Murine Kurze Axis Ventrikuläre Herzscheiben für elektrophysiologische Studien

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die Herstellung von lebensfähigen ventrikulären Scheiben von erwachsenen Mäusen und deren Verwendung für scharfe Elektroden-Aktionspotentialaufnahmen. Diese multizellulären Präparate bieten eine konservierte in vivoähnliche Gewebestruktur, die sie zu einem wertvollen Modell für elektrophysiologische und pharmakologische Studien in vitro macht .

Zusammenfassung

Murine Kardiomyozyten wurden weitgehend für In-vitro- Studien der Herzphysiologie und neue therapeutische Strategien verwendet. Allerdings sind multizelluläre Präparate von dissoziierten Kardiomyozyten nicht repräsentativ für die komplexe in vivo- Struktur von Kardiomyozyten, Nicht-Myozyten und extrazellulärer Matrix, die sowohl mechanische als auch elektrophysiologische Eigenschaften des Herzens beeinflusst. Hier beschreiben wir eine Technik zur Vorbereitung lebensfähiger ventrikulärer Scheiben von erwachsenen Mausherzen mit einer konservierten in vivoähnlichen Gewebestruktur und zeigen ihre Eignung für elektrophysiologische Aufnahmen. Nach der Exzision des Herzens werden Ventrikel von den Vorhöfen abgetrennt, mit einer Ca ²⁺ -freien Lösung, die 2,3-Butandionmonoxim enthält, perfundiert und in einen 4% niederschmelzenden Agaroseblock eingebettet. Der Block wird auf ein Mikrotom mit einer Vibrationsklinge gelegt und Gewebeschnitte mit einer Dicke von 150-400 μm werden vorbereitet, wobei die Vibration frei bleibtQuency der Klinge bei 60-70 Hz und bewegt die Klinge so langsam wie möglich nach vorne. Die Dicke der Scheiben hängt von der weiteren Anwendung ab. Die Scheiben werden in eiskalter Tyrode-Lösung mit 0,9 mM Ca ²⁺ und 2,3-Butandionmonoxim (BDM) für 30 min gelagert. Danach werden die Scheiben für 30 min auf 37 ° C DMEM übertragen, um das BDM zu waschen. Scheiben können für elektrophysiologische Untersuchungen mit scharfen Elektroden oder Mikroelektroden-Arrays verwendet werden, um Kraftmessungen zu analysieren, um die kontraktile Funktion zu analysieren oder die Wechselwirkung von transplantierten Stammzellen-abgeleiteten Kardiomyozyten und Wirtsgewebe zu untersuchen. Für scharfe Elektrodenaufnahmen wird eine Scheibe in eine 3 cm Zellkulturschale auf der Heizplatte eines invertierten Mikroskops gegeben. Die Scheibe wird mit einer unipolaren Elektrode stimuliert und intrazelluläre Aktionspotentiale von Kardiomyozyten innerhalb der Scheibe werden mit einer scharfen Glaselektrode aufgezeichnet.

