Dieses Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren für die langfristigen ex vivo Kultur und die Bildgebung eines Imaginalscheibe Drosophila. Es zeigt Photorezeptordifferenzierung und Ommatidienrotation innerhalb der 10 Stunden Periode von Live-Aufnahmen des Auges Scheibe. Das Protokoll ist einfach und erfordert keine teure Einrichtung erforderlich.
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Live-Bildgebung bietet die Möglichkeit, kontinuierlich dynamische zelluläre und Entwicklungsprozesse in Echtzeit zu verfolgen. Drosophila Larven Imaginalscheibe verwendet wurden viele biologische Prozesse wie Zellproliferation, Differenzierung, Wachstum, Migration, Apoptose, Wettbewerb, Zell-Zell - Signalübertragung und compartmental Grenzbildung zu untersuchen. Allerdings Methoden für die langfristige ex vivo Kultur und die Bildgebung der Imaginalscheibe waren nicht zufriedenstellend, trotz vieler Anstrengungen. Vor kurzem haben wir ein Verfahren für die langfristigen ex vivo Kultur und die Bildgebung von Imaginalscheibe für bis zu 18 h. Neben eine hohe Insulinkonzentration in dem Kulturmedium zu verwenden, ein niedrigschmelzendes Agarose wurde auch einzubetten die Scheibe zu verhindern, dass es ein Abgleiten während des Abbildungsperiode verwendet. Dieser Bericht verwendet die Augen antennal Scheiben als Beispiel. Photorezeptor R3 / 4-spezifische mδ0.5 Ga4-Expression wurde gefolgt, dass der Photorezeptor differen zu demonstrierenzierung und Ommatidienrotation können während einer 10 h Live-Abbildungsperiode beobachtet werden. Dies ist ein detailliertes Protokoll diese einfache Methode beschreibt.
Einleitung
Das Drosophila Larven Imaginalscheibe hat ein beliebtes Experimentiersystem für die Untersuchung einer Vielzahl von biologischen Mechanismen gewesen. Diese Scheiben invaginieren aus dem embryonalen Epithel und werden sackartige Strukturen , die durch zwei Epithelschichten, Peripodial Epithelium (PE) und Disc Proper (DP) 1, 2 aufgebaut. Die Imaginalscheibe Zellen vermehren und schrittweise während der Larven- und Puppenstadien unterscheiden und schließlich in die adulten Körperstrukturen zu entwickeln. Durch die flache und einfache Zweischichtstruktur der Imaginalscheibe, sind sie leicht, wenn sie von Larven seziert zu beobachten. Doch trotz einiger Bemühungen von vielen Gruppen, die aktuellen Methoden für die langfristige Kultur der Imaginalscheibe sind nicht zufriedenstellend. Vor kurzem haben wir eine Kultur Methode entwickelt , die die normale Entwicklung von mehreren Imaginalscheibe für bis zu 18 Stunden aufrecht erhalten können und das erlaubt die Live - Darstellung 3 . Die Kulturverfahren können die Zelldifferenzierung und Migration unterstützen, aber es kann die Zellproliferation für nur 12.07 h unterstützt und kann nicht Disc Wachstum unterstützen. Der Hauptunterschied in dem Kulturmedium ist die hohe Konzentration von Insulin 3. Das Verfahren ist einfach, und keine spezielle Belüftung oder Mittelkreislauf erforderlich ist.
