Personalisierte Nadeln für Mikroinjektionen im Nagetier Gehirn

Zusammenfassung

Wir beschreiben hier ein Protokoll für die Mikroinjektion im Nagetier Gehirn, das Quarz-Nadeln verwendet. Diese Nadeln nicht nachweisbar Gewebeschäden zu produzieren und zuverlässige Lieferung auch in tiefen Regionen zu gewährleisten. Darüber hinaus können sie Forschungsbedarf durch personifizierte Entwürfe angepasst und können wiederverwendet werden.

Zusammenfassung

Mikroinjektionen werden für eine lange Zeit für die Lieferung der Medikamente oder Giftstoffe in bestimmten Hirnarealen, und in jüngerer Zeit, sie wurden verwendet, um gen oder Zelle Therapie-Produkte zu liefern. Leider, aktuelle Mikroinjektion Techniken verwenden, Stahl oder Glas Nadeln, die aus mehreren Gründen suboptimal sind: insbesondere Stahl Nadeln können dazu führen, dass Gewebeschäden und Glas Nadeln können verbiegen, wenn tief ins Gehirn, senkte die Zielregion fehlt. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll zur Vorbereitung und Quarz-Nadeln, die eine Reihe von nützlichen Funktionen kombinieren verwenden. Diese Nadeln produzieren keine nachweisbaren Gewebeschädigung und als sehr steif, zuverlässige Lieferung in die gewünschte Hirnregion zu gewährleisten, auch wenn Sie Tiefe Koordinaten verwenden. Darüber hinaus ist es möglich, das Design der Nadel zu personalisieren, indem man mehrere Löcher von den gewünschten Durchmesser. Mehrere Bohrungen erleichtern die Injektion von großen Mengen der Lösung innerhalb eines größeren Bereichs, während große Löcher die Injektion von Zellen erleichtern. Darüber hinaus können diese Quarz-Nadeln gereinigt und wiederverwendet, so dass das Verfahren kostengünstiger wird.

Einleitung

Mikroinjektionen wurden für eine lange Zeit für die Lieferung von pharmakologisch wirksamen Verbindungen zur neuronalen Aktivität in bestimmten Hirnarealen zu modulieren. Darüber hinaus wurden sie zur Giftstoffe in der Nähe von bestimmten neuronalen Populationen, um Neurodegenerative Veranstaltungen charakteristisch für bestimmte Krankheiten, z. B. 6-hydroxy-Dopamin im Nigrostriatal Dopaminsystem der Parkinson-Krankheit zu imitieren zu imitieren injizieren ^{1 , 2} oder Immunotoxin 192 IgG Saporin, Läsion der cholinergen System³. Vor kurzem wurden Mikroinjektion Verfahren zur viralen Vektoren oder Zellen Transplantate für experimentelle Gehirn Störungen^4,5gen oder Zelle Therapie liefern.

Die klassische Art der Nadeln, die in diesen Studien beschäftigt ist aus Edelstahl gefertigt. Obwohl einfach und praktisch in der Handhabung, Stahl Nadeln haben eine Reihe von Problemen⁶: sie sind relativ groß und kann dazu führen, dass Gewebeschäden, mit Austritt von Blut - Hirn-Schranke und Aktivierung der Astrozyten; Darüber hinaus können sie produzieren, Entkernung des Hirngewebes, die in die Nadel ein Hindernis oder sogar ganz vermeiden Strömung der gewünschten Lösung kommt. In jüngerer Zeit, verwenden Glas Nadeln bereit ad hoc aus Kapillaren wurden eingeführt in^7,8. Diese verursachen keine signifikante Gewebe Schaden oder Astrozyten Aktivierung, aber sind relativ flexibel und können verbiegen als Tiefenstrukturen, reduziert die Genauigkeit der Lokalisierung (persönliche Beobachtungen) eingeführt.