Einleitung

Dünngewebescheiben wurden in der Grundwissenschaft häufig verwendet, da Yamamot und Mcllwain 1966 zeigten, dass die elektrische Aktivität von Hirnschnitten in vitro ¹ aufrechterhalten wird . Seither wurden elektrophysiologische und pharmakologische Studien an Scheiben aus Gehirn ² , Leber ³ , Lunge ⁴ und Myokardgewebe ^{5 , 6 , 7} durchgeführt. Erste Patch-Clamp-Aufnahmen in ventrikulären Scheiben aus neonatalen Rattenherzen wurden im Jahre 1990 beschrieben ⁸ , aber diese Technik fiel für einige Zeit in Vergessenheit. Mehr als ein Jahrzehnt später, unsere Gruppe eine neue Methode zur Vorbereitung murine embryonalen ⁹ , neonatale ¹⁰ und erwachsenen ¹¹ Herz-Scheiben. Diese lebensfähigen Gewebeschnitte können für akute Experimente (erwachsene Scheibe) verwendet werdenS kann für mehrere Stunden kultiviert werden) oder kurzfristige Kulturversuche (embryonale und neonatale Scheiben können für einige Tage kultiviert werden). Die Scheiben zeigen in vivo wie elektrophysiologische Eigenschaften und eine homogene Anregungsspanne, wie sie durch scharfe Elektrodenwirkungspotentiale und Mikroelektrodenanordnungen aufgezeichnet wird ¹¹ . Aufgrund ihrer "zweidimensionalen" Morphologie erlauben sie den direkten Zugang von Aufzeichnungselektroden zu allen Bereichen des Ventrikels, was sie zu einem interessanten Werkzeug für elektrophysiologische Untersuchungen macht und im Vergleich zu Langendorff-perfundierten Herzen ganz neue experimentelle Möglichkeiten aufwirft. Arzneimittelreaktion der Scheiben auf Ionenkanalblocker wie Verapamil (L-Typ Ca ²⁺ -Kanalblocker), Lidocain (Na ⁺ -Kanalblocker), 4-Aminopyridin (unselektivspannungsabhängiger K ⁺ -Kanalblocker) und Linopirdin (KCNQ K ⁺ -Kanal-Blocker) ^{9 , 11} entsprach den bekannten Wirkungen auf dissoziierten Kardiomyozyten. Isometrische Kraftmessungen zeigten eine positive Kraftfrequenzbeziehung und drängten eine intakte kontraktile Funktion ¹⁰ . Diese Ergebnisse zeigten, dass murine ventrikuläre Scheiben als in vitro Gewebemodell für physiologische und pharmakologische Studien geeignet sind. Darüber hinaus haben sich die ventrikulären Scheiben der Empfängerherzen in Kombination mit scharfen Elektrodenaufnahmen als sehr hilfreiches Werkzeug erwiesen, um die elektrische und mechanische Integration sowie die Reifung der transplantierten fetalen ^{12 , 13 , 14} und der Stammzellen-abgeleiteten ¹⁵ Kardiomyozyten zu charakterisieren.

Zusammenfassend sind ventrikuläre Scheiben ein wertvolles und gut etabliertes multizellulares Gewebemodell und sollten als komplementär zu dissoziierten Kardiomyozyten und Langendorff-perfundierten Herzen betrachtet werdenIn der Herz-Kreislauf-Forschung mit dem großen Vorteil der Bereitstellung einer in vivoähnlichen Gewebestruktur (im Gegensatz zu dissoziierten Zellen) sowie direkten Zugang von Messtechniken wie scharfe Elektrodenaufnahmen zu allen Regionen des Herzens (im Gegensatz zu ganzen Herzpräparaten).

Protokoll

Die Tierhaltung muss den Richtlinien des örtlichen Tierschutzausschusses und der Richtlinie 2010/63 / EU des Europäischen Parlaments entsprechen.

1. Lösungen vorbereiten

1. Die Lösung von Tyrode ohne Ca ²⁺ (Zusammensetzung in mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH ₂ PO ₄ 0,33, MgCl ₂ 1, Glucose 10, HEPES 5, 2,3-Butandionmonoxim (BDM) 30. pH-Wert auf 7,4 einstellen Mit NaOH bei 4 ° C.
2. Die Lösung von Tyrode mit Ca ²⁺ (Zusammensetzung in mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH ₂ PO ₄ 0,33, MgCl ₂ 1, Glucose 10, HEPES 5, BDM 30, CaCl ₂ 0,9. PH-Wert auf 7,4 mit NaOH bei 4 ° C einstellen.
3. 4% niedrigschmelzende Agarose vorbereiten: 0,6 g Schmelzklebstoff in 15 ml Tyrode-Lösung ohne Ca ^{2+ geben} . Die Mischung in einem Mikrowellenofen zweimal bei 750 W für 10-15 s erhitzen, bis die Agarose aufgelöst ist. Halten Sie die Lösung bei einer konstanten Temperatur von 37 &# 176, C und rühren kontinuierlich.
4. Halten Sie Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ohne Serum bei 37 ° C mit Carbogen (5% CO ₂ , 95% O ₂ ) geblasen.

2. Bereiten Sie das Mikrotom vor

1. Schalte das Mikrotom ein.
2. Füllen Sie die äußere Mikrotomkammer mit Eis.
3. Füllen Sie die innere Mikrotomkammer mit eiskalter Tyrode-Lösung ohne Ca ²⁺ und kontinuierlich die Lösung mit 100% O _{2 an} .
4. Legen Sie eine Stahlklinge in den Messerhalter des Mikrotoms.