Eines der besten erforschten Imaginalscheibe ist der Blick antennal Scheibe. Das Drosophila Auge besteht aus etwa 800 Ommatidien aufgebaut. Jedes Ommatidium besteht aus acht Sehzellen (R1-R8). Im Larvenaugenscheibe unterscheiden die Sehzellen nach dem Durchgang der Morphogenetic Furche (MF), die über das Auge Scheibe von posterior nach anterior streicht 4, 5. Die Photorezeptoren in einer Ommatidium in Sequenz unterscheiden, mit R8 beginnen, gefolgt von R2 / R5, R3 / R4, R1 / R6 und R7 6. Die Ommatidien in den dorsalen und ventral Hälften der Auge Scheibe durchlaufen eine Drehung um 90 ° in entgegengesetzten Richtungen, was zu einer entgegengesetzten Chiralität 7, 8. Der Rotationsvorgang erfolgt in zwei Stufen: Zunächst wird eine 45 ° Drehung beginnt an und wird bei der sechsten Ommatidien Reihe hinter der MF beendet; die zweite 45 ° -Drehung wird bei etwa 16 Zeilen abgeschlossen 9, 10. Diese Studie Ommatidienrotation verwendet, gekennzeichnet durch die R3 / 4-spezifischen mδ0.5 Ga4-11, die normale Zelldifferenzierung und Dynamik zu demonstrieren , die durch diese Methode zur Kultur und Live-Bild , um das Auge Scheibe beobachtet werden kann.
Protokoll
1. Pre-Versuchsaufbau
- Sammeln Sie eine Fliege Ei, das Kern grün fluoreszierendes Protein (GFP) unter mδ0.5-Gal4 und Kultur bei 25 ° C für 5 Tage zum Ausdruck bringt.
- Mikrowellen 0,7 g niedrig schmelzende Agarose in 10 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), bis die Agarose vollständig gelöst ist. Halten Sie das 0,7% niedrigschmelzendes Gel in einem 37 ° C Inkubator bis zur Verwendung.
- Sterilisiert alle Geräte, einschließlich Zangen, Scheren, 42 mm x 0,17 mm Deckgläser, eine 9-well Glases Tüpfelplatte und eine magnetische Kulturkammer, mit 70% Ethanol für mehr als 12 h.
- Bereiten Sie die Kulturmedium 3: Schneiders Drosophila - Medium , ergänzt mit 2% fötalem Rinderserum (FBS), 0,5% Penicillin-Streptomycin und 1,25 mg / ml Insulin. Zur Vermeidung von Kontaminationen, bereiten Sie das Medium in einer Zellkultur Kapuze. Lagern Sie die zubereitete Kulturmedium bei 4 ° C und innerhalb eines Monats verwendet.
- Reinigen Sie die Dissektion Plattform und den Experimentator‘Hände mit 70% Ethanol vor der Präparation beginnen.
2. Disc Dissection
- Luft trocknet die gesamte Ausrüstung aus 70% Ethanol.
- Wählen Sie eine im dritten Häutungsstadium Larve aus einer Fliege Fläschchen. Um eine Kontamination durch das Fliegen Fläschchen zu vermeiden, waschen Sie die Larve in 1x PBS 3x um den Abfall zu entfernen.
- Seziert die gereinigte Larve in 1 ml Kulturmedium (bei RT) in dem 9-well Glas Tüpfelplatte unter einem Dissektionsmikroskop.
- Fassen die Larve mit einer Pinzette auf etwa ein Drittel des Weges von dem hinteren Ende und eine weitere Zange an der Mündung Haken. Ziehen Sie die beiden Zangen in entgegengesetzten Richtungen um die inneren Gewebe freizugeben.
- Entfernen Sie die Speicheldrüsen, Fettkörper und Nagelhaut aus dem Auge-Hirn-Komplex an den Mund Haken befestigt. Wenn die Bauchmark noch angebracht ist, schneiden sie mit einer Schere entfernt.
- Verwenden einer Pinzette das Mund Haken und ein Paar von Zangen zu greifen ein Stück Gewebe zu entfernen, die connects das Gehirn und Augenscheiben im Rückenteil.
HINWEIS: Wenn dieses Gewebe nicht entfernt wird, die beiden Augen antennal Scheiben werden miteinander und das Gehirn nahe sein. Die Augenscheiben werden dann nicht flach liegen auf dem Deckglas, da dieses Gewebe, das Gehirn und das Auge-antennal Disc wird ein Dreieck bilden. - Drehen Sie den gesamten Komplex zu einer ventralen-Position nach oben. Entfernen Sie den Faden, der den Haken oder Scheibe an das Gehirn verbindet.
