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Methodenartikel

Echtzeit-Iontophorese mit Tetramethylammonium zur Quantifizierung der Volumenfraktion und Tortuosität des Gehirns extrazellulären Raumes

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DOI:

10.3791/55755

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24. Juli 2017

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1Department of Medicine, University of Virginia, 2Department of Cell Biology, SUNY Downstate Medical Center, 3Neural and Behavioral Science Graduate Program, SUNY Downstate Medical Center, 4Division of Neonatology, University of Virginia, 5Department of Neuroscience and Physiology, New York University School of Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt Echtzeit-Iontophorese, eine Methode, die physikalische Parameter des extrazellulären Raumes (ECS) des lebenden Gehirns misst. Die Diffusion eines in das ECS freigesetzten Inertmoleküls wird zur Berechnung des ECS-Volumenanteils und der Tortuosität herangezogen. Es ist ideal für das Studium akuter reversibler Änderungen an Gehirn ECS.

Zusammenfassung

Diese Übersicht beschreibt die grundlegenden Konzepte und das Protokoll zur Durchführung der Echtzeit-Iontophorese (RTI) -Methode, die Gold-Standard, um den extrazellulären Raum (ECS) des lebenden Gehirns zu erforschen und zu quantifizieren. Die ECS umgibt alle Gehirnzellen und enthält sowohl interstitielle Flüssigkeit als auch extrazelluläre Matrix. Der Transport von vielen Substanzen, die für die Gehirnaktivität erforderlich sind, einschließlich Neurotransmitter, Hormone und Nährstoffe, erfolgt durch Diffusion durch die ECS. Änderungen des Volumens und der Geometrie dieses Raumes treten bei normalen Gehirnprozessen, wie Schlaf und pathologischen Zuständen, wie Ischämie, auf. Allerdings bleibt die Struktur und Regulierung des Gehirns ECS, vor allem in kranken Staaten, weitgehend unerforscht. Die RTI-Methode misst zwei physikalische Parameter des lebenden Gehirns: Volumenbruch und Tortuosität. Volumenanteil ist der Anteil des von ECS besetzten Gewebevolumens. Tortuosität ist ein Maß für die relative Hinderung, die eine Substanz beim Diffundieren durch ein Gehirn bekommtGion im Vergleich zu einem Medium ohne Hindernisse. In RTI wird ein inertes Molekül aus einer Quellenmikroelektrode in das Gehirn ECS gepulst. Da sich die Moleküle von dieser Quelle weg diffundieren, wird die sich ändernde Konzentration des Ions über die Zeit mit einer ionenselektiven Mikroelektrode gemessen, die etwa 100 μm entfernt ist. Aus der resultierenden Diffusionskurve können sowohl Volumenanteil als auch Tortuosität berechnet werden. Diese Technik wurde in Gehirnscheiben von mehreren Arten (einschließlich Menschen) und in vivo verwendet , um akute und chronische Veränderungen an ECS zu untersuchen. Im Gegensatz zu anderen Methoden kann RTI verwendet werden, um sowohl reversible als auch irreversible Änderungen des Gehirns ECS in Echtzeit zu untersuchen.

Einleitung

Der extrazelluläre Raum (ECS) ist das Netzwerk von miteinander verbundenen Kanälen außerhalb aller Gehirnzellen und enthält sowohl interstitielle Flüssigkeit als auch extrazelluläre Matrix ( Abbildung 1a und Abbildung 1b ). Die Verteilung von vielen Substanzen, die für die Gehirnzellfunktion erforderlich sind, einschließlich Nährstoffe, Hormone und Neurotransmitter, erfolgt durch Diffusion durch die ECS. Änderungen der physikalischen Parameter dieses Raumes, einschließlich Volumen, Geometrie und extrazelluläre Matrix, können die Diffusion durch die ECS und die lokalen Ionenkonzentrationen, die Gehirnzellen, die einen tiefen Einfluss auf die Gehirnzellfunktion 1 , 2 haben, drastisch beeinflussen.

Die Echtzeit-Iontophorese (RTI) dient zur Bestimmung von zwei strukturellen Merkmalen einer Hirnregion: Volumenanteil und Tortuosität 3 , 4 ,"Xref"> 5 Der Volumenanteil ( α ) ist der Anteil des von der ECS ( V ECS ) besetzten Gewebevolumens bezogen auf das gesamte Gewebevolumen ( V- Gewebe ) in einem repräsentativen Elementarvolumen;

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Tortuosität ( λ ) ist die relative Hinderung, dass eine Substanz beim Diffundieren durch eine Hirnregion im Vergleich zu einem Medium ohne Hindernisse begegnet;

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Wobei D * (cm 2 s -1 ) der effektive Diffusionskoeffizient der Substanz im Gehirn ist und D (cm 2 s -1 ) der freie Diffusionskoeffizient der Substanz in einem freien Medium, wie verdünntes Agarosegel, ist.