3. Maus Herzisolation

1. 2500 U Heparin subkutan injizieren Warte 15 min.
2. Das Tier durch zervikale Versetzung opfern
3. Öffne die truhe durch sternotomie.
4. Sorgfältig das Perikard mit einer kleinen Schere und einer Pinzette # 5 sezieren.
5. Setzen Sie eine Kanüle in die aufsteigende Aorta ein und benennen Sie die Koronararterien in situ mit eiskaltem TyrodeLösung ohne Ca ²⁺ bis das übrige Blut entfernt wird.
6. Vorspeisen Sie das Herz mit einer Pinzette und einer Schere und überträgt das Herz in eiskaltes Tyrode-Lösung ohne Ca ²⁺ .
7. Trennen Sie die Vorhöfe von den Ventrikeln mit einem Skalpell oder einer Schere.

4. Einbettung der Ventrikel in 4% niedrigschmelzende Agarose

1. Legen Sie die Ventrikel mit der Spitze nach oben in die Agarose-Form (Abbildung 1 ). Legen Sie den Stift in die Mitte der Form in die linke Kammerkammer.
2. Füllen Sie die Form mit 4% niedrigschmelzender Agarose bei 37 ° C, bis das Herz vollständig bedeckt ist.
3. Legen Sie die Form auf Eis für eine schnellere Aushärtung der Agarose, die das Schwimmen des Gewebes verhindert.
4. Entfernen Sie den Agaroseblock, der die Ventrikel enthält, aus der Form mit einem Skalpell.
5. Drehen Sie den Block umgedreht und füllen Sie die ventrikulären Kammern und die Lücke auf der Rückseite des Agarose-Blocks, die iS durch den Stift der Molte, mit 4% niedrigschmelzender Agarose unter Verwendung einer Spritze mit einer 20 G-Nadel.
6. Trimmen Sie den Agaroseblock mit einem Skalpell, um einen flachen Boden des Blocks und die aufrechte Position des Herzscheitels zu erreichen.

5. Das ventrikuläre Gewebe schneiden

1. Fixieren Sie den Block auf dem Probenhalter des Mikrotoms mit einem Tropfen Cyanacrylat-Leim. Gesicht der Herzschärfe nach oben.
2. Legen Sie den Probenhalter in die innere Probenkammer des Mikrotoms, die mit eiskaltem Tiroler ohne Ca ²⁺ gefüllt ist. Den Agaroseblock vollständig mit der Tyrode-Lösung abdecken.
3. Kleine Achsenscheiben in einer Dicke von 150-400 μm vorbereiten, abhängig von der weiteren Anwendung (bei scharfen Elektrodenaufnahmen 150-200 μm), die Vibrationsfrequenz der Klinge bei 60-70 Hz halten und die Klinge so langsam wie möglich nach vorne bewegen .
4. Verwenden Sie eine feine Bürste, um die verbleibende Agarose vorsichtig aus den Scheiben zu entfernen.
5. Sanft transfR Scheiben mit einer Pasteurpipette in die Tyrode-Lösung mit 0,9 mM Ca ²⁺ belüftet mit 100% O ₂ und lagern sie für mindestens 30 min auf Eis, um sich aus dem Schneidvorgang zu erholen.
6. Danach 30 Minuten in DMEM bei 37 ° C aufbewahren, mit Carbogen belüftet, BDM vor der weiteren Verwendung abwaschen.

6. Vorbereitung der Sharp Electrode Setup

1. Zum Vorheizen alle elektrischen Geräte 30 min einschalten, bevor die Aufnahmen beginnen.
2. Setzen Sie eine 3 cm Zellkulturschale auf die Heizplatte, die auf dem invertierten Mikroskop platziert ist.
3. Legen Sie die maßgeschneiderte Ringelektrode (Abbildung 2 ) in die Schale und verbinden Sie die Erdungsdrähte des Vorverstärkers und der Stimulationselektrode.
4. Verbinden Sie die flexiblen Rohre des Perfusionssystems mit der Schale.
5. Füllen Sie das Reservoir des Perfusionssystems mit DMEM, belüftet mit Carbogen.
6. Schalte die Perfusionspumpe ein und setze die Perfusion raTe bis 2-3 mL / min.
7. Stellen Sie die Temperatur von DMEM in der Schale auf 37 ° C ein, indem Sie den Durchlauferhitzer und die Heizplatte regeln.

