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Transplantation von Zebrafisch-pädiatrischen Hirntumoren in immune-kompetente Wirte für die Langzeitstudie von Tumorzellverhalten und Drug Response

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DOI:

10.3791/55712

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17. Mai 2017

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1Department of Oncological Sciences and Huntsman Cancer Institute, University of Utah School of Medicine, 2Department of Dermatology, University of Utah Health Sciences Center, Salt Lake City

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Transplantation von Krebszellen ist ein wichtiges Instrument zur Identifizierung von Krebsmechanismen und therapeutischen Reaktionen. Aktuelle Techniken hängen von immune-inkompetenten Tieren ab. Hier beschreiben wir eine Methode zur Transplantation von Zebrafisch-Tumorzellen in immunkompetenten Embryonen zur Langzeitanalyse des Tumorzellverhaltens und in vivo- Arzneimittelwirkungen.

Zusammenfassung

Tumorzelltransplantation ist eine wichtige Technik, um die Mechanismen zu bestimmen, die das Krebszellwachstum, die Migration und die Wirtsreaktion kontrollieren sowie die potentielle Reaktion des Patienten auf die Therapie beurteilen. Die derzeitigen Methoden hängen weitgehend von der Verwendung von syngenen oder immunkompromittierten Tieren ab, um eine Ablehnung des Tumortransplantats zu vermeiden. Solche Verfahren erfordern die Verwendung spezifischer genetischer Stämme, die oft die Analyse von Immun-Tumor-Zell-Interaktionen verhindern und / oder auf spezifische genetische Hintergründe beschränkt sind. Eine alternative Methode in Zebrafisch nutzt ein unvollständig entwickeltes Immunsystem im embryonalen Gehirn vor 3 Tagen, wo Tumorzellen zur Verwendung in Kurzzeit-Assays ( dh 3 bis 10 Tage) transplantiert werden. Allerdings verursachen diese Methoden die Host-Letalität, die die Langzeitstudie des Tumorzellverhaltens und der Wirkstoffreaktion verhindert. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und effiziente Methode für die langfristige orthotopische Transplantation von Zebrafisch Hirntumor Gewebe inZum vierten Ventrikel eines 2 Tage alten immunkompetenten Zebrafischs. Diese Methode erlaubt: 1) Langzeitstudie von Tumorzellverhalten, wie Invasion und Verbreitung; 2) haltbare Tumorreaktion auf Drogen; Und 3) Re-Transplantation von Tumoren für das Studium der Tumor Evolution und / oder die Auswirkungen der verschiedenen genetischen genetischen Hintergründe. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Krebsforscher die Transplantation, Invasion und das Wachstum an entfernten Standorten beurteilen sowie chemische Bildschirme und Zellwettbewerbstudien über viele Monate durchführen können. Dieses Protokoll kann auf Studien anderer Tumortypen erweitert werden und kann zur Aufklärung von Mechanismen der Chemoresistenz und Metastasen verwendet werden.

Einleitung

Die Transplantation von Tumorzellen in immungeschädigte Tiere, insbesondere Maus-Xenotransplantate, ist eine weit verbreitete Technik, die zur Untersuchung von Mechanismen zur Kontrolle der Krebszellproliferation 1 , 2 , des Überlebens, der Invasion und der Metastase 3 , 4 sowie zur Bereitstellung einer Plattform verwendet wird Zum Screening von Medikamenten 5 , 6 , 7 . In jüngster Zeit wurde die Transplantation von primären Tumorproben in immunkompromittierte Mäuse zur Generierung von Patient-Xenotransplantatmodellen (PDX) für diagnostische und präklinische Arzneimittel-Screening-Zwecke verwendet und ist das Rückgrat der personalisierten Arzneimittelinitiative 8 , 9 , 10 , 11 . Allerdings zeigen signifikante Beweise, dass die Modulation des ImmunsystemsStamm kann einen dramatischen Einfluss auf das Tumorverhalten und das Patientenergebnis haben 12 , 13 . Dies hat die Neugestaltung von Xenotransplantat-Techniken getrieben, um "humanisierte" Mäuse einzuschließen, in denen das Immunsystem der Maus durch Co-Transplantation menschlicher Immunzellen mit Tumorzellen rekonstituiert wird. Allerdings ist dieser Ansatz immer noch technisch anspruchsvoll, mit variabler Reproduzierbarkeit und Toxizitäten im Zusammenhang mit der Technik, zusätzlich zu den erheblichen Kosten 14 , 15 . So sind neue Transplantationstechniken in immunkompetenten Tieren erforderlich, um die Entdeckung von immun- und tumorspezifischen Mechanismen der Krebsentwicklung und der Wirkstoffreaktion zu beschleunigen.

Zebrafisch sind ein alternatives Tiermodell für das Studium von menschlichem Krebs, mit über 20 Krebsmodellen jetzt etabliert 16 , einschließlich hoch bösartiges Gehirn 17 , Mela Noma 18 , 19 , 20 und Pankreaskarzinome 21 , 22 sowie viele Leukämien 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Zwei Attribute des Zebrafisch-Systems machen es besonders für die Krebsforschung zugänglich: 1) Die optische Klarheit der lichtdurchlässigen Tiere ermöglicht die direkte Visualisierung von Krebszellverhalten ( dh Proliferation, Überleben, Invasion und Verbreitung) mit einfachen Mikroskopietechniken und 2) Weibliche Zebrafisch kann bis zu 200 Embryonen pro Tag produzieren, so dass die schnelle Skalierung von Tierzahlen für genetische oder Drogen-Screening zu niedrigen Kosten. Darüber hinaus sind die Krebsgenome von Zebrafisch und Menschen hoch konserviert (einschließlich Onkogene und Tumorsuppressorgene)F "> 28, so dass mechanistische und medikamentöse Entdeckungen schnell in Säugetiersysteme umgesetzt werden können. Diese Attribute machen auch den Zebrafisch zu einem idealen Tiermodell für Transplantationstechniken, die die Bildgebung, Skalierbarkeit und niedrige Kosten des Systems nutzen.