Heute ist die am häufigsten verwendete Sondensubstanz für die RTI-Methode ist das kleine Kation Tetramethylammonium (TMA). TMA hat ein Molekulargewicht von 74 g / mol, vollständig dissoziiert in Lösung und hat eine positive Ladung. RTI-Studien mit diesem Ion haben gezeigt, dass α figure-introduction-3 0,2 und λ figure-introduction-4 1,6 1 , 2 . Das bedeutet, dass die ECS etwa 20% des gesamten Hirnvolumens beträgt und dass die Diffusion eines kleinen, inerten Moleküls im ECS etwa 2,5 mal langsamer ist als in einem Medium ohne Hindernisse 3 . Jedoch variieren sowohl α als auch λ mit Hirnalter, Region und Zustand und in pathologischen Zuständen 1 . Veränderungen dieser Parameter wurden mit der Entwicklung des Gehirns, Alterung, Schlaf, Epilepsie und vielen anderen grundlegenden Prozessen und Erkrankungen des Gehirns verbunden 1, 6 Während andere Techniken α und λ messen, kann RTI sowohl in lokalisierten Regionen des lebenden Gewebes in Echtzeit messen. Aus diesem Grund ist RTI zu einem unverzichtbaren Werkzeug geworden, um Veränderungen in α und λ bei akuten und reversiblen Herausforderungen zu untersuchen.

Die Theorie, die RTI unterstützt, wurde ursprünglich von Nicholson und Phillips validiert, und die Technik wurde seit dieser Zeit 4 , 7 ausführlich verwendet. Experimente, die RTI einsetzen, beginnen mit der Freisetzung eines Pulses von TMA aus einer Quellenmikroelektrode durch Iontophorese in ein verdünntes Agarosegel. Einmal ausgestoßen, diffundieren die Ionen frei von der Punktquelle und wählen aus einer potentiell unendlichen Anzahl von zufälligen Pfaden ( Abbildung 1d ). Die sich ändernde Konzentration des Ions wird über die Zeit unter Verwendung einer ionenselektiven Mikroelektrode (ISM) gemessen, die grob positioniert ist100 μm entfernt ( Abbildung 1c ). Die Änderungen der TMA-Konzentration werden aufgezeichnet und an eine Kurve angepasst, die die Berechnung von D und der Transportnummer der Iontophorese-Mikroelektrode erlaubt (Parameter, die im Protokoll diskutiert werden). Mit diesen Werten wird die Prozedur in einem interessierenden Hirnbereich wiederholt, um D * zu erhalten und sowohl α als auch λ zu berechnen. Die Steuerung der Iontophorese-Mikroelektrode, die Datenerfassung, die graphische Darstellung und die Anpassung der TMA-Konzentrationskurve und die Berechnung der experimentellen Parameter erfolgt in der Regel durch die Programme Wanda und Walter, die speziell für diesen Zweck konzipiert wurden (die Software und ihre Handbücher sind Frei von den Autoren auf Anfrage erhältlich).

Der Abschnitt "Protokoll" dieser Überprüfung beschreibt die grundlegenden Verfahren, die für die Konstruktion und Durchführung von RTI in Nagetierhirnscheiben erforderlich sind. Die Technik wurde auch in Nicht-Stab verwendetModelle, einschließlich menschliche Gehirnscheiben und in vivo Gehirnpräparate 1 , 4 , 6 , 8 , 9 . Der Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" bietet sowohl ideale als auch nicht ideale Ergebnisse, um Nuancen bei der Dateninterpretation hervorzuheben. Schließlich behandelt der Diskussionsteil kurz die Techniken zur Fehlerbehebung, die Beschränkungen von RTI, alternative Techniken, die zum Studium der ECS und zukünftige Anwendungen von RTI verwendet werden.

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Abbildung 1: Diagramme der Diffusion durch ECS. ( A ) Diagramm der ECS: Zeigt die Größe und den Standort des ECS in einem typischen Gehirnteil an. Gelb markiert das ECS zwischen den grauen Gehirnzellenprozessen. Das Volumen des ECS beträgt etwa 20% des gesamten Gewebevolumens ( dh der Volumenanteil = 0.2) unter physiologischen Bedingungen. ( B ) Vergrößertes Diagramm des ECS: Highlights der physikalischen Parameter, die zur Tortuosität beitragen, einschließlich der Gehirnzellgeometrie (grau) und der extrazellulären Matrix (als Mesh von mehrfarbigen Glycosaminoglykanen und Proteoglykanen dargestellt). ( C ) 3D-Diagramm der Diffusion von einer Punktquelle: Demonstriert die Nettobewegung von inerten Molekülen von einer iontophoretischen Quelle zu einem ISM. Ohne Diffusionsbarrieren und zelluläre Aufnahme diffundieren Moleküle in alle Richtungen nach außen und erzeugen eine kugelförmige Konzentrationsfront. Das ISM quantifiziert die lokale Konzentration der aus der iontophoretischen Quelle freigesetzten inerten Moleküle. ( D ) Computersimulation der Diffusion in ECS des Gehirns: [Far left] Setup für Monte Carlo Simulation; Grüne Sphären stellen Gehirnzellenprozesse dar und das rote Kreuz stellt eine Punktquelle dar. Dieses Setup modelliert das in Abbildung 1a dargestellte Hirngewebe. [Mittlere Bilder] 3 und6 Moleküle, die zufällige Bewegungen durchführen, während sie durch den extrazellulären Raum des Gehirns diffundieren, in 2 Dimensionen gezeigt. [Weit rechts] Zufällige Spaziergänge von vielen Molekülen, die von der Punktquelle freigesetzt werden. Die Netzbewegung aller Moleküle von der Punktquelle ist nach außen, wie in Fig. 1c dargestellt, nach außen. Die kumulativen Zufallswege skizzieren die Räume zwischen den Zellen ( dh die ECS, siehe Referenz 5 für weitere Erläuterungen). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Protokoll