Daher besteht die Notwendigkeit, so viel wie möglich Schaden zu reduzieren (vor allem bei Experimente, um Schaden zu heilen) und Erhöhung der Genauigkeit und Reproduzierbarkeit (d.h., sicherzustellen, dass alle Lösung geliefert wird und korrekte Lokalisierung zu gewährleisten). Darüber hinaus wäre es wünschenswert, verschiedenen Nadel Designs zu verwenden, zur Gewährleistung einer optimalen Verteilung der injizierten Lösung in Hirnarealen mit unterschiedlichen Geometrien. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll um vorzubereiten und Quarz Nadeln für Mikroinjektionen im Nagetier Gehirn. Aufgrund der hohen Schmelzpunkt Quarz Kapillaren können nicht auf einem herkömmlichen Abzieher gezogen werden und daher nicht verwendet wurden in der Vergangenheit, um Nadeln zu generieren. Quarz, bietet jedoch einige wichtige Vorteile gegenüber Glas, insbesondere eine hohe Steifigkeit und Pause Widerstand⁹. Infolge ihrer Unbeugsamkeit sind Quarz Nadeln geeignet für Injektionen in ventralen Hirnregionen. Durch ihre hohe Beständigkeit gegen Bruch können sie modelliert werden, um mehrere Löcher, Erlangung Designs, die am effektivsten erweisen, selbst wenn Gehirnregionen mit komplexen Geometrien¹⁰gezielt erweitert.

Protokoll

Alle experimentelle Protokolle wurden von der Ethikkommission der Universität von Ferrara für Tier-Experimente und das italienische Gesundheitsministerium genehmigt. Die Ankunft (Animal Research: Berichterstattung In Vivo Experimente¹¹) Richtlinien befolgt wurden.

