Methodenartikel

Ein komponenten-aufgelöster diagnostischer Ansatz für eine Studie auf Gras-Pollen-Allergenen in chinesischen Südländer mit allergischer Rhinitis und / oder Asthma

DOI:

10.3791/55723

⸱

4. Juni 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Respiratory Disease, 2National Clinical Research Center of Respiratory Disease, 3Guangzhou Institute of Respiratory Diseases, 4Department of Allergy and Clinical Immunology, First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 5Department of Respiratory Medicine, Sixth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll, das einen komponentenaufgelösten Ansatz verwendet, um Sensibilisierung für Gräserpollenallergene in einer Kohorte von Patienten aus Südchina mit allergischer Rhinitis und / oder Asthma zu untersuchen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Sensibilisierung für Gräserpollen erfordert ein globales Risiko für allergische Atemwegserkrankungen. Obwohl die Prävention auf der lokalen Untersuchung der Pollenallergene beruht, sind die Daten zu diesem Thema in Südchina begrenzt. Alle verfügbaren Daten wurden durch Selbstreport-Fragebögen, Hauttest-Tests und totale oder spezifische IgE-Tests mit Roh-Extrakten erhalten. Aus vielen Gründen sind diese Methoden unzuverlässig. Serum SIgE Reaktivität auf Bermuda Gras, Timothy Gras und Humulus scandens Allergene in einer Kohorte von Patienten aus Groß-Guangzhou (Süd-Chinas größte Stadt und seine Außenbezirke) mit allergischer Rhinitis und / oder Asthma wurden mit einem vollautomatischen Immunoassay-Analysator als Komponente untersucht -Rasiertes Diagnose-Tool (CRD).

Zum ersten Mal wurde in den chinesischen Südländer mit allergischer Rhinitis und / oder Asthma eine erheblich hohe Prävalenz der Bermuda-Gras-SITZ-Positivität nachgewiesen. Bei diesen Patienten eine subtile Prävalenz der SensibilisierungZu Timothy Gras und Humulus scandens wurde auch festgestellt, die aus Kreuzreaktivität entstehen können, da die beiden letzteren in der Region nicht üblich sind. Dies wurde auch durch den Nachweis von Allergenkomponenten unterstützt.

Vollautomatisierte Immunoassay-Analysatoren bieten eine zufriedenstellende Konsistenz zwischen Regionen, Laboratorien und Institutionen und im Laufe der Zeit. Die Automatisierung des Instruments kann eine standardisierte Erkennung ermöglichen, die vor dem Aufkommen von CRD nicht leicht enthüllt worden wäre.

Dies ist eine Studie, die einen CRD-Ansatz verwendet, um die Sensibilisierung für Gräserpollenallergene in Südchina zu untersuchen. Es fügt zu aktuellen Beweisen in der Literatur hinzu. Zukünftige Studien sind erforderlich, um diese Ergebnisse zu validieren. Obwohl CRD ein nützliches Werkzeug ist, sollten die Befunde, die mit dem vollautomatischen Immunoassay-Analysator durchgeführt wurden, keine anderen Laboruntersuchungen, klinischen Auswertungen und Fachwissen ausführen.

Einleitung

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Grass-Pollen machen fast 50% der Immunglobulin-E (IgE) -bezogenen Allergien aus und verleihen aufgrund ihrer luftgetragenen Natur ein globales Risiko für allergische Atemwegserkrankungen, insbesondere Asthma und allergische Rhinitis 1 , 2 , 3 , 4 . Die Prävention gegen Gräserpollenallergien in einer Region beruht auf Informationen über die lokale Verteilung der Pollenallergene. Leider variiert das Spektrum der sensibilisierenden Allergene von Ort zu Ort - eine Beobachtung, die allgemein als regionale Spezifität bekannt ist.

In China, einem riesigen ostasiatischen Territorium, wird die regionale Besonderheit der Graspollen Sensibilisierung durch begrenzte Daten, die derzeit aus dem südlichen Teil dieses Landes in den letzten Jahrzehnten verfügbar sind, noch komplizierter. Solch ein Mangel an Daten hat zu einer Schwierigkeit bei der Darstellung der gesamten Gras Pollen Sensi geführtIn diesem großen Land 6 . Darüber hinaus wurden die sehr begrenzten Daten über chinesische Südländer weitgehend aus Selbstreport-Fragebögen, Hauttest-Tests (anstatt Laborserum-Tests), Gesamt-IgE-Messungen (anstelle von allergenspezifischem IgE (sIgE)) und SIgE-Detektion an Allergene ( Anstelle von Allergenkomponentenmolekülen).