Alle Tierverfahren, die verwendet wurden, um Gewebeproben zu erhalten, wurden von der Tierethik-Komitee im SUNY Downstate Medical Center genehmigt.

1. Vorbereitung von Lösungen und Geräten

  1. Bereiten Sie eine 150 mM NaCl-Hinterfüllungslösung für den Referenztubus des ISM vor. Lagern Sie es in einer 10 ml Spritze, die an einem 0,22 μm Filter befestigt ist (um Bakterien oder Partikel zu entfernen).
  2. Vorbereiten einer 150 mM TMA-Chlorid (TMA-Cl) -Verfüllung für die Mikroelektroden. Lagern Sie es in einer 10 ml Spritze, die an einem 0,22 μm Filter befestigt ist. Bereiten Sie die TMA-Cl-Lösungen (in diesem Protokoll) von einer 5 M-Hersteller-Lagerlösung vor, um die korrekte Konzentration zu gewährleisten.
  3. Chloridieren Sie mindestens vier Silberdrähte für die Herstellung von Mikroelektroden, indem Sie die Drähte in Bleichmittel (Natriumhypochlorit) für mindestens 2 h eintauchen. Entfernen Sie überschüssiges Bleichmittel mit Ethanol und lassen Sie die Drähte trocknen.
  4. 50 ml 0,3% Agarose in 150 mM NaCl und 0,5 mM TMA-Cl in einem Becher zubereitenUnd decke es ab Verwenden Sie Agarose, die pulverisiert und relativ frisch ist, um gute Diffusionsmessungen zu gewährleisten.
  5. Die Agarose-Lösung mit einem Rührstab erhitzen und mischen, um sie aufzulösen. Lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen. Lagern Sie diese bei 4 ° C für bis zu 1 Woche.
  6. Eine gleichgültige (Grund-) Elektrode aus 4% Agarose in 1 M KCl (Richtungen in Ergänzung A)
  7. Füllen Sie eine kleine, poröse Tasse, die in die Versuchskammer passen kann und die eine elektrische Kontinuität zwischen ihrem Inhalt und der äußeren Umgebung ermöglicht ( Abbildung 2a ). Legen Sie einen Metallring auf die Unterseite dieses Bechers, um zu verhindern, dass er schwimmt, wenn er teilweise in Wasser eingetaucht ist.
  8. Verwenden Sie eine serielle Verdünnung eines 5 M TMA-Cl-Materials, um fünf 100 mL TMA-Cl-Lösungen für die Kalibrierung der ISMs herzustellen. Lösungen sollten Endkonzentrationen von 0,5, 1, 2, 4 und 8 mM TMA-Cl haben, alle in 150 mM NaCl. Bewahren Sie die Kalibrierlösungen in einer abdichtbaren Schale auf, um eine Verdunstung zu vermeiden/ Li>

2. Elektronisches Setup

  1. Verbinden Sie die Komponenten des RTI-Versuchsaufbaus gemäß dem Blockdiagramm in Abbildung 2b ; Einen Verstärker mit zwei Eingangskanälen (einer davon sollte sehr hochohmig für den ionenselektiven Fass des ISM sein), ein Tiefpassfilter auf 10 Hz, ein Schreiber, ein A / D + D / A Wandler, eine iontophoretische Einheit (oder ein Verstärker, der in der Lage ist, Konstantstromimpulse zu liefern) und einen Computer (PC), der die Wanda- und Walter-Programme ausführt. Überprüfen Sie das elektronische Setup, um zu bestätigen, dass alle Verbindungen vorhanden sind.
  2. Schützen Sie den Versuchsaufbau in einem geerdeten Gehäuse (wie zB einem Faraday-Käfig), wenn nötig, da ISMs einen hohen Widerstand haben und empfindlich auf Artefakte sind, die durch nahe gelegene Bewegungen entstehen.
  3. Erstellen Sie eine dedizierte ISM-Kalibrierstation, die aus einem Dual-Eingangsverstärker, einem Chartrekorder, einem entsprechenden ISM-Halter und einer gleichgültigen Masseelektrode besteht. Wenn möglich,Das Gehäuse abschirmen. Überspringen Sie diesen Schritt, wenn die ISMs im experimentellen Setup kalibriert sind (Schritt 3.29)