Bisherige Tumortransplantationsstudien in immun-kompromittiertem Zebrafisch haben die Identifizierung von Selbsterneuerungsfähigkeiten, Tumor-Malignität und Invasion / Verbreitung erleichtert 11 , 29 . Kurzzeitstudien des Tumorzellverhaltens können nach der Transplantation in γ-bestrahlte Erwachsene durchgeführt werden, deren Immunsysteme für ~ 20 Tage 11 , 30 wirksam unterdrückt werden. Die Behandlung von adultem Zebrafisch mit Dexamethason unterdrückt B- und T-Zellen für bis zu 30 Tage vor Ablehnung 31 . Eine andere, weniger gängige Strategie setzt klonale Zebrafischstämme einDie Langzeituntersuchungen in einem immunkompetenten Wirt ermöglichen 32 . Allerdings wurde nur eine begrenzte Anzahl von Klonstämmen erzeugt und sind aufgrund der niedrigen Fruchtbarkeit schwer zu halten. Darüber hinaus werden die meisten der etablierten Zebrafisch-Tumormodelle in anderen genetischen Hintergründen erzeugt, so dass diese Tumoren nicht in die Klonstämme transplantiert werden können, ohne das Immunsystem 11 , 33 , 34 zu unterdrücken. Neuere Ansätze zur Verbesserung der Langzeit-Transplantationsstudien beinhalten die Entwicklung der rag2 E450fs- Mutantenlinie mit kompromittierten B- und T-Zell-Funktionen, mit denen mehrere Krebsarten erfolgreich transplantiert wurden 35 , 36 . Um die Anforderung an klonale Zebrafisch-Linien oder einen immun-kompromittierten Wirt zu umgehen, haben eine Reihe von Gruppen Frühphasen-Embryonen ( dh > 72 PS) verwendetOst-Befruchtung (hpf)) für die menschliche Tumorzelltransplantation, da diese Embryonen noch kein vollkommenes adaptives Immunsystem 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 entwickelt haben. Allerdings sind diese Methoden auf die kurzfristige Analyse des Tumorzellverhaltens oder der Drogenreaktion (in der Regel weniger als 2 Wochen) beschränkt, da die menschlichen Krebszellen oder die Transplantationstechnik selbst den Wirt töten, Langzeitstudien und Re-Transplantation verhindern.

Dieses Protokoll beschreibt eine modifizierte embryonale Transplantationsmethode in das Lumen des vierten Ventrikels eines 2-Tage-nach-Befruchtung (dpf) Embryo-Gehirns. Es minimiert die Toxizität gegenüber dem Wirt und kann mit Zebrafisch-Hirntumormodellen für die langfristige Verpflanzung von Tumorzellen kombiniert werden. So ist diese Technik alTiefs für die Re-Transplantation von Tumorzellen in neue Wirte über viele Generationen hinweg, erleichtert zukünftige Studien über Tumor-Heterogenität, Wirts- / Immunantworten, Arzneimittelwirkungen oder metastatisches Potential. Diese Methode ist auch einfach, effizient und skalierbar, da bis zu 300 Transplantationen von einem einzelnen Benutzer pro Tag mit bis zu 90% Engagement durchgeführt werden können. Dies ermöglicht die rasche Ausbreitung einzelner Primärtumoren in Hunderte von Embryonen bei 2 dpf für genetische oder Arzneimittel-Screening-Projekte oder um das Hirntumorzellverhalten in verschiedenen Wirtshintergründen über viele Monate direkt zu visualisieren.

Protokoll

Alle Tierverfahren wurden genehmigt und folgten den Tierschutzrichtlinien der Universität Utah Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC # 16-03019).

1. Vorbereitung der Ausrüstung für die Mikroinjektion

  1. Vorbereitung der Einspritzplatte
    1. Eine 50-ml-Lösung von 1,2% in Ei-Wasser gelöstem Agarose (0,6 g / l Aquariumsalz in Umkehrosmose-Wasser + 0,01 mg / l Methylenblau) herstellen. Die Lösung kochen, bis sich die Agarose auflöst und dann durch Zugabe von 0,05 mg / l Methylenblau ergänzt. Gießen Sie 25 ml der Endlösung in eine 10 cm Petrischale und lassen Sie sie sich verfestigen. Legen Sie die restlichen 25 ml Agaroselösung in ein 42 ° C Wasserbad, bis Sie Schritt 1.1.2 fertig sind.
    2. Setzen Sie ein Becher mit 2 Zoll Durchmesser in die Mitte der verfestigten Oberfläche und gießen Sie die restlichen 25 ml 1,2% Agarose.
      HINWEIS: Dies schafft eine Injektionsfläche an der Peripherie der Platte und einen Kern in der Mitte, dieBietet eine Fläche, um die Nadelgröße und die Konsistenz der Tumorsuspension zu testen.
      1. Die Injektionsplatte bei 28 ° C mindestens 30 min vor der Injektion oder bei 4 ° C für die Langzeitlagerung aufbewahren.
  2. Injektionsnadeln vorbereiten.
    1. Machen Sie die Nadeln, indem Sie 10 cm Kapillaren mit einer äußeren Abmessung von 1,2 mm und einer inneren Abmessung von 0,9 mm (ohne Faden) in zwei Nadeln auf einem Nadelabzieher ziehen.
      HINWEIS: Jede Nadel sollte 6 cm lang sein, wobei etwa 1,5 cm des Endes verjüngt ist.
    2. Setzen Sie die Nadel vorsichtig auf eine Mikroskop-Folie, die in Plastik-Paraffin-Folie eingewickelt ist. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um das Ende der Nadel in einem 45 ° -Winkel zu schneiden, um eine Nadel mit einer Öffnung an der Spitze zu schaffen.
      HINWEIS: In der Regel werden 0,1 mm bis 0,3 mm des Nadelendes entfernt. Eine abgeschrägte Spitze ist nicht erforderlich, um die Injektionen durchzuführen.
  3. Bereiten Sie den Mikroinjektionsaufbau vor.
    1. Vereinbaren Sie eine Standard-Mikroinjektion, einschließlich eines Stereomikroskops, eines Manipulators und eines Mikroinjektors für die Transplantation.

