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Methodenartikel

Overaccumulation Ileectomy-induzierten Galle im Darm der Maus

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DOI:

10.3791/55728

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21. August 2017

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Case Cardiovascular Research Institute, Case Western Reserve University, 2Harrington Heart and Vascular Institute, University Hospitals Cleveland Medical Center, 3Institute for Transformative Molecular Medicine, Case Western Reserve University School of Medicine, University Hospitals Cleveland Medical Center

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dünndarm-abhängige Gallensäure Resorption und Feedback-Hemmung der hepatischen Gallensäure Synthese ist wichtig für systemische Homöostase und Gesundheit. In dieser Studie beschreiben wir ein Mausmodell für ileale Resektion, Ileectomy-induzierten Galle Malabsorption, Overaccumulation und Toxizität im Darm der Maus zu bewerten.

Zusammenfassung

Darm-Resektion ist eine gemeinsame Therapieansatz für menschliche Krankheiten wie Fettleibigkeit, entzündlichen Darmerkrankungen, Morbus Crohn und Darmkrebs, die oft schweren kurzen Darm-Syndrom-ähnliche Nebenwirkungen einschließlich Gallensäure Durchfall führt, Dehydrierung, Elektrolytstörungen und Nährstoff Malabsorption. Hier stellen wir eine murinen ileale Resektion Modell, genannt Ileectomy, um Gewebe-Kommunikation und die Pflege der systemischen Homöostase zu bewerten. Nach ileale Resektion ist das zirkulierende Blut dauerhaft frei von dem Ileum-spezifischen endokrinen Hormon Fibroblasten-Wachstumsfaktor 15 (FGF15), die ihre endokrine Hemmung der Gallensäure-Synthese in der Leber freisetzt. In Kombination mit der erhöhten Produktion und abgeschafft Rückresorption von Gallensäuren nach dem Entfernen der Krummdarm leiden Mäuse, die operiert Galle Salz Overaccumulation in den Darm und damit verbundenen Durchfall, Morbidität und Mortalität. Neuartige Nutzung des Modells Chirurgie eingeführt in dieser Studie kann mechanistische und funktionale Einblicke in ileal Kontrolle über systemische Stoffwechselregulation in Physiologie und Krankheiten geben.

Einleitung

In der modernen biomedizinischen Forschung werden genetisch manipulierte Tiermodellen weithin genutzt, um Einblicke in menschliche Krankheiten aufzulesen. Insbesondere wurden Gewebe oder zellspezifische Gewinn und Verlust Funktionen von Genen zur molekularen Regulation sowie induzierte biologische Effekte zu studieren. Trotz der Fortschritte im Ziel Gene in VivoManipulation gibt es anhaltende Einschränkungen. Erste, viele Zellen oder Gewebe spezifische Löschungen betreffen mehrere Organe. Zum Beispiel wird epithelialen gen Löschung Ausdruck in Epithelien von mehreren Geweben beseitigen. Weiter, auch wenn die Löschung auf einem bestimmten Gewebe beschränkt ist, ist räumliche Kontrolle nur selten möglich. Zum Beispiel in einem Gewebe wie Darm durchführen verschiedene Segmente sehr spezifische Funktionen, die mit Präzision in Vivomanipuliert werden können nicht. In diesen Situationen Resektion der gen-haltigen Gewebe gilt ein effizienteres Studium Vorgehen die mechanistische und funktionelle Bedeutung der Gewebe Kommunikation bestimmen.

Ileectomy ist vor allem bei Patienten mit Morbus Crohn und entzündlichen Erkrankungen mit der distalen Ileum 1,2,3. Ileum produziert in der Regel mehrere Energie Speicher Hormone wie Fibroblasten-Wachstumsfaktor 15/19 (FGF15/19), Peptid YY (PYY) und Glucagon-Like Peptid 1/2 (GLP1/2); Diese Hormone spielen eine wichtige Rolle für lokale und endokrine in vielen biologischen Funktionen4,5,6. Unter dieser Hormone wurde FGF15 als eine robuste endokrine Inhibitor der Gallensäure-Synthese in der Leber festgestellt. Sobald in ileal Enterozyten resorbiert, aktivieren Gallensäuren führt anschließend zu Feedback-Hemmung der hepatischen Gallensäure Synthese 7nuklearen Rezeptoren Farnesoid X Rezeptor (FXR), Fgf15 Ausdruck, zu stimulieren. In einer aktuellen Studie, wir Ileectomy Mausmodell eingeführt, um das Ileum Kruppel-ähnlichen Faktor 15 (KLF15) zu studieren -Fgf15 Signalisierung Achse, die circadiane Gallensäure-Produktion in der Leber 8regelt. Am wichtigsten ist, haben wir eine neuartige Familie, Kruppel-ähnliche Faktoren, vor allem KLF15 in Gallensäure Biologie eingeführt. Basierend auf funktionelle Studien einschließlich der Ileectomy Chirurgie, haben wir festgestellt, dass KLF15 reguliert Gallensäure Synthese über einen indirekten Mechanismus nicht hepatisch. Ileale KLF15 ist schließlich auch als der erste endogene negativer Regulator der Fgf15identifiziert.