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Abbildung 2: Poröser Experimental Cup und Electronic Setup. ( A ) Poröser Experimentierbecher: Ein poröses Mesh wird verwendet, um eine experimentelle Tasse zu schaffen, die eine elektrische Kontinuität zwischen der Agarose (innen) und der experimentellen Badeflüssigkeit (außen) ermöglicht. Ein Metallring ist an der Unterseite des Bechers angebracht, um zu verhindern, dass der Becher in der Badelösung schwimmt. ( B ) Blockschaltbild des RTI-Setups (Schritte 2.1 und 2.2): Ein ISM ist mit einem Verstärker (Amp.) Verbunden. Das ISM hat zwei Fässer. Einer enthält einen flüssigen Ionenaustauscher (LIX) in der Spitze und erzeugt eine Spannung, die proportional zum Logarithmus der TMA-Konzentration an der Spitze zusammen mit der lokalen Umgebungsspannung ist; ThE-Signalweg wird durch eine rote Linie dargestellt. Der andere Fass des ISM ist als Referenzlauf bekannt und misst die Umgebungsspannung an der Spitze des ISM; Es ist durch einen blauen Signalweg verbunden. Der Verstärker hat zwei sogenannte Kopfstufen, die mit dem ISM verbunden sind; Diese Einheiten haben eine Verstärkung von 1 (x1) und passen die hohe Impedanz der Mikroelektrode auf die niedrige Impedanz des Restes der Verstärkerschaltung an. Die mit dem ionenselektiven Fass verbundene Kopfstufe muss in der Lage sein, einen ankommenden Widerstand von etwa 1.000 MΩ anzupassen, während der Widerstand des Referenztubus typischerweise etwa 10 MΩ beträgt. Nach dem Verlassen der Kopfstufe wird die Spannung von dem Referenztubus invertiert und von der Spannung an dem ionenselektiven Tubus unter Verwendung eines Summierverstärkers (& Sgr;) subtrahiert, um die reine Ionensignalspannung zu erhalten. Die Ausgänge des Verstärkers gehen zu einer Signalaufbereitungseinheit über, die eine zusätzliche Verstärkung und ein Multipol-Tiefpaßfilter (≤ 10 Hz, typischerweise ein Bessel fiLter), die Rauschen beseitigt und das Signal-Aliasing am Analog-Digital-Wandler (A / D) verhindert. Die Ausgänge des Filters werden auch auf einem Streifenschreiber angezeigt. Der A / D-Wandler digitalisiert die Signale und sendet sie an einen Personal Computer (PC). Der PC erzeugt auch ein digitales Signal, das von einem Digital-Analog-Wandler (D / A) in einen analogen Spannungsimpuls umgewandelt wird, der der Iontophoreseeinheit zugeführt wird, der die Spannung in einen Stromimpuls konstanter Amplitude umwandelt und sendet Zur Iontophorese-Mikroelektrode. Der Ionophorese-Signalweg wird durch eine grüne Linie dargestellt. Die Datenerfassung und das Iontophorese-Signal stehen unter der Kontrolle des Wanda-Programms, das eine Ausgabedatei für jeden Diffusionsdatensatz in Form einer Spannungs-Zeit-Aufzeichnung erzeugt, zusammen mit allen Parametern, die das Experiment definieren. Ein zweites Programm, Walter, liest die Ausgabedatei und verwendet ISM-Kalibrierdaten, um die digitalisierten Spannungen in Konzentrationen umzuwandeln. Die Konzentration veRsus Zeitkurven werden dann in Walter auf die entsprechende Lösung der Diffusionsgleichung eingepasst. D und n t extrahiert werden, wenn das Medium Agarose ist und λ und α extrahiert werden, wenn das Medium Gehirn ist. Analoge Signale sind durchgezogene Linien; Digitalsignale sind gestrichelte Linien. Es gibt auch eine gleichgültige Masseelektrode (nicht gezeigt) in dem Bad, das die Scheibe enthält. Rote Linien = Ionensignal, blaue Linien = Referenzsignal, grüne Linien = Iontophoresebefehl, feste Linien = analog, gepunktete Linien = digital. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