Die Selbstregistrierung allergischer Symptome kann bei bestimmten Allergenen unzuverlässig sein. Haut-Prick-Tests, obwohl weit verbreitet, beinhalten die Verwendung von nicht-standardisierten, rohen Allergenextrakte, die selbst andere sensibilisierende Komponenten enthalten können, die die Ergebnisinterpretation verwechseln. Die Zuverlässigkeit des Hauttest-Tests hängt auch entscheidend von einer geschickten Manipulation durch Allergologen oder Fachkrankenschwestern, der jüngsten Histamin-Anwendung und der Patienten-Compliance (manchmal sehr schwierig für kleine Kinder) ab. Total IgE ist nützlich für das Screening einer Allergie, aber nicht sinnvoll bestimmen thE beunruhigende Allergene bei einem Patienten. Darüber hinaus enthalten fast alle Allergene eine Reihe von Allergenkomponentenmolekülen. Die Sensibilisierung der Hauptkomponenten ( dh der p 1 und des p 2 von Hausstaubmilben) kann eine "echte" Allergie (Allergie auf ein bestimmtes Allergen, anstatt falsche Positivität durch Kreuzreaktionen mit anderen Allergenen), aber Sensibilisierung vorschlagen Zu bestimmten ( dh der kreuzreaktive Der p 10, ein Tropomyosin) darf nicht 7 sein .

Bevor eine komponentenaufgelöste Diagnostik (CRD) eingeführt wurde, behinderten diese enttäuschenden Rückschläge Allergenstudien in China. CRD präzise die Komponenten eines Allergens unter Verwendung von rekombinanten oder gereinigten Allergenmolekülen, wodurch die Messung leicht quantifizierbar und charakterisierbar ist 8 . In den vergangenen Jahrzehnten verwendeten Allergie häufig Rohextrakte von Allergenen, die zwangsläufig eine Anzahl irrelevanter Komponenten enthalten. Viele von diesen coMponents sind inert, aber gelegentlich könnten einige zu verstopfenden positiven reaktionen führen. Die Verwendung von rekombinanten oder gereinigten Allergenmolekülen in CRD kann dies umgehen und bietet somit eine bessere Testgenauigkeit. Bei der Verarbeitung in Mikroarrays, ein CRD-Ansatz schnell Bildschirme oder identifiziert Sensibilisierung für Hunderte von Allergen-Moleküle in einzelnen Themen. Eine gut gestaltete CRD-Studie zur Graspollen-Sensibilisierung in Südchina fehlt derzeit. Idealerweise sollte eine solche Studie eine lokale Bevölkerung mit beträchtlicher geografischer Abdeckung einschließen, die Graspollen, die gemeinhin in China gemeldet werden, berücksichtigen und die oben genannten technischen Aspekte ansprechen. Um eine praktische klinische Relevanz zu erreichen und die Rekrutierung von Serumproben zu erleichtern, kann eine frühzeitige Untersuchung der Sensibilisierung von Gräserpollen als Inhalationsallergene auch auf Patienten mit allergischen Atemwegserkrankungen und nicht auf die allgemeine Bevölkerung gerichtet sein.

Diese Arbeit beschreibt eine MethodeVerwendet, um die Serum-SIgE-Reaktivität auf Bermuda-Gras, Timothy-Gras und Humulus- Scandens bei Patienten aus Groß-Guangzhou (Südchinas größte Stadt und ihre Außenbezirke) mit allergischer Rhinitis und / oder Asthma mit dem CRD-Ansatz 5 zu testen. Diese Erkenntnisse über die Sensibilisierung dieser subtropischen und gemäßigten Gräserpollen in Südchina fügen wichtige Beweise dafür in der Literatur hinzu.

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Protokoll

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Das Studienprotokoll, einschließlich menschlicher Serumprobengebrauch, wurde durch das Ethikkomitee, erstes angeschlossenes Krankenhaus von Guangzhou medizinische Universität genehmigt. Alle TeilnehmerInnen haben schriftlich informiert, entweder unabhängig oder über ihre Eltern (im Falle von Kindern). Das Protokoll wurde online registriert (Chinese Clinical Trial Registry, Reg Nr .: ChiCTR-DCC-13004003, siehe http://www.chictr.org/cn/).