2. Vorbereitung von Embryonen zur Transplantation

  1. Sammle bis zu 500 mitfa w2 Embryonen 44 (oder Embryonen von beliebigen anderen Zebrafisch-Genotypen, wie vom Benutzer definiert), wie beschrieben 45 und in einem 28 ° C-Inkubator aufrechterhalten.
  2. Dechorionieren der Embryos bei 24 hpf durch Zugabe von 100 μl 10 mg / ml Protease-Cocktail-Lösung, verdünnt in Ei-Wasser und sanft für ca. 20 min. Spülen Sie die Embryos 3 mal mit frischem Ei Wasser, um die restliche Protease zu entfernen.
  3. Schicken Sie die Embryonen bei 48 hpf für die entsprechende Entwicklungsstufe, wie in den Standard-Staging-Serienkriterien definiert.
    Hinweis: Für die Transplantation sollten nur korrekt inszenierte und morphologisch normale Embryonen verwendet werden.
  4. BetäubenEtwa zwanzig 48-hpf-Embryonen in Ei-Wasser mit 0,002% Tricaine-S in einer Petrischale. Bestätigen Sie die richtige Anästhesie, indem Sie die Beendigung der Bewegung beobachten.

3. Herstellung einer Tumorzelle Suspension

HINWEIS: Zebrafisch-Hirntumormodelle können durch gentechnisch hergestellte Kombinationen von Onkogenen und Tumorsuppressorgenen 17 , 46 , 47 erzeugt werden . Hier wurde das sox10- Promotor- getriebene NRAS WT , p53 zdf1 / zdf1 CNS-PNET Zebrafisch-Modell verwendet, wie vor kurzem beschrieben 17 .

  1. Euthanasieren Sie einen Hirntumor-tragenden Fisch, dessen Tumorbelastung etwa 20% der Gesamtkörpergröße unter Verwendung einer 0,4% Tricaine-S-Überdosierung beträgt, gefolgt von Eintauchen in Eiswasser gemäß IACUC-genehmigten Protokollen.
  2. Den fluoreszenzbeschrifteten Tumor mit einer Rasierklinge und einer Pinzette unter einer Fluoreszenz zerlegenMikroskop mit steriler Technik und platzieren sie in 5 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
    ANMERKUNG: Genaue Dissektionsmethoden werden benutzerdefiniert und abhängig von Tumortyp und Gewebeort. Siehe die aufgeführten Referenzen für detaillierte Verfahren für die Sezierung von verschiedenen Zebrafisch-Organen und Hirntumoren 17 , 48 .
  3. Manuell die Tumormasse mit einer P1000-Pipette stören, bis sich eine einheitliche, trübe Lösung entwickelt. Entfernen Sie große Partikel mit einer Pipettenspitze oder mit einem 40 μm Zellsieb (dies ist tumorabhängig). Die Suspension bei Raumtemperatur 5 min bei 290 xg zentrifugieren und den Überstand entfernen.
    Anmerkung: Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) wird nicht durchgeführt, um Tumorzellen zu isolieren. Dies ermöglicht die Transplantation einer heterogenen Population von Stromaz-, Immun- und Tumorzellen.
  4. Das Tumorzellpellet wird in 100 & mgr; l sterilem PBS resuspendiert und auf ein 1,5 ml-Mikro übertragenZentrifugenröhrchen. Nehmen Sie 5 μl der Zellsuspension und verdünnen Sie es in 250 μl PBS. Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämocytometer. Die Suspension für 3 min bei 290 xg zentrifugieren, den Überstand entfernen und das Pellet in sterilem PBS resuspendieren, um die gewünschte Zellkonzentration zu erhalten.
    HINWEIS: In der Regel werden Zellen, die in 30-40 μl sterilem PBS resuspendiert wurden, eine viskose und opake Lösung (Zellkonzentration ≥ 100 Zellen / nL) ergeben und dazu neigen, die erfolgreichsten Transplantationen zu erzeugen. Die Zelllebensfähigkeit wird nicht beurteilt.
  5. Bewahren Sie die Tumorsuspension während des Transplantationsverfahrens auf einem 28 ° C Wärmeblock auf.