3. Vorbereitung und Kalibrierung von Ionen-selektiven Mikroelektroden

  1. Fertige ISMs unter Verwendung des Protokolls unter einem Tag vor dem Experiment. Machen Sie ISMs in Chargen, um sicherzustellen, dass mindestens zwei Arbeiten am Tag des Experiments.
    HINWEIS: Die meisten ISMs sind für einen Tag stabilzwei. ISM-Herstellung ist empfindlich gegenüber Feuchtigkeit und atmosphärischen Bedingungen. Nicht jede Mikroelektrode wird erfolgreich kalibrieren.
  2. Spähen Sie etwa 0,5 cm Glas am Ende eines der Fässer einer doppelten Barosilikatglas-Kapillare mit einer alten Pinzette.
  3. Chip ein einziges Fass auf dem gegenüberliegenden Ende der Kapillare ( Abbildung 3a ). Sicherstellen, dass das Septum nicht beschädigt ist (kritisch). Achtung: Schutzbrille tragen, um Verletzungen durch Geschossglas zu vermeiden.
  4. Legen Sie die Kapillare in eine Flasche Aceton für mindestens 1 Stunde, um Verunreinigungen zu entfernen.
  5. Entfernen Sie die Kapillare aus dem Aceton und pulsieren Sie sauberes, trockenes, komprimiertes Stickstoffgas oder Luft durch, um überschüssiges Aceton zu entfernen. Entfernen Sie alle Aceton in der Kapillare, da restliches Aceton die Silanisierung beeinträchtigen kann (entscheidend).
  6. Fixieren Sie die Spitze der Mikropipette entweder auf einem vertikalen oder horizontalen Abzieher. Schneiden Sie die Parameter, um eine Pipette mit einer langen Kegel zu ziehen undScharfe Spitze, ca. 1 μm oder weniger im Durchmesser. Am Ende dieses Schrittes wird eine Kapillare zu zwei Pipetten gemacht ( Abbildung 3a ).
  7. Visualisieren Sie eine einzelne Mikropipette unter einem zusammengesetzten, aufrechten Mikroskop mit einem 10fachen Objektiv. Schneiden Sie die Spitze mit einem Glasmikroskop-Objektträger ab, so dass der Enddurchmesser der Spitze ( dh beide Fässer) zwischen 2 und 5 μm liegt ( Abbildung 3b ). Diese Pipette wird ab sofort als ISM bezeichnet.
  8. Füllen Sie den abgebrochenen Fass des ISM mit 150 mM NaCl Referenzlösung durch die Öffnung auf der abgebrochenen Seite mit einer 10 ml Spritze, die an einem 0,22 μm Filter und einer 28 G, 97 mm Nadel befestigt ist ( Abbildung 3b ). Füllen Sie den Fass nicht an drei Viertel der Höhe des Fasses.
  9. Füllen Sie den nicht abgebrochenen Fass des ISM mit 150 mM TMA-Cl-Backfill-Lösung. Tippen Sie auf die ISM vorsichtig, um Luftblasen aus der Lösung zu klopfen. Überprüfen Sie auf Blasen unter dem MikrofonRoskopie zum Absplittern der Spitze
  10. Flamme die Rückseite des ISM mit einem Bunsenbrenner, um sicherzustellen, dass keine Kommunikation der Backfill-Lösung über das Septum auf der Rückseite des ISM auftritt. Stellen Sie sicher, dass das obere Viertel des ISM nach dem Flammen trocken ist.
  11. Setzen Sie einen chloridisierten Silberdraht in die Referenzlösung des ISM ein und biegen Sie den aus der Kapillare herausragenden Draht, um dies als Referenztubus zu markieren ( Abbildung 3c ). Stellen Sie sicher, dass der Draht in die Hinterfüllungslösung getaucht ist und für die Dauer des Experiments in Lösung bleibt.
  12. Schieben Sie eine kurze Länge von Polytetrafluorethylenschlauch (ca. 20 cm lang) über die Spitze einer 25 G Spritzenadel. Legen Sie das andere Ende des Schlauches in die Rückseite des ionenselektiven Fasses. Stellen Sie sicher, dass sich der Schlauch im Fass befindet, aber über der Hinterfüllungslösung ( Abbildung 3c ).
  13. Einen Zitronenstab mit einem Bunsenbrenner erhitzen und sowohl den Schlauch als auch den Silv abdichtenEr in ihre jeweiligen Fässer verdrahten ( Abbildung 3c ). Sicherstellen, dass eine komplette Luftdichtung um den Kunststoffschlauch im ionenselektiven Fass (kritisch) hergestellt wird.
  14. Einen kleinen, transparenten Glasbehälter (5 ml oder weniger) von 4% Chlortrimethylsilan in Xylol vorbereiten. Achtung: Xylol und Silane sind sehr gesundheitsgefährdend; Behandeln Sie beide Chemikalien in einer Dunstabzugshaube und verwerfen Sie angemessen.
  15. Positionieren Sie den Behälter vor einem Stereodissektionsmikroskop, das horizontal in einer Abzugshaube montiert ist. Sichern Sie den ISM vertikal über dem Behälter mit einem Mikromanipulator ( Abbildung 3d ).
  16. Tauchen Sie die Spitze der Mikroelektrode in die Chlortrimethylsilanlösung ein.
  17. Bringen Sie eine leere 10-ml-Spritze an die 25-gauge-Nadel, die zum ISM führt. Einen positiven Luftdruck von der Spritze auftragen, bis eine Blase der TMA-Cl-Lösung gebildet wird; Dieser Schritt sollte unter direkter Visualisierung durch das Mikroskop durchgeführt werden.
  18. Tippen Sie den ISM-Halter vorsichtig an, um die Blase von der Spitze zu klopfen.
  19. Die Chlortrimethylsilanlösung auf eine Höhe von etwa 1.500 μm in die Spitze des ISM unter Verwendung eines Unterdrucks auf die 10 ml-Spritze ziehen.
  20. Die Chlortrimethylsilanlösung vollständig von der Spitze des ISM ausstoßen, bis eine Blase der TMA-Cl-Lösung an der Spitze entsteht ( Abbildung 3d ).
  21. Wiederholen Sie die Schritte 3.19 und 3.20 fünfmal. Stellen Sie sicher, dass jeweils eine gleichmäßige, ununterbrochene Flüssigkeitssäule in die Spitze gezogen wird. Wenn keine Lösung in die Spitze gezogen werden kann, überprüfen Sie, ob der Schlauch blockiert ist, die Luftdichtung unvollständig ist oder die Spitze des ISM blockiert ist.
  22. Die Chlortrimethylsilanlösung aus der Spitze spülen, bis eine Blase der TMA-Cl-Lösung entsteht.
  23. Unter Beibehaltung eines positiven Drucks auf die Spritze, entfernen Sie das ISM aus der Xylol-Lösung. Stellen Sie sicher, dass alle Xylol-Lösung aus der ISM-Spitze ausgestoßen wird, da überschüssiges Xylol den Ausstoß ruiniertAufhänger Spalte in nachfolgenden Schritten erstellt.
  24. Legen Sie die Spitze des ISM in einen kleinen, transparenten Behälter (entweder der eine der Wärmetauscher oder eine kleine Küvette), der den flüssigen Ionenaustauscher (LIX) für TMA hält. Führen Sie diesen Schritt unter direkter Visualisierung mit dem horizontalen Mikroskop-Setup durch.
  25. Tragen Sie einen kleinen Betrag des Unterdrucks auf, um eine minimale Menge des LIX in die Spitze zu ziehen ( dh, sobald LIX in die Spitze eintritt, stoppen Sie, Unterdruck anzuwenden).
  26. Trennen Sie die 10-ml-Spritze vom Schlauch und lassen Sie das ISM für 5 min sitzen. Während dieser Zeit wird der LIX in die silanisierte Spitze eintreten, bis er einen Gleichgewichtszustand erreicht.
  27. Entfernen Sie das ISM vom LIX. Ziehen Sie den Schlauch aus dem Wärmetauscherrohr heraus (während Sie so wenig Wachs wie möglich entfernen). Legen Sie einen chloridisierten Silberdraht in die kleine Öffnung, die am hinteren Ende des ISM entsteht. Den Draht in der Hinterfüllung des Wärmetauscherrohres mit geschmolzenem Wachs abdichten.
  28. Lassen Sie das ISM sitzenFür mindestens 30 min. Befestigen Sie die fertigen ISMs an den Innenrand eines Bechers mit einem biegsamen, vorübergehenden Kleber.
  29. Kalibrieren Sie das ISM, indem Sie die von der ISM gemessene Spannung in jeder Kalibrierlösung, die in Schritt 1.8 durchgeführt wurde, aufzeichnen.
    HINWEIS: Die Kalibrierung kann in einer Kalibrierstation durchgeführt werden (siehe Schritt 2.3) oder im Versuchsaufbau. Dieses Verfahren ist in der Ergänzung B und in Haack et al. 10 skizziert.
  30. Wenn die ISM-Kalibrierung für mehrere ISMs erfolgreich war, pausieren Sie hier bis zum Tag der bestimmungsgemäßen Verwendung. Wenn nicht, fabriziere mehr ISMs.
  31. Am Tag des Experiments die Mikroelektrode erneut kalibrieren (siehe Schritt 3.29).