Die intestinale Segmente Abstieg vom proximalen zum distalen Regionen sind verantwortlich für die Aufnahme von anderen Nährstoffen. Das Ileum ist das große Segment verantwortlich für Gallensäure und Vitamin B12 (VB12) Aufnahme 9. Eine frühere Studie beschäftigt ein Maus-Modell der proximalen Darm-Resektion, kurzes Darmsyndrom zu studieren; verschiedene Längen Resektion, Diäten und Naht-Typen wurden vorgeschlagen, eine optimale postoperative überleben Rate 10beizubehalten. Darüber hinaus zeigt eine neuere Überprüfung dieser ileale Resektion in der Regel schwerere Krankheit als andere gastrointestinalen (GI) Segment Resektionen wegen der verminderten Anpassungsfähigkeit der restlichen Trakt 11ergibt. Dieses Thema hat intensive Interesse der Grundlagenforschung und Klinische Forschergruppen, gewonnen, während das Verständnis der Erholung und der wirksame therapeutische Ansätze sind noch begrenzt.

Gallensäure-Durchfall entsteht durch Ungleichgewichte in Gallensäure Homöostase in den enterohepatischen Kreislauf 12,13. Es kann eine Folge von ileale Resektion, Magen-Darm-Erkrankung oder eine Folge der idiopathischen Gallensäure-Malabsorption. Mehr als 80 % der Patienten wurden gefunden, um mit Durchfall nach einer ileale Resektion 14zu präsentieren. Ileectomy hat das Potenzial, eine wichtige Operation-Modell für die Erforschung der Gallensäure Durchfall sein. In dieser Studie eine Reihe von Ileum Resektionen bietet eine gradient Bewertung der FGF15 Mangel sowie Darm Galle Salz Malabsorption, Overaccumulation und toxischen Schäden.

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Protokoll

Tier-Protokoll wurde überprüft und durch die institutionelle Animal Care and Use Committee an der Case Western Reserve University School of Medicine genehmigt und wurde im Einklang mit der National Institutes of Health (NIH)-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (8. Auflage, 2011). Mäuse wurden durch Methoden der American Veterinary Medical Association (AVMA) Richtlinien für die Euthanasie der Tiere eingeschläfert (Ausgabe 2013). C57BL/6J, männliche, 8-16 Wochen alten Mäusen wurden in diesem Protokoll verwendet. Mäuse in einer 12 h hell/dunkel-Zyklus Umgebung untergebracht waren.

1. präoperative Vorbereitung

  1. Transfer Mäuse zu einem sauberen Käfig 24 h vor dem Eingriff. Können Sie Tiere freien Zugang zum Wasser. Chow Gargut mit weiche Nahrung (Gel Nahrungsergänzungsmittel) 4-6 h vor der Operation, den Inhalt des Dünndarms für die Operation zu reduzieren.
  2. Alle chirurgischen Instrumente sterilisieren und die Einweg-sterilen chirurgischen Materialien vorzubereiten. Reinigen Sie den OP-Bereich und die Narkose Bugnase mit 70 % igem Ethanol.
  3. Richten Sie eine Dissektion Mikroskop, Isoflurane Narkose Verdampfer, Instrumente und eine temperaturgeführte kleine Tier OP-Tisch für Körper Temperaturerhaltung. Instrumente, Nahtmaterial und Spritzen an einem Ort für den freien Zugang zu organisieren, während der Operation.
  4. Eingerichtet, eine Lichtquelle um genug Licht für den OP-Bereich zur Verfügung zu stellen.
  5. Sterile 0,9 % Kochsalzlösung in 5 mL Spritze für die Reinigung von Darm und Bauchschmerzen bereiten.