1. Vorbereitung des Quarz-Nadeln

1. Reinigen Sie und sterilisieren Sie die Quarz-Kapillaren (siehe Tabelle der Materialien), indem man sie für 5 min in destilliertem Wasser, 5 min in Ethanol 99 % und 5 min in Diethylether.
2. Lassen Sie die Kapillaren unter der Haube für mindestens 1 h bis sie vollständig trocknen lassen.
3. Bereiten Sie die Nadeln mit einem Laser Abzieher nach Parametern, die die Produktion von einer ausreichend langen, ausreichend dünnen Nadel, je nach den individuellen Bedürfnissen zu ermöglichen.
   Hinweis: Wir verwenden einen Laser-Puller (siehe Tabelle der Materialien). Verwenden Sie ein zwei Zeilen Programm zum ziehen. Die erste Zeile verwendet high-Power, der größte Scan Länge (Filamente Wert entspricht) und keine Zugkraft. Diese Kombination von Parametern führt zum Schmelzen des größten Teils der Kapillare mit die niedrigsten Ausschubgeschwindigkeit, so dass für die Gestaltung einer langen Nadel mit großen inneren/äußeren Größe und Schaft reduziert. Auf diese Weise bewahrt die Nadel eine hohe mechanische Festigkeit und breit Innendurchmesser, die im Laufe der Stammzellen oder Viruspartikel ohne zu verstopfen kann. Geschwindigkeit und Verzögerung von dieser Programmzeile sollte die Kapillarleitung stoppen, bevor die Spitze zu klein und lang, fehlen die erforderlichen mechanischen und Formcharakteristik wird. Die zweite Zeile des Programms ziehen wird automatisch ausgeführt, sobald die Quarz abkühlt (5 s). Parameter der macht, Filament und Zugkraft sind funktionell, schneiden Sie einen Tipp mit der kürzesten möglichen Spitzenlänge und steilen Schaft, die Trennung der beiden Nadeln mit einem Tipp-Bruch zu vermeiden. Routinemäßig, mit unserem Equipment verwenden wir Folgendes: (a) Linie 1 = Power 990, Filament 5, Geschwindigkeit 130, Verzögerung 110, ziehen 0; (b) Linie 2 = Power 970, Filament 3, Geschwindigkeit 0 Verzögerung 70, 0 zu ziehen.
4. Setzen Sie die Nadeln in einer Petrischale mit Ethanol 70 % zuvor gereinigt.
   1. Bedecken Sie die Schüssel mit einem Kunststoff Paraffin-Film.
5. Geschnitten Sie die Kapillaren an der Mikro-Sezierer.
   1. Lassen Sie bei der Inbetriebnahme der Laser führen einen Selbstkalibrierung Prozess um zu überprüfen, Kraft und Energie geliefert. Legen Sie die Bearbeitungsparameter.
      Hinweis: Wir verwenden eine Mikro-Sezierer (siehe Tabelle der Materialien) und die folgenden Parameter: laser macht Pulsenergie (63 µJ), Laser Strahldurchmesser von 20 % der maximalen Öffnung (maximale Blende: 1,0 µm), und Schnittgeschwindigkeit von 10 % der maximalen Geschwindigkeit (maximal Geschwindigkeit: 30 µm/s).
   2. Fest fixieren Sie die Nadel auf den Mikroskoptisch und positionieren Sie seine Spitze in der Mitte des Bildschirms.
   3. Klicken Sie in der Menüleiste auf das Bleistift-Symbol und verwenden Sie, um ein Zeichen für das Laserschneiden der Nadel ziehen.
      Hinweis: Der Schnitt sollte in einem Winkel von ca. 45° in Bezug auf die Nadel Oberfläche sein.
   4. Wählen Sie auf der Seite Bar-Funktion die Flagge enthält die "START CUT"-Schaltfläche, um den Laser auf die vorher markierte Stelle schneiden lassen.
   5. Bei Bedarf schneiden Sie Seite Fehlerzustand durch Wiederholung in 1.5.2-3 beschriebenen Verfahren; Es gibt keine Notwendigkeit, die Nadel (Abbildung 1) neu zu positionieren.
6. Nach dem Schneiden Sie, Reinigung.
   1. Verbinden Sie die Nadel auf eine leere Pumpe durch ein Kunststoffrohr.
   2. Schalten Sie die Pumpe ein und legen Sie manuell die Vorlauf-Rate mit mäßiger Geschwindigkeit (3 µL/min).
   3. Aspirieren das 99 % Ethanol zuerst und dann das destillierte Wasser Verunreinigungen durch Schneiden zu entfernen.
   4. Aspirieren Sie die 99 % Ethanol wieder um die Trocknung zu erleichtern.
      Hinweis: Jeder Schritt sollte mindestens 3 min dauern.
7. Speichern Sie die Nadeln in einer richtig bedeckten Petrischale bis zum Tag der Operation.
8. Nadeln können wieder verwendet werden; am Ende des Experiments reinigen Sie mit Bleichmittel und Ethanol, die Lösung und mögliche Gewebe entfernen. Füllen Sie für eine vollständigere Reinigung, setzen Sie die Nadeln in einer Mikropipette Vorratsgefäß mit der Spitze nach unten das Glas mit destilliertem Wasser, bis die Spitzen bedeckt sind, Kochen Sie für 1,5 min alle übrig gebliebenen Gewebe zu entfernen, dann waschen mit Ethanol.