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Abbildung 3: Vorbereitung einer Ionen-selektiven Mikroelektrode. ( A ) ISM nach dem Absplittern der Kapillaren und Ziehen (Schritte 3.2-3.6): Ein einziges Fass an beiden Enden oFa-Glas-Kapillare ist abgebrochen. Ein ISM wird durch Ziehen einer doppelten Glaskapillare erzeugt, um zwei Mikropipetten mit feinen Spitzen zu erzeugen. ( B ) ISM nach dem Abfüllen der beiden Fässer (Schritte 3.7-3.9): Die Spitze eines einzelnen ISM wird auf einen Durchmesser von 2-5 μm abgebrochen. Der ionenselektive Fass wird mit TMA-Cl wieder gefüllt und der Referenztubus wird mit NaCl zurückgefüllt. ( C ) ISM vor dem Beschichten mit Chlortrimethylsilan (Schritte 3.11-3.13): Ein chlorierter Silberdraht wird in den Referenztubus eingeführt. Polytetrafluorethylen (PTFE) -Rohr ist mit einer 25 G-Nadel verbunden und in den ionenselektiven Fass eingesetzt. Eine luftdichte Abdichtung auf beiden Fässern wird mit Dentalwachs hergestellt. ( D ) Beschichtung einer Mikropipette mit Chlortrimethylsilan (Schritte 3.15-3.26): [Niedrige Vergrößerung] Ein in Chlortrimethylsilan suspendiertes ISM in Verbindung mit einem horizontal angebrachten Stereomikroskop. [Hohe Vergrößerung] Der Blick durch eine horizontal montierte StereomikroskopOpe einer ISM-Spitze in Chlortrimethylsilanlösung. Nach der Visualisierung der Spitze durch ein Mikroskop wird eine geringe Menge an TMA-Cl-Lösung aus dem ionenselektiven Fass ausgestoßen (genug, um eine kleine Blase der TMA-Cl-Lösung zu erzeugen). Der ISM-Halter wird abgegriffen, um eine TMA-Cl-Lösungsblase freizusetzen, und dann wird Chlortrimethylsilan in die Spitze gezogen. Dieser Zyklus wird mehrmals wiederholt. Nachdem das Chlortrimethylsilan aus dem ISM ausgestoßen worden ist, wird das ISM in den flüssigen Ionenaustauscher (LIX) für TMA gegeben und LIX wird in die Spitze des ionenselektiven Tubus gezogen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