HINWEIS: Wenn der Faden nicht entfernt wird, die Auge-antennal Disc wird in zwei Stück aufgeteilt, wenn der Mund Haken entfernt wird.- Entfernen Sie den Mund Haken. Achten Sie darauf, nicht das Auge Scheibe während des Prozesses nicht zu beschädigen.
HINWEIS: Die Augenscheibe ist nun frei im Medium und nur durch den optischen Stiel Gehirn verbunden.
- Entfernen Sie den Mund Haken. Achten Sie darauf, nicht das Auge Scheibe während des Prozesses nicht zu beschädigen.
3. Montage
- Luft trocknet und die Bestandteile der Kammer mit einem 42 mm x 0,17 mm Deckglas montieren. Befestigen einer Doppelschicht von O-Ringen an der Mitte des Deckglases zu halten the Agarose.
- Bauen Sie die Kammer mit Deckglas. Setzen Sie die 42 mm x 0,17 mm Deckglas auf der Bühne Akzeptor. Platzieren Sie den Silizium O-Ring auf dem Deckglas. Legen Sie die Basis. Sperren die Dichtungs Schließfach und den Deckel (Abbildung 1).
- Sorgfältig seziert übertragen die Auge-Gehirn-Komplex an das Zentrum des O-Rings mit einem 10-200 & mgr; l einer 20 uL tip Mikropipette verwenden.
- Entfernen der größte Teil des Mediums und fügen 12 ul von 0,7% niedrigschmelzende Agarose (bei 37 ° C) der Probe.
HINWEIS: Die Position des Auges Scheibe kann mit einer Pinzette vor der Verfestigung der Agarose geändert werden. Die Agarose wird innerhalb von 5 min verfestigen.- 1 ml Kulturmedium bei Raumtemperatur in der Mitte des O-Rings; jeder O-Ring kann bis zu 4 Proben laden. Stellen Sie sicher, dass die Agarose auf den O-Ring aufgeklebt wird, um das Driften der Probe zu vermeiden.
HINWEIS: Keine Belüftung oder Zirkulation des Mediums erforderlich ist.
- 1 ml Kulturmedium bei Raumtemperatur in der Mitte des O-Rings; jeder O-Ring kann bis zu 4 Proben laden. Stellen Sie sicher, dass die Agarose auf den O-Ring aufgeklebt wird, um das Driften der Probe zu vermeiden.
4. konfokale Mikroskopie
- Platzieren Sie die Kammer auf der Stufe eines invertierten Konfokalmikroskop für 30 min, die Temperatur äquilibrieren. Dies kann Z-Achsen-Drift während des Abbildungs verhindern.
- Vor dem Langzeit-Echtzeit-Bildgebung, überprüfen, ob das Gewebe durch Differentialinterferenzkontrastmikroskopie intakt ist.
- Um die Phototoxizität zu vermeiden, verwendet eine Laserleistung von weniger als 2 mW. Verwenden, um ein 40X-Objektiv für die Bildgebung.
- Acquire 62 um Z-Stapel Bilder in 12 min bei einem optischem Abstand von 1 & mgr; m. Acquire 40 Zyklen von Scans über insgesamt 10 h. Stellen Sie sicher, dass jeder Zyklus 12 min von Abbildungs enthält und 3 min ruhen.