(2) Verfahren

1. Wählen Sie das Menü "Einstellungen", um die Pumpe nach dem Durchmesser/Volumen der Mikroinjektion Spritze zu kalibrieren und Einstellen der Durchflussmenge bei 0,3 µL/min, nach den Anweisungen der Bedienungsanleitung der Pumpe.
2. Füllen Sie eine 10-mL-Spritze (ausgestattet mit einer stumpfen Nadel (z.B.Hamilton Nadel, 30 G) und einem kurzen Polytetrafluorethylen-Rohr) mit sterilem Wasser und es verwenden Sie, um die Mikroinjektion Spritze (nach den Kolben vorsichtig entfernen) und die Injektion zu füllen Montage-Teilesatz für die manuelle Mikroinjektion Pumpe (MMP).
   Hinweis: Das MMP-Kit wird verwendet, um die Nadel in der stereotaktische Rahmen (Abbildung 2) sicher zu montieren. Das Kit besteht aus: einem Polytetrafluorethylen-Schläuche, Luer-Anschluss-Schläuche-Koppler, Pipette Halter und Dichtungen für Pipetten mit verschiedenen Außendurchmesser.
3. Verbinden Sie die Nadel mit dem MMP-Kit.
   1. Spülen Sie mehr Wasser über das System zu, durch die 10-mL-Spritze, und überprüfen Sie, ob das Wasser aus der Nadel kommt.
      Hinweis: Stellen Sie sicher Luftblase im Inneren des Systems entfernen indem Sie die Füllung Schritte wiederholen.
4. Trennen Sie die 10-mL-Spritze aus der Mikroinjektion Spritze drücken Sie langsam den Kolben um einen Tropfen Wasser an der Spitze der Mikroinjektion Spritze zu verlassen. Setzen Sie den Kolben in der Mikroinjektion Spritze.
5. Die Mikroinjektion Spritze an die Pumpe anschließen und die Durchflussmenge bei 0,3 µL/min eingestellt.
   Hinweis: Warten Sie, bis ein Tropfen Austritt aus der Spitze der Nadel und dann für weitere 3 Minuten gehen lassen.
6. Legen Sie den Fluss bei 0,1 µL/min und starten Sie die Operation. Die Pumpe sollte während der Durchführung der Operation laufenden.
   Hinweis: Für die Experimente berichtet in diesem Artikel verwenden wir männliche Sprague-Dawley Ratten 300 g (3 Monate alt). Das Verfahren ist jedoch insbesondere anwendbar auf andere Arten, Mäuse.
7. Induzieren Sie Vollnarkose mit einer Methode, die von örtlichen Vorschriften genehmigt.
   Hinweis: Wir verwenden eine Mischung aus intraperitonealer Injektion (i.p.) von 85 mg/kg Ketamin und 8 mg/kg Xylazin für 20-50 min der Anästhesie. Es ist wichtig, dass Rute und/oder Zehen Prisen verwendet werden, um sicherzustellen, dass das Tier völlig sediert ist. Ebene der Anästhesie und grundlegende Eingeweide sind geprüft, bevor Chirurgie beginnt und alle 10 Minuten während der Durchführung der Operation überwacht. Tierischen Körpertemperatur ist konstant vor, während und nach chirurgischen Eingriffen mit einem Wasser wieder zirkulierenden Heizkissen gehalten. Tiere werden überwacht, bis vollständig erholt (z. B. sie sind aufrecht und ambulante). Darüber hinaus erhalten Tiere Analgetika (Tramadol, 5 – 7 mg/kg i.p) postoperativ alle 24 h für drei Tage.
   1. Der Kopf des Tieres zu rasieren und angemessene Vorbereitung der Operationsstelle für aseptische Chirurgie. Führen Sie eine zwei-Phasen-Peeling mit Jod-Lösung (Betadine) gefolgt von 70 % igem Ethanol. Darüber hinaus um Asepsis zu halten, wickeln die Operationsstelle mit einem chirurgischen Tuch (in dem Video wurde zu Demonstrationszwecken weggelassen worden).
8. Positionieren Sie die Ratte in der stereotaktischen Rahmen über ein Wasser wieder zirkulierenden Wärme-Unterbett. Um zusätzliche Schmerzfreiheit am Ort der Operation gelten 0,5 % Lidocain-Lösung (7 mg/kg nicht überschreiten). Sterilisieren Sie vorab alle chirurgischen Instrumente mit einer Wulst Sterilisator oder Flüssigkeit kalt Desinfektion von selbstvergessen die Ausrüstung entweder 2 % Glutaraldehyd plus 7,05 % Phenol (Sporodicin oder Cidex) gefolgt von Spülen mit sterilem Wasser oder Kochsalzlösung. Die Desinfektion muss auch zwischen Verfahren durchgeführt werden. Machen Sie einen längs-Schnitt über den Schädel mit einem sterilen Skalpell. Seien Sie sanft, übermäßige Blutung zu vermeiden. Öffnen Sie die Kopfhaut mit einem flachen Spatel und chirurgische Clips auf die Hautlappen es geöffnet zu halten. Lösen Sie sehr sanft das Periost, aussetzen der Bregma und den Bereich des Schädels durch die Nadel eingeführt wird.