4. Vorbereitung der Iontophorese Mikroelektroden

HINWEIS: Iontophorese-Mikroelektroden sollten am Tag des Experiments hergestellt werden.

  1. Ziehen Sie eine doppelte Barosilikatglas-Kapillare auf eine vertikale oder hoRizontaler Abzieher Schneiden Sie die Parameter, um eine Pipette ähnlich den in Schritt 3.6 gezogenen Mikropipetten zu ziehen ( Abbildung 4a ).
  2. Legen Sie die Mikropipette unter das in Schritt 3.7 verwendete Verbundmikroskop und schneiden Sie die Spitze mit einem Glasmikroskop-Objektträger ab, so dass der resultierende Durchmesser zwischen 2 und 5 μm liegt ( Abbildung 4a ).
  3. Füllen Sie beide Fässer mit der 150 mM TMA-Cl-Hinterfüllungslösung unter Verwendung einer 10 ml-Spritze, die an einem 0,22 μm-Filter und einer 28 G-, 97 mm-Nadel befestigt ist ( Abbildung 4a ).
  4. Tippen Sie vorsichtig auf die Mikropipette, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen in der Lösung der beiden Fässer verbleiben.
  5. Legen Sie chlorierte Silberdrähte in beide Fässer der Mikropipette. Stellen Sie sicher, dass die Drähte in den Hinterfüllungslösungen tief genug sind, damit sie für die Dauer des Experiments mit den Lösungen in Kontakt bleiben.
  6. Dichtung der Drähte in die Fässer mit heißem Dentalwachs. Vorsichtig verriegeln t Er drückt sich, indem er sie umeinander verdreht (abgeschlossene Mikroelektrode, die in Abbildung 4b gezeigt ist ).

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Abbildung 4: Vorbereitung einer Iontophorese-Mikroelektrode. ( A ) Iontophorese-Mikroelektrode nach dem Nachfüllen der beiden Fässer (Schritte 4.1-4.3): Eine Iontophorese-Mikroelektrode wird aus einem Kapillarrohr gezogen. Die Spitze der Mikroelektrode wird auf einen Durchmesser von 2-5 μm abgebrochen. Beide Fässer der Iontophorese-Mikroelektrode werden mit TMA-Cl-Lösung gefüllt. ( B ) Abgeschlossene Iontophorese-Mikroelektrode (Schritte 4.5-4.6): Eine Iontophorese-Mikroelektrode mit zwei chlorierten Silberdrähten, die in die Fässer eingeführt wurden. Die Fässer der Mikroelektrode sind mit Wachs versiegelt, und die Silberdrähte sind an der Rückseite der Mikroelektrode zusammengedreht./files/ftp_upload/55755/55755fig4large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

5. Vorbereitung von künstlichen Zerebrospinalflüssigkeits- und Nagetier-Gehirn-Tissue-Scheiben

  1. 1 l künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) mit einer für das Experiment geeigneten Zusammensetzung zugeben und 0,5 mM TMA-Cl dazugeben.
    HINWEIS: Der TMA-Cl ist notwendig, um während des Experiments eine Hintergrundkonzentration von TMA zu etablieren.
  2. Vorbereiten von Nagetierhirnscheiben mit einer Dicke von 400 μm gemäß den Standardprotokollen 11 , 12 . Verwenden Sie das in Schritt 5.1 vorbereitete ACSF für die Sezierung und Pflege von Hirnschnitten.