1. Identifizierung der Studienpopulation

HINWEIS: Das Allergie-Informations-Repository des staatlichen Schlüssellabors der Atemwegserkrankung (AIR-SKLRD) ist die primäre Quelle der Patientenrekrutierung, denn AIR ist die am besten dokumentierte große Datenbank von Patienten für Allergen-Tests in Südchina 9 , 10 . AIR speichert Serumproben von Patienten für fast ein Jahrzehnt. Kurz gesagt wurden diese gespeicherten Proben zuvor durch Zentrifugieren von 5 ml O hergestelltF phlebotomiertes venöses Blut für 10 min bei 3.000 xg und Wiedergewinnung des Überstandes. Die Serumproben wurden in -80 ° C Kühlschränke für die Langzeitlagerung platziert. Proben, die Patienteneinschlusskriterien erfüllen, waren für alle Tests in der vorliegenden Studie bereit.

  1. Aus der AIR-Datenbank können Sie Daten über Patienten mit allergischer Rhinitis und / oder Asthma abrufen, die zwischen Januar 2013 und Juni 2015 Serumtests für Grasallergen sIgE durchlaufen, die vordefinierte Studienzeit.
  2. Wählen Sie Patienten mit leichter bis mittelschwerer allergischer Rhinitis und / oder Asthma nach der allergischen Rhinitis und ihrem Einfluss auf Asthma (ARIA) 11 und die Globale Initiative für Asthma (GINA) 12 Richtlinien. Weisen Sie sie als "Studiengruppe" zu.
  3. Patienten mit unvollständigen medizinischen Unterlagen ausschließen, diejenigen, die nachträglich verloren gehen, diejenigen, die sich weigern, sich über die Verwendung ihrer Serumproben für wissenschaftliche Zwecke zu informieren,Mmunodeficiency, die derzeit auf Immuntherapie oder immunomodulatorische Agenzien, oder solche, die parasitäre Infektionen haben.
  4. Wählen Sie eine zeitgenössische Kohorte von Patienten mit Atemwegsallergien ( dh Ekzemen, allergische Dermatitis und Nahrungsmittelallergie) nach den gleichen Ausschlusskriterien und weisen Sie sie als "Kontrollgruppe" zu.
  5. Vergewissern Sie sich, dass die Serumproben gesammelt wurden, bevor Rezepte oder Behandlungen durchgeführt wurden, um verwirrende Auswirkungen auf die Laborbefunde zu minimieren. Alle Serumproben ausschließen, die diese Anforderung nicht erfüllen.
  6. Stellen Sie sicher, dass alle Fächer ständige Einwohner aus allen Teilen von Groß-Guangzhou sind ( dh geboren oder dort seit mehr als 10 Jahren gelebt haben).

2. Studienströmung und Messungen von Interesse

  1. Abrufen der Serumproben von förderfähigen Patienten aus der Biobank. Um eine Allergen / Allergen-Komponente zu testen, verwenden Sie 140 μl Serum (einschließlich 100 μl zu füllenUp the dead space).
    HINWEIS: Das maximale Gesamtvolumen, das für jeden Patienten in dieser Studie benötigt wird, ist: 3 spezifische Allergene und 8 Allergenkomponenten, sIgE = 140 μl * 11 = 1.540 μL.
  2. Bei der Verwendung dieses Instruments testen Sie vor allem die Serumproben für SIgEs auf ganze Allergene von Bermuda Gras, Timothy Gras und Humulus scandens . Befolgen Sie die Anweisungen in Abschnitt 3.
    HINWEIS: Diese Pollen wurden für die Messungen ausgewählt, weil Bermuda Gras 13 , 14 , 15 und Humulus scandens 16 in China weithin berichtet worden sind, während Timothy Gras 17 , 18 , 19 eine typische Pflanzenart ist, die in Umgebungen von tropischen bis mäßigen lebt Zonen und ist weltweit am meisten studiert.
  3. Sekundär testen Sie die in Schritt 2.3 identifizierten Serumproben(C2 d 1 (g216)], Timothy [Phlp 1 (g205), Phl p 4 (g208), Phl p 5 (g215), Phl p 6 (g209), die für die Anwesenheit von SIgEs zu den Allergenkomponenten von Bermuda [Cyn d 1 (g216)] ), Phl p 7 (g210), Phl p 11 (g211) und Phl p 12 (g212)] und kreuzreaktive Kohlenhydrat-Determinanten [CCD (o214)]. Befolgen Sie die Anweisungen in Abschnitt 3.

3. Vollautomatisches Testverfahren mit dem Immunoassay-Analysesystem

HINWEIS: Das gesamte Verfahren der Allergen-sIgE-Prüfung, das vollständig automatisiert ist und an anderer Stelle 7 , 8 , 9 , 10 beschrieben wurde, folgt dem Protokoll des Herstellers.