Ergebnisse
In diesem Beispiel wurden die R3 / R4 Photorezeptoren mit mδ0.5 Ga4-markierter Photorezeptordifferenzierung zu überwachen. mδ0.5-Ga4 treibt starke Expression in R4 und schwächere Expression in 11 R3, es einen ausgezeichneten Marker für R3 und R4 zu machen, als auch für den Prozess der Ommatidienrotation. In Film 1 wurden R3 und R4 mit GFP markiert. Zu Beginn der 10 - h-Live - Imaging - Sitzung gab es 8 Reihen von Ommatidien Cluster (2A und Film - 1) und 14 Reihen von Ommatidien Clustern am Ende (2B). Die Rate der Ommatidien Differenzierung betrug 1,67 h pro Reihe, die in vivo in Scheiben 7, 8, 9, 10, 11 auf die Rate von 1,5-2 h / Zeile liegen,s = "Xref"> 12, 13, 14. Auf der Grundlage der relativen Positionen von R3 und R4, aufgetreten Ommatidienrotation in der ex vivo kultiviert Scheibe während der Live - imaging (2A 'A '', B' und B ''). Ein einzelner R3 / R4 Clusters wurde mit einem weißen Bereich in dem ersten Frame von Video 2 bezeichnet. Am Anfang wird die R3 / R4 Achse zum Äquator (2C und Film 2) zu sein , die senkrecht. Es scheint , dann 15 °, 30 ° zu drehen, und 45 ° in 3 (2C '), 6 (2C '') und 9 (2C ''') h, respectively. Diese Daten deuten darauf hin, dass diese Methode Photorezeptordifferenzierung während der 10 h aufrecht erhalten kann Echtzeit-Bildgebung.
Figure 1: Schematische Darstellung der Kammerversammlung. Schematische Darstellung der Kammeranordnung: (1) Setzen Sie das zweischichtigen O-Ring-Attached - Deckglas auf der Bühne Akzeptor. (2) Den Silizium O-Ring auf dem Deckglas. (3) Die Base. (4) Sperren des Dichtungs Schließfach. (5) Laden der Probe in die Mitte des O-Ring und die Abdeckung platzieren. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Live - Imaging von R3 / R4 Differenzierung und Rotation. Kernform-GFP während 10 h von Echtzeit-Bildgebung R3 / R4 mit mδ0.5 Gal4-markiertem ausdrückt. Alle Figuren wurden von dem Film 1 eingefangen. (A) Bild am Anfang genommen. ( > A'-A“) Bild aus dem eingerahmten Bereich auf der linken Seite (A‘) und rechts (A vergrößerte“). (B) Bild am Ende des 10 h - Zeitraums entnommen. (B'-B“) Bild von dem eingerahmten Bereich vergrößert auf der linken Seite (B‘) und rechten (B“). (CC ‚‘ ‚) mit einem einzigen R3 / R4 Paar (gekennzeichnet durch einen Pfeil in A‘) wird durch die Zeit verfolgt , die Drehung des R3 / R4 Paares zu zeigen. Maßstabsbalken = 15 & mgr; m, 10 & mgr; m und 5 & mgr; m in A, B und C ist. Alle Figuren sind maximale Intensität z-Projektionen. min: Die Zeitskala ist in h gezeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Film 1:rce.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_1.avi“target =‚_ blank‘> Bitte hier klicken, um diesen Film herunterzuladen.
Film 1: Bitte hier klicken , um diesen Film herunterzuladen.
Diskussion
In dieser Studie stellen wir ein detailliertes Protokoll für ein langfristiges Live - Imaging - Experiment auf Drosophila Imaginalscheibe. Wir haben viel Zeit, um die sorgfältige Präparation Üben Scheibenschäden zu vermeiden und für die Befestigung der Scheibe nahe der Deckgläser zu ermöglichen. Wir haben versucht, Poly-L-lysin (PLL) und niedrigschmelzender Agarose in das Gewebe zu halten; Am Ende zeigte die niedrigschmelzende Agarose eine bessere Fähigkeit, das Gewebe zu halten. Obwohl nur das Auge Scheibe in diesem Papier verwendet wurde, das normale Auftreten von Photorezeptordifferenzierung und Ommatidienrotation während der 10 h Live-Abbildungsperiode zu zeigen, kann dieses Verfahren auch auf mindestens eine anderen Scheibe aufgebracht werden, wobei die Flügelscheibe, wie in einem demonstrierte frühere Studie 3. Darüber hinaus ist das Kulturmedium Vorbereitung und Live-Imaging-Setup einfach und nicht Belüftung oder Mittelkreislauf erforderlich.