4. Injektion der Tumor-Suspension in den vierten Ventrikel eines 2-dpf-Embryos

  1. Übertragen von 10-20 anästhesierten Embryonen (ab Schritt 2.4) an die Peripherie der Injektionsplatte unter Verwendung einer Transferpipette; Die Embryos sollten seitlich auf die Injektionsplatte fallen, wobei die Ventrikel deutlich sichtbar und zugänglich sind. Verwenden Sie eine abgewinkelte Sonde, um die Embryonen nach Bedarf einzustellen und sie von der Außenkante der Einspritzplatte weg zu positionieren.
  2. Legen Sie 1-2 μl der Tumorzellsuspension in die Injektionsnadel mit Gel laden Pipettenspitzen und legen Sie die Nadel in den Manipulator.
  3. Manuell den Manipulator absenken und die Nadel in einem Winkel von 45 ° halten. Stellen Sie die Knöpfe auf den Mikromanipulator in den x-, y- und z-Richtungen ein, bis die Nadel gerade oben und ca. 5 mm rechts vom Embryokopf liegt. Schauen Sie durch die Okulare des Stereomikroskops und stellen Sie den Mikromanipulator langsam in x-Richtung ein, bis die Nadel den vierten Ventrikel des Embryos durchdringt. Lassen Sie die Nadel nicht das Herz oder das Eigelb durchbohren.
    1. Schieben Sie das Fußpedal an den Mikroinjektor, um die Tumorzelle Suspension zu injizieren.
      HINWEIS: Der Einspritzdruck und die Zeit variieren je nach Nadelbohrung, aber ein guter Ausgangspunkt ist 5 - 10 PSI und 50 - 100 ms.Das Volumen der injizierten Tumorzellen kann mit Standard-Öltropfentechniken durch Injektion in Mineralöl, falls gewünscht, bewertet werden. Injektionen von 500 pL mit einem Tropfendurchmesser von 0,1 mm ergeben typischerweise die besten Ergebnisse.
  4. Spülen Sie die injizierten Embryonen vorsichtig aus der Injektionsplatte und in eine Petrischale mit frischem Eiwasser. Halten Sie die Embryonen in Ei-Wasser für die verbleibenden Verfahren oder bis sie in Tanks gezüchtet werden (wie in Schritt 4.9.1 beschrieben).
  5. Überprüfen Sie die injizierten Embryonen unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop. Vergewissern Sie sich, dass der Einspritzdruck, der Winkel, die Nadelgröße und die Zellsuspensionsviskosität zu Tumorzellen führen, die 25-50% des Ventrikelraums füllen. Passen Sie diese Parameter nach Bedarf an.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.5 für alle verbleibenden Embryonen. Anästhesieren Sie die zusätzlichen Embryonen nach Bedarf (beschrieben in Schritt 2.4).
    ANMERKUNG: Ein erfahrener Benutzer kann bis zu 300 Embryos über 3-4 Stunden injizieren.
  7. Lege die Embryonen zurückDer 28 ° C Inkubator über Nacht.
  8. Am nächsten Tag beurteilen Sie das Überleben des Embryos, indem sie morphologische und physiologische Merkmale untersuchen, wie z. B. normale Herz- und Hirnentwicklung, wie beschrieben.
  9. Zum Screening betäubt man die Embryos, wie in Schritt 2.4 beschrieben, bei 1 Tag nach der Transplantation (dpt).
    1. Verwenden Sie eine Transferpipette, um 4% Methylcellulose auf die Mitte einer Petrischale zu geben und die Embryos dem Methylcellulose-Tropfen zuzugeben. Orientieren Sie die Embryonen (ventrale Seite, die der Lichtquelle zugewandt ist) mit einer abgewinkelten Sonde und einem Bildschirm für eine konsistente Griffgröße mit einem Fluoreszenzmikroskop. Entfernen Sie alle Embryonen mit Tumorzellen, die nicht auf den Ventrikel beschränkt sind, oder solche, die Tumorzellen enthalten, die weniger als 25% des Ventrikelraums ausmachen.
      Anmerkung: Konsequente Instruktion ist definiert als Embryonen mit einer einzigen Tumormasse, die 25-50% des Ventrikelraums umfasst 17 . Zum Screening verwenden Sie eine FluoreszenzTereomikroskop mit einem 1X-Objektiv, einer 0,15 numerischen Apertur, einer Vergrößerung von 0,7-1,6X und einer Belichtungszeit von 50 ms bis 1 s. Für alle Bilder, nutzen Sie den Hellfeld-Kanal zusätzlich zu den GFP oder RFP-Kanal.
    2. Für die Aufrechterhaltung der Tumoren, legen Sie die transplantierten Embryonen in Tanks zu wachsen 45 bei 8 dpf (6 dpt).

5. Imaging transplantierte Embryonen für zelluläre Verhaltensweisen

  1. Anästhesieren Sie die Embryonen bei 3-8 dpf (1-6 dpt) und montieren (dorsale Seite zum Deckglas) in 1,2% niedrigschmelzender Agarose. Führen Sie die Zeitraffer-Bildgebung der eingebauten Embryonen mit einem Laser-Scan-konfokalen Mikroskop für die gewünschte Zeitdauer ein, um zelluläre Verhaltensweisen wie Migration, Zellteilung oder Zell-Zell-Interaktionen nach Bedarf 38 , 43 , 53 zu visualisieren.
    HINWEIS: Verwenden Sie ein Seitenverhältnis von 1.024 x 1.024, eine Scan-Geschwindigkeit von 8 & #181; s / pixel. Verwenden Sie die Scan-Mittelung und definieren Sie die z-Tiefe Dimensionen, um die Erfassung der gesamten Tumormasse (1.000-1.500 μm) zu gewährleisten. Darüber hinaus durchführen 4-Stunden-Zeitraffer-Experimente, die Erfassung eines Bildes alle 10-15 min mit einem 40x Ziel, um invasive Verhaltensweisen zu überwachen. Die Detektorempfindlichkeit variiert in Abhängigkeit von der Intensität der Tumormasse und die Laserleistung wird mikroskopabhängig sein, aber es wird allgemein empfohlen, zwischen 15 und 40% zu sein.
  2. Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, befreit den eingebauten Embryo aus der Agarose mit einer abgewinkelten Sonde und überträgt sie auf eine Petrischale mit frischem Eiwasser.