  1. Starten Sie den vollautomatischen Immunoassay-Analysator ( zB ImmunoCAP1000) und verwenden Sie ihn, um den Immunoassay während der gesamten Studie durchzuführen. Schalten Sie den integrierten Data Data Management (IDM) Computer ein.
    HINWEIS: Der Immunoassay analYzer ist routinemäßig im Stand-by-Modus.
  2. Wenn die "Primary Power" eingeschaltet ist, schalten Sie die "System Power" ein und warten 3 min, bis die eingebaute Software startet. Klicken Sie auf "Load Rinse Solution" und "Load Washing Solution".
  3. Fügen Sie 140 μl Serum in eine Durchstechflasche für jeden Allergen / Allergen-Komponenten-Test. Markieren Sie jede Durchstechflasche mit 140 μl Serum mit einer für jeden Patienten eindeutigen Identifikationsnummer.
  4. Führen Sie aus der IDM-Schnittstelle die folgenden Schritte aus, indem Sie auf das Menü klicken.
    1. Überprüfen Sie das Fenster "Request List" auf dem IDM, um sicherzustellen, dass "sIgE" die Testmethode der Wahl ist.
    2. Legen Sie die Probenröhrchen in die Probenracks und die Qualitätskontrollrohre in die Qualitätskontrollgestelle, mit Barcodes.
      ANMERKUNG: Für jeden Patienten wurde zunächst ein Test für SIgE zu 3 spezifischen Allergenen und 8 Allergenkomponenten oder 346 * 11 (3.806) Probenröhrchen geplant. Für jedes Probenröhrchen wurden 3 QualitätskontrollrohreDie niedrige, mittlere und hohe Niveaus der sIgE-Kontrolle enthalten (siehe Tabelle der Materialien für Details) wurden abgestimmt. Schließlich wurden nur 58 Patienten, die im Primärtest positiv getestet wurden (Schritt 2.3), im Sekundärtest weiter untersucht (Schritt 2.3). Das Laden von Rohren kann automatisch auf der Computerkonsole eingestellt werden.
    3. Wählen Sie "Load Reagents" im Bildschirm "Assay Processing". Ergänzen Sie die Beladung der Proben- und Qualitätskontrollregale, Entwicklungslösung, Konjugat, Kalibratoren, Träger, Pipettenspitzen, Stopplösung und Waschlösung gemäß der "Loadlist" (siehe Tabelle der Materialien für Details).
    4. In "Laden und Starten" drücken Sie "OK".
      HINWEIS: Am Ende der Messung erscheinen die Ergebnisse auf dem IDM.
    5. Wählen Sie aus der IDM-Schnittstelle die zu exportierenden Daten aus. Klicken Sie auf "Menü", "Genehmigen" und "Speichern unter" und exportieren Sie die SIGE-Messergebnisse als Tabellenkalkulation.
    6. Importieren Sie die Tabellenkalkulation in eine statistische Software ( zB SPSS) 10 . Mit Hilfe eines spezifischen Moduls für die Koeffizienten von Spearman aus dem SPSS-Menü analysieren wir die Korrelationen bei der Sensibilisierung zwischen diesen Gräserpollen (positiv sIgE zu ganzem Allergen) und Pollenkomponenten (positive SIgE zu Allergenmolekülen).

4. Definition der SIgE-Reaktivität

HINWEIS: Bei einer unverdünnten Serumprobe beträgt der Bereich der spezifischen IgE-Messung 0,35 bis 100 kU / l.

  1. Die Proben mit den SIgE-Werten> 100 kU / L 1: 5 verdünnen und erneut testen. Wenn der Wert höher als 100 kU / l bleibt, gehen Sie mit weiteren Verdünnungen fort, bis ein Endpunkt bis zu 1.000 kU / l erreicht ist.
  2. Basierend auf dem Schwellenwert von 0,35 kU / l betrachten wir einen sIgE-Pegel von mehr als 0,35 kU / l positiv 5 , 7 , 10 . Bewerte die ReaktivitätDer Klasse 1 (≥0,35 und <0,70 kU / L), Klasse 2 (≥0,70 und <3,50 kU / L), Klasse 3 (≥3,50 und <17,50 kU / L), Klasse 4 (≥ 17,50 und <50,00 kU / L), Klasse 5 (≥ 50,00 und <100,00 kU / L) und Klasse 6 (≥ 100,00 kU / L).