Kontinuierliche Echtzeit-Bildgebung kann eine klare zeitliche Abfolge von biologischem Vorabend bereitzustellennts. In unserem früheren Bericht von Glia - Differenzierung und Migration in die Augen Scheibe, wenn wir direkten Beweis dafür , dass Einwickeln Glia aus bestehenden Glia differenzieren nach an der Vorderseite des Auges Scheibe 3 migrieren. Langfristige ex vivo Kultur ermöglicht die gezielte Laser-aktivierte Markierung von Zellen, wie die Foto-Umwandlung des KAEDE fluoreszierenden Proteins, um ihr Verhalten 3 zu folgen. Es kann auch die Prüfung von Chemikalien aufnehmen, die direkt dem Kulturmedium zugegeben werden; Somit kann es als Wirkstoff-Screening-Plattform verwendet werden. Da einige dynamischer Prozess innerhalb von Minuten oder Sekunden auftreten, ist eine hohe zeitliche Auflösung erforderlich. Zur Verbesserung der zeitlichen Auflösung, Lichtblattmikroskopie 15, 16 oder Rotationsscheibenmikroskopie 17 kann eine gute Option sein.
Die aktuelle Kulturbedingung ist nicht perfekt. Dabei spielt es keine Scheibe Wachstum unterstützen. Zelle pRolltation wird nur bis zu 12 h unterstützt 3 . Nach 12 h in ex vivo- Kultur beginnt die Rate der Photorezeptor-Differenzierung 3 zu sinken. Dies kann auf den Mangel an bestimmten Nährstoffen oder Hormonen zurückzuführen sein. Da der Hauptunterschied in diesem Kulturmedium die hohe Konzentration an Insulin ist, kann das Säugetierinsulin teilweise die Funktion endogener Insulin-ähnlicher Peptide nachahmen. Die Zugabe von Fliegextrakt, der Insektenblutzucker Trehalose und verschiedene Konzentrationen des hämmernden Hormons 20-Hydroxyecdyson waren nicht vorteilhaft 3 . Allerdings reicht die 12-18 h Kulturperiode aus, um viele Entwicklungsprozesse zu untersuchen. Alternative Kultivierungsmethoden für die Kultivierung von Larven-Imperialscheiben wurden verglichen 3 , und unsere Kultivierungs- und Imaging-Bedingung liefert das längste Zeitfenster und die meisten Klarheit für die Live-Bildgebung. Obwohl Scheiben in lebenden Larven und Puppen direkt abgebildet werden können18, 19, 20, 21, 22, die Auflösung und die Zeitfenster für die Beobachtungen sind begrenzt. Am späten Larven- und Puppen - Discs können für eine lange Zeit 23, 24, kultiviert werden , aber die Scheiben durchlaufen erhebliche Morphogenese. Um die Vorteile der flachen 2D Larvenscheiben zu nehmen, unsere Kultivierung und Abbildungsverfahren ist die beste Lösung so weit.
Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Wir sind dankbar, dass Chun-lan Hsu und Yu-Chi Yang die Fliege Nahrung für die Vorbereitung und Pflege der Fliegen Aktien und zu Su-Ping Lee und das IMB-Imaging-Core für ihre Hilfe bei der konfokalen Mikroskopie. Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse zu YHS (NSC 101-2321-B-001 -004, NSC 100-2321-B-001 -012, NSC 102-2321-B-001 -002, unterstützt MOST 103-2311-B-001 -035 -MY3) von der National Science Council und das Ministerium für Wissenschaft und Technologie der Republik China.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Niedrigschmelzende Agarose | AMRESCO | 0815-25G | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | AMRESCO | 0780-2PK | |
| 42 mm x 0,17 mm Deckgläser | PST | G401-42 | |
| Schneider' s Drosophila medium | Thermo | 21720-024 | |
| Fötales Kälberserum (FBS) | Sigma | F9665 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 759 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Kulturkammer | PECON | POC-R2 Zellkultivierungssystem | |
| 40X Objektiv | C-Apochromat 40X/1,2W Korr Objektiv | ||
| Fliegenstamm:nls. GFP | Bloominggton | 4775 |
Referenzen
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