6. Arzneimittelverabreichung an transplantierte Embryonen und die Beurteilung der Tumorbelastung 17

  1. Anästhesieren von Embryonen bei 3 dpf und orientieren sie in 4% Methylcellulose, wobei die ventrale Seite der Lichtquelle zugewandt ist. Bild der Vorbehandlung Embryonen mit einem Fluoreszenzmikroskop 17 .
  2. PlaDie transplantierten Embryos bei 3 dpf in einer 12-Well-Platte mit 10 Embryonen pro Well in 0,5 ml Ei-Wasser. Füge die entsprechende Menge an Arzneimittel hinzu, um die gewünschte Endkonzentration zu erhalten ( z. B. 50 μM MEK-Inhibitor) und die Embryos zu einem 28 ° C-Inkubator zurückgeben. Am nächsten Tag, entfernen Sie das medikamentenbehandelte Ei-Wasser mit einer dünnen Bohrung Transfer-Pipette und fügen Sie frische Behandlung. Wiederholen Sie diese täglich, bis die Embryonen 8 dpf erreichen.
  3. Bei 8 dpf, entfernen Sie die Embryonen aus der medikamentösen Behandlung und legen Sie sie in frisches Ei Wasser. Anästhesieren der Embryonen und Orientierung (ventrale Seite der Lichtquelle) in 4% Methylcellulose. Bild-Embryonen nach der Behandlung mit einem Fluoreszenzmikroskop. Quantifizieren Sie den Tumorbereich mit entsprechender Software, wie beschrieben 17 .
  4. Trennen Sie die Embryonen je nach Behandlung und legen Sie sie in Tanks zu wachsen. Nach 4-9 Wochen betäubt man den Fisch und beurteilt sie für die Gesamttumorbelastung mit einem Standard-Fluoreszenz-Stereomikroskop, wie dBeschriftet 17 .

Ergebnisse

Tumortransplantation und Engagement

Ein schematisierter Umriß des Verfahrens ist in Fig. 1 dargestellt. Fluoreszenzmarkierte Tumorzellen werden aus der primären Organstelle extrahiert und eine Einzeller-Suspension wird zur Transplantation in den vierten Ventrikel von 2-dpf- mitfa- w2- Zebrafisch-Embryonen 44 erzeugt . Fig. 2 zeigt die repräsentativen Ergebnisse für dieses Verfahren unter Verwendung eines Zebrafisch-Modells des primären neuralen ektodermalen Tumors des zentralen Nervensystems (CNS-PNET), bei dem der sox10- Promotor die Expression von Wildtyp-NRAS oder aktiviertem NRAS fördert, das an mCherry in p53- fehlenden oligoneuralen Vorläuferzellen fusioniert ist 17 Die Mitfa w2 Zebrafisch 44 Mutante, die Melanophoren fehlt, wurde verwendet, um leichter zu visualisierenDie Tumorzellen nach Transplantation und / oder ins Erwachsenenalter. Andere Pigmentmutanten könnten auch verwendet werden, um zusätzliche bildgebende Klarheit, wie Casper 50 , bereitzustellen. Bereits nach 24 h nach der Transplantation können Tumorzellen in das umgebende Hirngewebe eindringen (Abbildung 2A , 3 dpf, Pfeile). Tumor-Transplantate wachsen weiter im Ventrikel und umgebenden Hirngewebe über die nächste Woche (Abbildung 2A , 8 dpf). Zu diesem Zeitpunkt kann auch im Bereich der Nieren Fluoreszenz beobachtet werden (Abbildung 2A , Sternchen). Dies kann auf die Nieren zurückzuführen sein, die den Zelltrümmer aus der Transplantation filtrieren, was im Einklang mit früheren Studien steht, die Fluoreszenzfarbstoffe als Assay zur Bewertung der Nierenfunktion 51 verwenden. Tumorzellen weiter zu vermehren und eindringen, so dass von 28 dpf eine Tumormasse im gesamten Zebrafisch-Gehirn gesehen werden kann (Abbildung 2A , 28 dpf).

Diese Technik ermöglicht die schnelle Transplantation von Tumorzellen in Hunderte von Embryonen mit reproduzierbarer Konsistenz, da die Injektionsstelle mit minimaler Schädigung des Wirts genau ausgerichtet werden kann. Eine repräsentative Gruppe von Embryonen, die mit mCherry-markierten Hirntumorzellen transplantiert wurden, ist in der oberen Platte von 2B gezeigt . Tumor-Engagement wird in der Regel in 80-90% der Embryonen erreicht, und Tumor-Transplantationen bestehen bis zum Erwachsenenalter; Drei repräsentative Beispiele sind in den Bodenplatten von Fig. 2B gezeigt . Damit können die Tumortransplantationen über mehrere Generationen geerntet und eingefroren oder neu transplantiert werden.

Tumorinvasion und Drogenreaktionen

Fig. 3A zeigt ein Co-Transplantationsschema, bei dem zwei verschiedene Tumore, die entweder mit GFP (Tumor A) oder mCherry (Tumor B) markiert sind, durch ganztägig geerntet werdenOder Dissoziation (beachten Sie, dass FACS hier nicht verwendet wird, aber FACS-sortierte Tumorzellen könnten bei Bedarf verwendet werden). Tumor A und B können von verschiedenen Orten sein, mit verschiedenen Onkogenen induziert oder in verschiedenen genetischen Hintergründen induziert werden. Jeder Tumor wird zu einer Einzeller-Suspension verarbeitet und die Tumorzellen werden dann im Verhältnis 1: 1 miteinander vermischt und in den 2-dpf-Embryo transplantiert. Tumor-Eigenschaften, wie z. B. Engagement, Wachstum, Invasion und Verbreitung von Tumor A gegen Tumor B können dann in demselben Wirt beobachtet werden, der interne Kontrollen für die Technik und den genetischen Hintergrund erlaubt.