9. Montieren Sie den Arm auf der stereotaktischen Rahmen (während die Strömung läuft) und bewegen Sie die Spitze der Nadel genau auf Bregma, die Aufmerksamkeit nicht auf die Spitze zu brechen. Kommentieren Sie die Antero-posterioren und Medio-lateralen Koordinaten der Bregma und übersetzen Sie, um die gewünschten Koordinaten. Geleitet von einem Stereomikroskop, senken Sie die Nadel, bis seine Spitze berührt fast den Schädel, markieren Sie die Bohrungen nach Anhebung des stereotaktischen Arms ein wenig vor Ort.
10. Bohren (Spitze Ø Bohren: 0,8 mm; Drehzahl: 1.000 u/min) den Schädel auf der markierten Stelle. Vorsicht ist geboten, nicht zu die Dura bei den Bohrungen zu durchdringen. Während des Bohrens Tropfen Sie sterilen Kochsalzlösung zur Vermeidung von Knochenschädigung und Nekrose.
11. Schneiden Sie ein kleines Stück Kunststoff Paraffin Film und legen Sie es auf den Schädel. Mit 10 µL pipettieren, machen Sie einen Tropfen der Lösung auf dem Kunststoff Paraffin-Film zu injizieren. Stoppen Sie die Pumpe leicht Abrufen der Drücker der Pumpe und erstellen eine kleine Luftblase in der Kapillare durch leichtes Ziehen des Kolbens der Spritze Mikroinjektion.
12. Senken Sie die stereotaktischen Arm, bis die Spitze der Nadel die Tropfen erreicht. Zeichnen Sie die Probe durch ziehen (sehr langsam) den Kolben der Spritze Mikroinjektion, Blasenbildung zu vermeiden. Ersetzen Sie die Pumpe Drücker in Kontakt mit dem Kolben und schalten Sie die Pumpe mit einer Durchflussrate von 0,3 µL/min Wartezeit bis zur Bildung eines Tropfens (wenige Minuten) bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
    Hinweis: Im vorliegenden Beispiel Experiment wurde künstliche Liquor cerebrospinalis (ACFS) im Striatum infundiert (AP: 1,5 ML: ±2.7; DV: -5,0) und im dorsalen Hippocampus (AP: -3,5, ML: ±2.1; DV:-3.5; in mm von Dura) 2 µL/Website. Um den Vergleich zwischen den beiden Methoden zu erleichtern, wurde jeder Bereich des Gehirns infundiert mit einer Quarz-Nadel in einer Hemisphäre und eine stumpfe Spitze 26 G oder 30 G Abschrägung-Tip Edelstahl Nadel in die andere.
13. Senken Sie der Fluss auf 0,1 µL/min, nick die Dura mit einer Edelstahl-Fase-Tip-Nadel und senken Sie langsam die stereotaktischen Arm auf die dorsal-Ventral-Axt, Eintritt in das Hirngewebe. Wenn die gewünschte Position erreicht ist, gehen Sie unten zusätzliche 0,1 mm, die Pumpe zu stoppen, die stereotaktischen Arm von 0,1 mm zu erhöhen und starten Sie erneut die Pumpe an den Fluss auf 0,3 µL/min.
    Hinweis: Der Grund, eine langsame Strömung pflegen und senken die Nadel soll einen positiven Druck sichergestellt, der Eindringen von kleinen Fragmente von Gewebe in die Nadel selbst vermeidet. Ein solches würde den Tipp, beeinträchtigen die Lieferung der Lösung behindern. Da die Durchflussmenge sehr langsam ist, während die Nadel und die Geschwindigkeit der Senkung zu senken ca. 10 s/mm ist, bedeutet dies, dass die Mengen der Lösung, die entlang der Strecke Nadel bleiben vernachlässigbar im Vergleich zu denen an den Zielstandort injiziert. Diese Vorsichtsmaßnahme kann vermieden werden, wenn Nadeln mit seitlichen Bohrungen zu verwenden.
14. Starten Sie die Stoppuhr und warten Sie, die benötigte Zeit je nach der gewünschten Lautstärke zu injizieren (z. B. 6 min 40 s wenn 2 µL injizieren). Überwachen Sie die Blase Bewegung während der Injektion. Am Ende stoppen Sie die Pumpe zu und warten Sie 5 min, bevor die Nadel langsam abrufen. Wenn die Quarz-Nadel vollständig extrahiert wird, starten Sie die Pumpe wieder und überprüfen Sie für die Bildung eines Tropfens an der Spitze der Nadel.
15. Verschließen der Öffnung in der Oberfläche der Schädel mit Knochen Wachs, hämostatischen Clips entfernen und Naht der Kopfhaut, das Gebiet rund um die Wunde mit einer antibiotischen Creme (z.B. Neosporin) zu beschichten und das Tier zu Hause Käfig zurückkehren.
    Hinweis: Im Anschluss an die Euthanasie-Protokoll genehmigt durch die institutionellen Ethik-Ausschuß für die Experimente, die in diesem Artikel beschriebenen Tiere waren tief mit einer Injektion i.p. 43 mg/kg Ketamin und 7 mg/kg Xylazin betäubt und enthauptet. Gehirne wurden entfernt, postfixed in Formalin für 48 h und Paraffin eingebettet. Koronalen Abschnitte des Gehirns (8 µm) wurden mit einem Mikrotom geschnitten.

