zellen in einer Schwierigkeit führen. Zuerst wird die Temperatur während des Färbeschritt spezifisch für jedes Tier / Zellensystem. Für Säugetiersystemen wird die Seitenpopulation Assay typischerweise bei 37 ° C ² durchgeführt. Wenn die Zebrabärbling T-ALL-Zellen bei 37 ° C inkubiert wurden, starben viele der Zellen, die diese Inkubationstemperatur inakzeptabel gemacht (Daten...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Syngener Zebrafisch (CG2)			Siehe Mizgireuv et al., 2006
rag2:c-myc-Plasmid			Langenau Laboratory
rag2:GFP-Plasmid konstruiert in de Jong Lab			rag2Promotor aus dem Langenau Laboratory
pCS2-Transposase-Plasmid			Chien
Labor-NotI-HF-Restriktionsenzym	New England Bio-Labs Inc.	R3189S	500 Stück in 25 & Mikro; L
mMessage Machine SP6 Transkriptionskit	Ambion	Thermo Fisher Scientific - AM1340	25 Reaktionen
QIAGEN Plasmid Midi Kit	Qiagen, Inc.	12643
SteREO Discovery V8 Mikroskop	Carl Zeiss Mikroskopie	495015-0008-000
Digitaler Mikroinjektor	Tritech Research	MINJ-D
Nadelhalter aus Messing mit geradem Arm	Tritech Research	MINJ-4
Magnetfuß und Ständer	Tritech Research	MINJ-HBMB
Mikromanipulator	Narishige International	MN153
Glaskapillaren	Sutter Instrument Co.	B100-50-10	10 cm ohne Filament
Flaming/Brauner Mikropipettenabzieher	Sutter Instrument Co.	P-97
Microloader Pipettenspitzen	Eppendorf North America Inc.
Phenolrot-Lösung	Sigma Life Science	P0290	0,5 % Konzentration 100 mL
Kunststoff Transferpipetten	Fisherbrand	137119D	graduiert 7,5 mL Glühbirne
Tricain Methansulfonat (MS-222)	Western Chemical, Inc.	Fisher Scientific - NC0342409	100 g
fötales Rinderserum (FBS)	HyClone Laboratories, Inc.	Fisher Scientific - SH3007103	500 mL
phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Gibco von Life Technologies	1001-023	pH 7,4 (1x) - 500 mL
Heparin-Natriumsalz	Sigma-Aldrich	2106	15 - 300 Stück Fläschchen
40 & Mikro; m Maschenfilter	Falcon Corning Marke	352340	Karton mit 50
Trypanblau	Sigma Life Science	T8154	20 mL - Lösung (0,4%)
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570	10 mL
Verapamil	Sigma Life Science	V4629	1 g
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma Life Science	D8418	100 mL
Propidium Iodide	Life Technologies	P3566	10 mL
FACSAria Fusion Zellsortierer	BD Biosciences
BD FACSDiva 8.0.1	BD Biosciences
FlowJo v10.2	FlowJo, LLC