In Fig. 3B wurde ein NRAS-getriebenes, mCherry-markiertes Zebrafisch-CNS-PNET aus dem Optic-tektum und ein GFP-markiertes CNS-PNET aus dem Kleinhirn geerntet und zu Einzelzell-Suspensionen verarbeitet. Die Zellen wurden gezählt, und eine gleiche Anzahl von Zellen aus jedem Tumor wurden miteinander vermischt und in 2-dpf-Embryonen transplantiert. Vier dNach der Transplantation wurden die Embryos mit konfokaler Mikroskopie abgebildet. Gezeigt ist ein repräsentativer Embryo, der zeigt, dass die Tectum-Tumorzellen (rot) stärker in das Wirtshirn (Pfeile) als der Kleinhirntumor wandern.

Embryonen, die mit fluoreszenzmarkierten Tumorzellen transplantiert wurden, können in Arzneimittelbehandlungsregimen verwendet werden, um Verbindungen zu identifizieren, die das Tumorwachstum hemmen. Abbildung 3C ist eine typische Zeitlinie zur Behandlung und Bildgebung von Tumortransplantationen. 24 h nach der Transplantation, Embryonen sind für konsistente Engagement-Größe zugegriffen und in Behandlungsgruppen aufgeteilt. Im dargestellten Beispiel werden Embryonen, die mit NRAS-getriebenen, mCherry-markierten Zebrafisch-CNS-PNETs transplantiert wurden, mit 50 μM Dimethylsulfoxid (DMSO) oder MEK-Inhibitor (AZD6244) behandelt. Embryos werden für 5 Tage behandelt und bei 8 dpf abgebildet, wie in Abbildung 3C skizziert . Abbildung 3D (linke Tafeln) zeigt repräsentativ E Tiere aus den beiden Behandlungsgruppen. MEK-Inhibitor-behandelten Embryonen haben eine signifikant geringere Fluoreszenzmenge als die mit DMSO behandelten, wie beschrieben 17 . Nachdem die Tiere abgebildet sind, werden sie ohne Medikamente in Panzer transferiert und für zwei Monate auf Tumorwachstum überwacht. In dem angegebenen Beispiel führt die MEK-Inhibitor-Behandlung zu einer dauerhaften Reaktion in den erwachsenen Fischen (Abbildung 3D , rechte Tafeln). Für weitere Einzelheiten über die medikamentöse Behandlung, Bildgebung und Quantifizierung siehe Referenz 17 .

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Abbildung 1: Protokollschema der Tumorzelltransplantation in den vierten Ventrikel von 2-dpf Zebrafisch-Embryonen. Allgemeines Schema der Abschnitte 3 bis 4 des Protokolls einschließlich alternativer Endpunktanalysen (Abschnitte 4.9-6)./55712/55712fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2: Tumor-Engagement und Progression. (A) Zebrafisch-primäre CNS-PNET- 17- Tumorzellen, die mit mCherry markiert wurden, wurden in den vierten Ventrikel von 2-dpf-Embryonen transplantiert. Bei 3 dpf werden die Tumorzellen in das umgebende Hirngewebe (Pfeile) eingedrungen. Bei 8 dpf wachsen die Tumorzellen im Ventrikel; Rote Tumorzellen sind auch im umgebenden Hirngewebe und Nieren (Sternchen) vorhanden. Bei 28 dpf, sind Tumoren Zellen eingedrungen und wachsen im ganzen Host Gehirn. (B) Oberseite Sieben 3-dpf-Embryos, die mit mCherry-markierten Zebrafisch-Hirntumorzellen transplantiert wurden. Tumorzellen können konsequent in Hunderte von Embryonen transplantiert werden, mit hohen Engagements ( dh typischerweise 85/100 Embryonen). Mitte undBodenplatten. Drei repräsentative erwachsene Fische mit transplantierten Tumoren 4-8 Wochen nach der Befruchtung (wpf). Tumoren können durch Fluoreszenzmikroskopie visualisiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 3: Vergleich von Tumor-Invasion und Drug Response. ( A ) CNS-PNETs 17 aus dem Optikktectum oder Cerebellum werden mit mCherry bzw. GFP markiert, zu einer Einzeller-Suspension verarbeitet, im Verhältnis 1: 1 miteinander vermischt und in 2-dpf-Embryos co-transplantiert. ( B ) Ein 6-dpf-Embryo, der mit einer gemischten Suspension von GFP-markierten zerebellären Tumorzellen und mCherry-markierten Tumorzellen aus dem optischen Tektum transplantiert wurde. Unterschiede in den invasiven Eigenschaften jedes Tumors in tDer gleiche Empfänger kann mit der Fluoreszenzmikroskopie beobachtet werden. In diesem Beispiel wandern mCherry-markierte Tumorzellen stärker als diejenigen, die mit GFP (Pfeile) markiert sind. ( C ) Zeitplan für die medikamentöse Behandlung von Embryonen, die mit Tumorzellen transplantiert wurden. ( D ) Bilder von repräsentativen Tieren am Ende des Behandlungsschemas (8 dpf) und nach 8 Wochen nach der Behandlung (8 Wpf) mit entweder einer DMSO-Kontrolle oder einem 50 μM MEK-Inhibitor. Die Tumorbelastung kann durch Quantifizierung der Fluoreszenz gemessen werden, wie beschrieben 17 . In diesem Experiment wird das Wachstum von mCherry-markierten Tumorzellen in MEK-Inhibitor-behandelten Embryos reduziert und führt zu einer dauerhaften Reaktion bei den Erwachsenen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt einen einfachen und effizienten Transplantationstest, der die Injektion von Zebrafisch-Tumorzellen in den Ventrikel eines 2-dpf-Embryos beinhaltet, der ein vollständig kompetentes Immunsystem entwickeln wird. Bisher wurden Zebrafisch-ZNS-PNET 17 und Melanom (Daten nicht gezeigt) erfolgreich für Langzeitstudien des Tumorzellverhaltens und der Invasion verpflanzt. Die kritischen Schritte dieses Protokolls umfassen die Sicherstellung der geeigneten Nadelbohrungsgröße und der richtigen Tumorzellsuspension und adäquater Anästhesierung von Wirtsembryonen. Für jeden einzelnen Forscher kann eine weitere Optimierung dieser Technik die Einstellung der Tumorzellkonzentration, des Injektionsdrucks und der Embryo-Orientierung umfassen. Darüber hinaus kann es Heterogenität in der Viskosität von Suspensionen geben, die aus verschiedenen Tumoren stammen, so dass unterschiedliche Tumortypen mehr oder weniger schwer wieder suspendiert und transplantiert werden können. Durch Einstellen der Nadelbohrungsgröße und durch Verwendung von diffeMieten Verdünnungen der Tumorsuspension, ist es möglich, Schwierigkeiten mit Tumor-Viskositäten zu überwinden.