2. Ileectomy und Anastomose

  1. Anesthetize Mäuse mit Isofluran (2-3 %) in einer kleinen tierischen Inkubation Kammer. Angemessene Anesthetization mit der Zehe Pinch-Technik, während das Tier auf Isofluran ist zu bestimmen.
  2. Bauch Haare durch die Anwendung der Haarentfernung Produkt entfernen und wischen Sie Haar mit chirurgischen Schwämme unter Beibehaltung der Anästhesie. Platzieren Sie den Mauszeiger auf eine temperaturgeführte kleine Tier OP-Tisch ( Abb. 1 A) auf Körpertemperatur zu halten, bei 37 ° c Maintain Anästhesie mit Isofluran (1-2 %) durch eine Gesichtsmaske. Die Maus-Augen mit okulärer Salbe zu behandeln.
  3. Reinigen Sie die Haut mit Povidon-Jod und 70 % Alkohol und decken Sie den chirurgischen Bereich des Bauches mit sterilen chirurgischen Gaze ( Abbildung 1 B).
  4. Stellen eine Mittellinie Bauchschnitt mit einem chirurgischen Skalpell einmal Anästhesie in Kraft. Verwenden Sie einen Baumwoll-gespitzten Applikator schützen den Darm und ziehen Maus Bauchmuskel mit Retraktoren vollständig öffnen und Aussetzen der Bauchhöhle ( Abbildung 1 C).
  5. Suchen Sie nach der Blinddarm. Ausgehend von der Blinddarm vorsichtig bewegen die angeschlossenen Ileum und Bestandteil der Jejunum aus der Bauchhöhle ( Abbildung 1 D).
    Hinweis: Der Blinddarm leicht erkennbar aufgrund seiner Größe auch nach Fasten.
  6. Verbinden die oberen Zweig der überlegenen mesenterialen Arterie mit einer 7-0 Seide Naht zu verdecken das Blut liefert das Ileum Segment, das herausgeschnitten werden soll. Ileale Farbwechsel von rosa bis dunkel violett nach Ligatur. ( Abbildung 1-E - F).
  7. Je nach dem Zweck des Versuchs, mit einer Schere, Verbrauchsteuern und entfernen Sie 50 % oder 90 % der Krummdarm.
    Hinweis: Für Schein-Chirurgie, der überlegenen mesenterialen Arterie Ligatur nicht durchführen und entfernen Sie nicht das Ileum.
  8. Spülen das Lumen der ileal beidseitig mit 0,9 % Kochsalzlösung.
    Hinweis: da die verbleibenden intakten Ileum noch eine normale Blutversorgung empfängt von der überlegenen mesenterialen Arterie wird eine kleine Menge Blut während des Prozesses ausgespült werden. Dies bedeutet auch, dass das Blut-Versorgungsmaterial zu den ileal enden normal ist und keine Ischämie bei der Anastomose ( Abbildung 1 G gewährleistet).
  9. Suchen Sie die Mesenterien auf der Seite beidseitig Ileum. Richten Sie die Mesenterien und Naht die ileal Enden zusammen mit 8: 0 Nahtmaterial ( Abbildung 1-G - H).
  10. Naht die kontralaterale Seite des Ileum, Ileum zu halten auf natürliche Weise ( Abbildung 1 ich) anastomosieren.
  11. Naht die oberen und unteren Seiten zwischen die zwei ursprünglichen Nähte gründlich verbinden die beiden ileal Enden zusammen ( Abbildung 1 J).
  12. Bestätigen, dass es kein Durchsickern von der Anastomose Website nach Abschluss die Box-Stufigkeit ( Abbildung 1 G-ich). Der Blinddarm und Dünndarm in die Bauchhöhle, die ursprünglichen anatomischen Lage zurück. Waschen Sie den OP-Bereich mit warmen 0,9 % Kochsalzlösung mit einer stumpfen Nadel. ( Abbildung 1 K).
  13. In der Nähe des Schnitt der Bauchmuskel Schicht mit 6-0 Naht. Richten Sie die Bauchhaut Inzision mit Pinzette und Naht die Bauchhaut Erleichterung optimale Wundheilung ( Abbildung 1 L).

3. Postoperative Versorgung

  1. Übertragung der postoperativen Mäuse auf eine Intensivstation für Erholung. Beherbergen sie in einem Papier-Bettwäsche-Käfig auf eine temperaturgeführte Heizkissen auf die postoperative Erholung über Nacht fortsetzen. Mäuse mit weiche Nahrung zusätzlich regelmäßige Nahrung und Wasser zu versorgen.
  2. Verwalten Buprenorphin (0,05 - 0,1 mg/kg) mit subkutane Injektion alle 8-12 h für Analgesie.
    Hinweis: Mäuse durch CO 2 einschläfern, wenn schwer kranke.
  3. An den Endpunkt zu Opfern Mäuse mit überdosiert Isoflurane und Ernte Proben nach Bedarf (Abschnitt 4).