Ergebnisse

Wir verglichen Schäden induziert durch direkte Mikroinjektion in der Ratte dorsalen Hippocampus und Striatum mit einer Quarz-Nadel (60 µM Außendurchmesser Tipp; 20 µM Durchmesser Bohrung Typ C, Abbildung 1) verglichen mit zwei Klassiker, stumpfen Ende 26 G und 30 G schräge Kante Edelstahl-Nadeln. Zu diesem Zweck wir injiziert 2 µL der ACFS rechts und links dorsalen Hippocampus und Striatum mit bzw. Quarz und Stahlnadel und 48 h nach der Injektion, wir Gewebes...

Diskussion

In diesem Artikel beschriebene Verfahren erfüllt die Bedürfnisse dargelegt in der Einleitung zur Optimierung Mikroinjektionen, die für verschiedene Zwecke¹²ausgeführt werden. Die hier beschriebenen Nadeln reduzieren Schäden auf ein minimum, im Wesentlichen nicht detektierbare Niveau; an der Abweichung mit Glas-Nadeln (, die anfällig für biegen), Quarz-Nadeln sind starr und gewährleisten einen zuverlässige Hit von der gewünschten Hirnregion sogar in tiefen Koordinaten. Zudem sorgt ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Quarzkapillaren	Sutter Instruments, Novato, CA USA	Q100-50-10	Ohne
Filamentabzieher	Sutter	P2000
Mikropipetten-Vorratsdose	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	E210
Lasermikrodissektorierung	Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland	LMD6500
Hamilton Spritze	Hamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, StŸ tzerbach, Deutschland	19138-U
Mikroinfusionspumpe	Univentor, Zejtun, Malta	Modell 864
Manueller Mikroinjektionspumpensatz	WPI	Artikel#: MMP-KIT	Bausatz zur sicheren Befestigung von Mikropipetten am stereotaktischen Rahmen
Präzisionsbohrer	Proxxon	28510 MicroMot 50/E	Kugelgelagerte Antriebswelle mit variabler Drehzahl
Künstliches Gehirn Rückenmarksflüssigkeit	Tocris	3525
Nadeln 26 g stumpf und 30 g abgeschrägt	Hamilton	26 g stumpf: 19138-U 30 g abgeschrägt: 20757
Mikrotom	Leica, Deutschland	LEICA RM212RT