In unserer Erfahrung sind die häufigsten Gründe für spärliche Zellen / inkonsistente Zellmassen im Ventrikel wie folgt: 1) die Tumorzellsuspension ist zu verdünnt; 2) die Nadelbohrung ist zu klein; 3) die Einspritzzeit und der Druck sind zu niedrig; Und / oder 4) verbleibendes Gewebe wurden nicht aus dem Tumor gefiltert und in der Nadel untergebracht. Wenn die Tumorzellsuspension nach der Injektion aus dem Ventrikel fließt, ist es wahrscheinlich: 1) die Platzierung der Nadel gegen den Boden des Ventrikels; 2) ein hoher Einspritzdruck und Zeit; Und / oder 3) eine Nadelbohrungsgröße, die zu groß ist. Niedriges Überleben von transplantierten Embryonen kann verursacht werden durch: 1) Anästhesieren von Embryonen für einen längeren Zeitraum; 2) Embryonen auf der Injektionsplatte zu trocknen lassen; 3) die Injektion von Luftblasen in den Ventrikel; Und / oder 4) Durchdringung lebenswichtiger Organe, wie das Gehirn undHerz, weil die Nadel durch den Ventrikel ging.

Bisherige Methoden der Tumortransplantation im adulten oder embryonalen Zebrafischhirn beruhen auf der Immunsuppression bei Erwachsenen (genetisch, pharmakologisch oder über Strahlung) oder sind auf Kurzzeitstudien von menschlichen oder Mauszellen in den Embryonen 38 , 43 , 52 , 53 , 54 beschränkt . Zum Beispiel können Maus-Hirntumoren intranasal in Dexamethason-immunsupprimierten, 30-dpf, juvenile Zebrafisch injiziert werden, um kurzfristig (~ 2 Tage) präklinische Arzneimittel-Assays zu verwenden. Allerdings ist die Injektionsstelle in diesen Experimenten durch das Schädel- und Hirngewebe verdeckt und führt wahrscheinlich zu einer Beschädigung des normalen Hirngewebes, was die Lebensfähigkeit des Wirts und die Effizienz der Pflanzung verringert. Ein weiteres kürzlich beschriebenes Verfahren beinhaltet die Injektion von menschlichem GliobLastom-Zelllinien in die Mittelhirnregion von Zebrafisch-Embryonen, die die kurzfristige Analyse von Wachstum, Invasion und Drogenreaktion ermöglichten 43 . Auch hier ist die genaue Lage der Injektionsstelle variabel und vermutlich das normale Gewebe beschädigt. So beeinträchtigen frühere Methoden der embryonalen Hirntransplantationen oft die Lebensfähigkeit der Wirte, indem sie diese Studien auf eine Kurzzeitanalyse ( dh 2 bis 14 Tage) beschränken, was eine erhöhte Variabilität zwischen einzelnen Injektionen aufgrund von verdeckten Injektionsstellen bewirkt und die Langzeit- Langfristige Analyse von Zellverhalten und Drogenreaktionen oder von Re-Transplantation über mehrere Generationen hinweg.

Die hier beschriebene Methode befasst sich mit aktuellen Einschränkungen bei zebrafisch-embryonalen und immunkompromittierten Transplantationstechniken, indem sie es Forschern ermöglicht: 1) reproduzierbar in denselben Ort zu injizieren, mit minimaler Schädigung des umgebenden Gewebes; 2) direkt visualisieren die Website der Injektion zu maximierenEngagement-Effizienz; 3) Transplantation von Hunderten von Embryonen pro Tag; 4) lassen Tumore in immunkompetenten Tieren wachsen; 5) erlauben die Überwachung des Tumorzellverhaltens und der dauerhaften Arzneimittelwirkungen über die Lebensdauer des Zebrafischs; Und 6) erlauben die Re-Transplantation von Tumoren über viele Generationen für mögliche Studien über Tumor Evolution oder Drogen-Rückfall-Mechanismen. Darüber hinaus ermöglicht dieses Protokoll den Forschern, jeden Zebrafisch-Genotyp für die Beurteilung der Wirtsreaktion, einschließlich verschiedener Immunpopulationen, zu nutzen. Diese Attribute machen diese Methode leicht anpassbar durch jedes Labor, das bereits Standard-Mikroinjektionen in Zebrafisch ausführt. Schließlich, während diese Methode ideal für orthotopische Injektionen von Zebrafisch-Hirntumoren ist, können bei der Verpflanzung anderer Tumortypen wie Leber oder Pankreas die orthotopische Stelle wichtiger sein als die Immunkompetenz ( zB wenn ein Forscher die Wirkungen des Stromons untersucht Mikroumgebung auf Tumorwachstum). In diesem SzenarioNeu entwickelte, immun-defiziente Zebrafisch-Modelle können für die Durchführung von orthotopen Tumortransplantationen geeigneter sein 11 .