7. Aktion Potenzielle Aufnahmen

1. Legen Sie eine ventrikuläre Scheibe in die DMEM gefüllte Schale.
2. Überprüfen Sie die strukturelle Integrität und Lebensfähigkeit (auf der Grundlage der kontraktilen Funktion) des Gewebes mit dem invertierten Mikroskop.
3. Füllen Sie eine Aufzeichnungsglaselektrode mit 3 M KCL.
4. Füllen Sie eine Stimulationselektrode mit DMEM.
5. Legen Sie die Aufzeichnungselektrode und die Stimulationselektrode auf die Elektrodenhalter.
6. Legen Sie die Stimulationselektrode sorgfältig auf die Scheibe und schalten Sie den elektrischen Stimulator ein. Beginnen Sie mit einer Stimulationsfrequenz von 1-2 Hz.
7. Bewegen Sie die Aufzeichnungselektrode mit dem Mikromanipulator über die vorgesehene Aufnahmeposition.
8. Langsam die Aufzeichnungselektrode absenken, bis die Spitze das Gewebe berührt.
9. Tragen Sie einen kurzen rechteckigen elektrischen Puls durch dieAufzeichnungselektrode, um die Zellmembran zu durchdringen.
10. Setzen Sie die Aufzeichnungselektrode sorgfältig ein, bis ein stabiles Signal gewährleistet ist.
11. Starten Sie die Aufnahme von Aktionspotentialen.

Ergebnisse

Myokardinfarkt führt zu einem nahezu irreversiblen Verlust von Kardiomyozyten. Zell-Ersatz-Therapie mit Stammzellen-abgeleiteten Kardiomyozyten für exogene Herzregeneration ist ein vielversprechender therapeutischer Ansatz. Die elektrische Integration und Reifung der transplantierten Zellen ist entscheidend für die Sicherheit und Effizienz der Zellersatztherapie.

Zur Beurteilung der Integration und Reifung wurden die von induz...

Diskussion

Ventrikuläre Scheiben ermöglichen elektrophysiologische, pharmakologische und mechanische Untersuchungen mit einer konservierten in vivoähnlichen Gewebestruktur und einem direkten Zugang der Messtechnik zu allen Regionen des Herzens. Physiologische Wirkungspotentialeigenschaften wurden in embryonalen, neonatalen und erwachsenen Scheiben ^{9 , 10 , 11} nachgewiesen. Die Vitalität der Scheiben, mit Ausnahme der Oberflächens...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Leica VT 1000s	Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland		Mikrotom mit vibrierender Klinge.
Edelstahlklingen	Campden Instruments, Loughborough, England	7550-1-SS
Pasteur-Pipetten	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	Z627992
Feine Bürste, z.B. Größe 6 (4/32")	VWR, International, Radnor, USA	149-2125
Präparationstisch			selbstgemachte
Häutung zum Einbetten von Ventrikeln in Agarose			selbstgemachte
1 mL Spritze	Becton, Dickinson; Franklin Lakes, USA	300013
27 G x 3/4'' Nadeln	Braun, Melsungen, Deutschland	4657705
20 G 11/2'' Nadeln	4657519
Kleine Schere	WPI, Sarasota, USA	501263
Pinzette #5, 0,1 x 0,06 mm Spitze	WPI, Sarasota, USA	500342
Sauerstoffgas (medizinische Qualität O2)	Linde, München, Deutschland
Carbogen Gas (95 % O2, 5 % CO2)	Linde, München, Deutschland
NaCl	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	7647-14-5
KCl	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	746436
CaCl2	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	746495
KH2PO4	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	NIST200B
HEPES	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	51558
NaHCO3	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	S5761
D(+)-Glucose	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	G8270
MgSO4	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	M7506
NaOH	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	S8045
Cyanacrylat-Kleber	Henkel, Dü sseldorf, Deutschland
Low-melt Agarose	Roth, Karlsruhe, Deutschland	6351.2
Heparin-Natrium-25000 I.E./5	mL Ratiopharm, Ulm, Deutschland
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), hoher Glukosegehalt, GlutaMAX	ThermoScientific, Waltham, USA	10566016
SEC-10LX Verstärker	npi electronic GmbH, Tamm, Deutschland	SEC-10LX
EPC 9	HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Deutschland
Zeiss Axiovert 200	Zeiss, Oberkochen, Deutschland
Mikromanipulator mit geringer Vergrößerung	Narashige, Tokio, Japan	Nm-3
Dreiachsiger Mikromanipulator mit hoher Vergrößerung	Narashige, Tokio, Japan	MHW-3
Perfusionspumpe	Multi Channel Systems, Reutlingen, Deutschland	PPS2
2-Kanal Temperaturregler	Multi Channel Systems, Reutlingen, Deutschland	TCO02
Rechteckpulsstimulator	Natus Europe GmbH, Planegg, Deutschland	Grass SD9
Glaskapillaren	WPI, Sarasota, USA	1B150F-1