4. Bewertung der Ileectomy-induzierten Galle Overaccumulation

  1. wiegen und sezieren die Mäuse einen Tag nach einer Resektion von 0 % (Schein), 50 % oder 90 % der Krummdarm.
  2. Entfernen Sie den GI-Trakt und wiegen es. Berechnen Sie das Gewicht der GI-Körper-Gewichts-Verhältnis, die Schwere der Galle Salz Malabsorption und Overaccumulation zu bewerten.
  3. Der GI-Tracts in 15 mL konische Röhrchen zu übertragen und in kurze Segmente mit einer Schere schneiden. Nach dem Schnitt übertragen Zentrifuge bei 3.000 x g für 10 min. Überstands (GI Flüssigkeit enthält Gallensalze) in ein sauberes Röhrchen.
  4. Total Volumen und Gewicht der GI Flüssigkeit zu messen und berechnen Sie das Fluid Gewicht GI-Trakt-Gewichts-Verhältnis Galle Overaccumulation im GI-Trakt einzuschätzen.
  5. Bestimmen Sie die Höhe der insgesamt Galle im Überstand von Gallensäure-Assay, wie in Referenz 8 beschrieben.

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Ergebnisse

Die Verfahren für die Ileectomy sind in Abbildung 1dargestellt. Der erste Schritt beinhaltet Vorbereitung Maus Bauchhaut, wodurch ein Bauchschnitt und Verwendung von Retraktoren, um den Darm (Abbildung 1A-C) vollständig verfügbar zu machen. Als nächstes befand sich der Maus-Blinddarm (Abbildung 1D); Angesichts der Tatsache, dass seine Größe und Form es eine leicht er...

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Diskussion

Um eine erfolgreiche Ileectomy durchzuführen, muss die überlegene mesenterialen Arterie im Voraus ligiert werden, um das Blut-Versorgungsmaterial zum Segment resecting zu blockieren. Ischämische ileale Segment schaltet nach Ligation dunkelviolett. Das Ileum Segment muss dann komplett reseziert. Eine normale Blutversorgung muss für die einbehaltenen enden sichergestellt werden. Dies ist wesentlich, Blutungen und unsachgemäße Entfernung zu vermeiden, die können leicht Ursache chirurgische Fehler aufgrund von ischämischen N...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Forschung wird von Tom Peterson Stiftung unterstützt und NIH R01-HL119780 (Jain, MK) zu gewähren.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DissektionsmikroskopOlympusSZ61Für die Chirurgie 
Temperaturregler für TierePhysitemp Instruments, Inc.TCAT-2LVZur Kontrolle der Körpertemperatur
Isofluran-AnästhesieverdampferVetEquip  911104Für die Anästhesie
Dissektionezange  Fine Science Tools, Inc.11274-20Für Chirurgie 
Schere  Fine Science Tools, Inc.14084-08Für Chirurgie 
Nadelhalter  Roboz Chirurgisches Instrument Co.RS-7882Für die Chirurgie 
Mikromesser-NadelklingeFisher Scientific10318-14Für die Chirurgie 
6-0 monofile NahtEthicon1698GFür den Verschluss der Bauchhaut
7-0 SeidennahtEthicon766GFür die Ligatur
8-0 monofileNaht Ethicon1714GFür Anastomose
Chirurgische SchwämmeDynarex Corp.3333Für chirurgische Eingriffe 
Kleine Applikatoren mit Wattespitze Fisher Scientific23-400-118Für die Chirurgie 
IsofluranPiramal Healthcare Limited66794-013-25Für die Anästhesie
Buprenorphin HydrochloridReckitt-Benckiser Pharmaceuticals12496-0757-1Für Analgesie
0,9% Natriumchlorid InjektionB. Braun Medical Inc.0264-7800-10Zum Waschen/Einspritzen
Povidon-Jod-VorbereitungslösungDynarex Corp.1413Zur Vorbereitung der Haut
Puralube TierarztsalbeDechra Veterinärprodukte17033-211-38Zum Schutz der Augen
HaarentfernerlotionKirche & Dwight Co., Inc.Für die Hautvorbereitung
IntensivstationThermoCareFW-1Für die postoperative Genesung
DietGel recoveryClearH2O72-06-5022Für die postoperative Genesung
Aurum Gesamt-RNA-Kit für Fett- und FasergewebeBio-Rad7326830Für die RNA-Isolierung
iScript Reverse Transkription Supermix für RT-qPCRBio-Rad1708841Für Reverse-Transkriptions-Assay
TaqMan schneller fortschrittlicher MastermixApplied Biosystems/Life Technologies4444965Für die QPCR-Analyse
Gesamtgallensäure-Assay-KitGenzyme DiagnosticDZ042A-K01Für Gallensäure-Assay
C57BL/6J Das Jackson-Labor

Referenzen

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