Dieses Protokoll wurde verwendet, um Tumorzell-Konkurrenz-Assays durchzuführen und Dual-markierte Tumore zu injizieren. Eine mögliche Behandlungsstrategie für die Beurteilung der Wirksamkeit von chemischen Verbindungen auf die Tumorentstehung, die die Behandlung von Embryonen nach der Transplantation über die Zugabe des Arzneimittels zu Wasser beinhaltet, wurde ebenfalls diskutiert. Ein Verfahren zur ex vivo- Behandlung von Tumorzellen vor der Transplantation wurde ebenfalls bereits gemeldet 17 . Darüber hinaus wurden transplantierte Tumore für mehrere Runden der Re-Transplantation gepoolt, was für Studien der Tumorentwicklung und Chemoresistenz von Vorteil sein wird. Derzeit sind präklinische Studien von Maus-Xenotransplantaten abhängig, um die Wirksamkeit potentieller Verbindungen zu beurteilen. Diese Studien sind jedoch zeitaufwändigUnd teuer. In Anbetracht des hohen Grades der Erhaltung der onkogenen Signalwege zwischen Zebrafisch und den Menschen 28 ist zu erwarten, dass diese Methode herkömmliche Maus- und menschliche Zellstudien ergänzt, um eine schnellere Identifizierung effektiver Verbindungen in präklinische und klinische Studien zu ermöglichen. Letztlich könnte sich diese Methode als nützlich für das schnelle chemische Screening von primären Patiententumoren erweisen, was die personalisierte Medizininitiative weiter vorantreiben könnte. Allerdings müssen noch Bedingungen für das langfristige Wachstum von menschlichen Zellen in Zebrafisch (Erwachsener oder Embryo) identifiziert werden.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Wir danken den beiden Rezensenten für hervorragende Anregungen und Verbesserungen des Manuskripts. Wir danken auch dem Huntsman Cancer Institute / University of Utah für die Tierhaltung und Wartung. Diese Arbeit wurde von der American Cancer Society (# 124250- RSG-13-025-01-CSM), einem NIH-Stipendium (P30 CA042014 CRR-Programm), der University of Utah Seed Grant und der Huntsman Cancer Foundation finanziert.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Eiwasserim Hauszur Pflege der Embryonen, Herstellung einer Injektionsplatte 
Methylenblau Sigma-AldrichM9140zum Eiwasser hinzufügen, um Pilzwachstum zu verhindern
PetrischaleThermo Fisher FB0875711Z Unterbringung von Embryonen, Herstellung einer Injektionsplatte
50 mL  Becherglas (2 Zoll Durchmesser)Jede kommerzielle Markedie Injektionsplatte herstellt
AgaroseDenvilleCA3510-8Herstellung von Injektionsplatte
GlasbehälterJede kommerzielle Markedie Injektionsplatte
herstellt PinzetteFine Science Tools11295-10Tumordissektion
RasierklingeThermo Fisher12640Nadelvorbereitung, Tumordissektion
Objektträger in Parafilm eingewickeltNadelvorbereitung jeder Handelsmarke
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 1x, pH 7,4Life Technologies10010023Tumorresuspension
Zellsieb, 40 & Mikro; mCorning Falcon352340Tumor-Resuspension
1.000 &Mikro; L Filterspitzenjede kommerzielle MarkeTumor Resuspension
100 µ L Filterspitzenjeder kommerziellen MarkeTumorresuspension
50 mL konische RöhrchenGenesee Scientific 21-108Tumorresuspension
15 mL konische RöhrchenGenesee Scientific 21-103 Resuspension von Tumoren
1,7 mL MikroröhrchenGenesee Scient 24-281Tumor-Resuspension
MikropipettenAlle kommerziellen MarkenTumor-Resuspension und
Glaskapillare (kein Filament)World Precision Instruments  TW120-4Tumortransplantation
NadelzieherSutter InstrumentsP-97Tumortransplantation
Microloader SpitzenEppendorf930001007Tumortransplantation
MicroinjectorHarvard ApparatusPLI-90Tumortransplantation
Tricaine-S (MS-222)Western ChemicalTRS1Tumortransplantation, Anästhetikum
WinkelsondeFine Science Tools10140-02Embryomanipulation
TransferpipetteEmbryomanipulationvon Handelsmarken
ZentrifugeEppendorf5810Rerforderlich während der Tumorresuspension
MikrozentrifugeEppendorf5424erforderlich während der Tumorresuspension
StereomikroskopOlympusSZ61Tumortransplantation
Fluoreszierendes StereomikroskopOlympusSZX16bildgebende Tumortransplantationen
Mikroskop KameraOlympusDP-72bildgebende Tumortransplantationen
Methylcellulose Sigma-AldrichM7140bildgebende Tumortransplantationen
InkubatorJede Handelsmarke, die Embryonen pflegt, Injektionsplatte aufwärmt
MikrowelleJede kommerzielle Markedie Injektionsplatten herstellt
WaageJede kommerzielle Markedie Injektionsplatten herstellt
HandschuheJede kommerzielle Markealle Aspekte des Protokolls
Low Melt AgaroseKonfokale Bildgebung von Embryonenallen Handelsmarken
GlasbodenschaleMattek CorporationP35G-1.0-20-CKonfokale Bildgebung von Embryonen
Konfokales Laserscanning-MikroskopOlympusFLUOVIEW FV1200Konfokale Bildgebung von Embryonen
PronaseRoche Diagnostics11459643001dechorionaten
PBSJede Handelsmarkeresuspendiert Tumor-/Tumorzellen
12-Well-PlatteJede HandelsmarkeArzneimittelbehandlung von Embryonen
Dünnrohr-TransferpipetteJede HandelsmarkeArzneimittelbehandlung von Embryonen
HämozytometerJede HandelsmarkeZum Zählen von Tumorzellen in Suspension
N2Jede HandelsmarkeFür die Einrichtung des Mikroinjektors
, , -Transplantation Jede , , , die Injektionsplatten herstellt, jede kommerzielle Marke, unter Embryonen

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