5. Statistische Analyse

  1. Analysieren Sie die Daten mit statistischer Software ( zB SPSS) 10 . Melden Sie die quantitativen Daten als Mittelwert und Standardabweichung, die qualitativen Daten als Median- und Interquartilbereiche (IQR) und die kategorischen Daten als Anteil der positiven Ergebnisse.
  2. Verwenden Sie einen Chi-Quadrat-Test für den Zwischengruppenvergleich von Proportionen, einen ungepaarten t-Test für quantitative Daten und einen Rang-Summe-Test für qualitative Daten.
  3. Verwenden Sie Pearsons Test für Korrelationsanalysen zwischen parametrischen Daten mit den Korrelationskoeffizienten, ausgedrückt als "r" und Spearmans Test für nichtparametrische Werte, mit tDie Korrelationskoeffizienten, ausgedrückt als " rs ". Betrachten Sie die statistische Signifikanz, wenn P- Werte <0,05 sind.

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Ergebnisse

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Der in dieser Studie verwendete vollautomatische Immunoassay-Analysator hat eine Festphasenstruktur, die mit kovalent kuppelnden Allergenen oder Allergenkomponenten bedeckt ist, die mit den Molekülen von Interesse (sIgE) in Serumproben des Patienten reagieren. Bei einem automatischen Programm wäscht der Analysator alle unspezifischen IgEs mit 150 μl Spüllösung ab und wiederholt diese 5 mal. Dann fügt es enzymmarkierte anti-IgE-Antikörper (50 μl) hinzu, um einen Komplex zu erzeugen. Der E...

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Diskussion

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Vollautomatisierte Immunoassay-Analysatoren bieten eine zufriedenstellende Konsistenz zwischen Regionen, Laboratorien und Institutionen und im Laufe der Zeit. Es wurde festgestellt, dass ein solches automatisches Verfahren die Bankforschung und die klinischen Studien im Wesentlichen unterstützt, den standardisierten Nachweis von vielen Allergenen und / oder Allergenkomponenten ermöglicht und eine wahrscheinliche Allergen-Kreuzreaktivität identifiziert, die vor dem Aufkommen von CRDs nicht leicht enthüllt worden wäre. Da...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Yueming Su für seine Hilfe bei der Vorbereitung der Figur. Diese Studie wurde von der Guangdong-Stiftung für Wissenschaft und Technologie (Projekt Nr .: 2014A020212352), dem Guangzhou Education Bureau (1201630044, 1201630393) und der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung von China (NSFC 81572063, NSFC 81601394) finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ImmunoCAP 1000 InstrumentThermo Fisher Scientific Inc. (Phadia AB, Uppsala Schweden)12-3800-01
Phadia Information Data Manager SoftwarepaketThermo Fisher Scientific Inc. (Phadia AB, Uppsala Schweden)12-3801-11
Softwarepaket, ImmunoCAP 1000Thermo Fisher Scientific Inc. (Phadia AB, Uppsala Schweden)12-3801-12
g2
( Bermuda-Gras)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Schweden)14-4131-01
g6
(Lieschgras)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Schweden)14-4100-01
w22
(Japanischer Hopfen)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Schweden)14-4452-01
g216
(nCyn d 1)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Schweden)14-4972-01
g205
(rPhl p 1)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Schweden)14-5234-01
g208
(nPhl p 4)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Schweden)14-5288-01
g215
(rPhl p 5b)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Schweden)14-5338-01
g209
(rPhl p 6)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Schweden)14-5289-01
g210
(rPhl p 7)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Schweden)14-5290-01
g211
(rPhl p 11)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Schweden)14-5291-01
g212
(rPhl p 12)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Schweden)14-5292-01
o214
Kreuzreagierende Kohlenhydratdeterminanten (CCDs)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Schweden)14-5339-01
Spezifisches IgE-Konjugat 400Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Schweden)10-9310-08
Spezifischer IgE-KalibratorstreifenThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Schweden)10-9459-08
Spezifisches IgE-KurvenkontrollbandThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Schweden)10-9312-08
Spezifisches IgE Anti-IgE ImmunoCAPThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Schweden)14-4417-01
ImmunoCAP Spezifisches IgE-NegativgewichtThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Schweden)10-9445-01
ThermoFisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Schweden)10-9528-01
ImmunoCAP Spezifische IgE-Kontrolle MThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Schweden)10-9529-01
ImmunoCAP Spezifische IgE-Kontrolle HThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Schweden)10-9530-01
EntwicklungslösungThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Schweden)10-9439-08
StopplösungThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Schweden)34-2271-58
WaschlösungThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Schweden)10-9202-08
FluoroCThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Schweden)10-9264-01
Wartungs-LösungskitThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Schweden)10-9476-01

Referenzen

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Component Resolved DiagnosticsAllergic AsthmaSerum IgE TestingImmunoassay AnalyzerBermuda Grass SensitizationTimothy Grass AllergyCross Reactive CarbohydrateAllergen Component Analysis

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