6. Echtzeit-Iontophorese in Agarose

  1. Schalten Sie den Computer mit den Walter- und Wanda-Programmen ein.
    HINWEIS: Diese Programme sind auf Anfrage frei verfügbar. Während diese Software ist nicht notwendig, Programmierung ähnlichSoftware oder die Durchführung der Analyse von Hand wäre ansonsten erforderlich.
  2. Führen Sie ACSF durch die Eintauchkammer mit einer geeigneten Rate ( zB 2 mL / min). Stellen Sie den Temperaturregler auf die gewünschte Temperatur und blasen Sie ACSF mit 95% O 2 /5% CO 2 (oder einem anderen geeigneten Gasgemisch) für die Dauer des Experiments.
  3. Montieren Sie eine gleichgültige (Erd-) Elektrode in einem geeigneten Halter und tauchen Sie die Spitze in den ACSF ein, der durch die Tauchkammer läuft. Verbinden Sie den Draht mit dem Boden des Aufzeichnungs-Setups.
  4. Füllen Sie den porösen Becher (hergestellt in Schritt 1.7) mit der zuvor hergestellten 0,3% Agarose und legen Sie ihn in die Eintauchkammer. Stellen Sie sicher, dass die Lösung nicht über die Oberseite des Bechers läuft.
  5. Sichern Sie ein kalibriertes ISM an den Pipettenhalter eines Mikromanipulators und eine Iontophorese-Mikroelektrode zum zweiten. Stellen Sie die Halterungen auf einen für den Aufbau geeigneten Winkel ein ( Abbildung 5a ).
  6. VerbindenDie ISM- und Iontophorese-Mikroelektrodendrähte zu ihren jeweiligen Kopfstufen des Aufzeichnungsverstärkers. Alternativ können Sie sich direkt an den Verstärker anschließen (abhängig vom Setup).
  7. Sicherstellen, dass das Gewicht / die Positionierung der Anschlussdrähte oder Clips keine Bewegung der Mikroelektroden verursacht, da kleine Schwankungen in der Positionierung die Ergebnisse beeinflussen können.
  8. Schalte das elektronische Setup ein (ab Schritt 2). Starten Sie Walter und Wanda in getrennten Fällen.
  9. Klicken Sie in der Wanda GUI auf "Calibrate" ( Abbildung 6a ). In der Kalibrierbox ( Abbildung 6b ) die bei der ISM-Kalibrierung gemessenen Spannungen ausfüllen (Schritt 3.29) und auf "Daten putzen" klicken.
    HINWEIS: Dies ermöglicht die Anpassung an die folgende Darstellung der Nicolsky-Gleichung (alternativ passen die Gleichung mit einem anderen Mittel, um M und K zu erhalten ):
    figure-protocol-4
    Ihre, V die gemessene Spannung (mV) ist, M die Nicolsky Steigung (mV) ist, C die Konzentration des Ions (mM), K ist die Interferenz (mm), und V 0 die Offset - Spannung (mV) 3.
  10. Klicken Sie im Feld Kalibrieren auf "Akzeptieren", um automatisch die in Schritt 6.9 erzeugte Steilheit ( M ) und Interferenz ( K ) in die Haupt-GUI zu übertragen.
    HINWEIS: Hierbei steht K für die Na-Interferenz, was meist vernachlässigbar ist.
  11. Auf der linken Seite der GUI stellen Sie sicher, dass alle experimentellen Parameter in entsprechenden Einträgen gesetzt sind ( Abbildung 6a ).
    1. Legen Sie im Feld Quellmethode die Quelle auf die iontophoretische Quelle (Standard), die "Record Duration" auf "200 s" (Standard), die "Pulse Begin" auf "10 s" (Standard), das "Pulse End" Auf "60 s" (Voreinstellung), der "Bias Current" auf "20 nA" (Standard), der"Hauptstrom" auf "100 nA" (Standard) und den "Umrechnungsfaktor" auf einen entsprechenden Wert.
    2. In der Messelektrodenbox "Bad C" auf die Konzentration der in der Badlösung enthaltenen TMA (ausgedrückt in mM) einstellen. Setzen Sie den "Total Gain", "Output Channel", "ISM Channel" und "Ref. Channel" auf geeignete Werte für das verwendete Datenerfassungssystem.
      HINWEIS: Der "Conversion Factor" muss auf einen geeigneten Wert eingestellt sein (spezifisch für die verwendete iontophoretische Einheit). Dieser Wert gibt die Strommenge an, die für eine gegebene angelegte Spannung aus dem D / A-Wandler (nA / mV) bestanden wird.
  12. Legen Sie eine Temperatursonde in die Agar-Tasse. Notieren Sie die gemessene Temperatur im Eintrag "Temperatur" im Feld "Messelektrode" der GUI ( Abbildung 6a ).
  13. Schalten Sie die Unterstufenbeleuchtung ein. Falls erforderlich, schalten Sie die Kamera an das Mikrofon anRoscope und Kameramonitor.
  14. Senken Sie die Mikroelektroden mindestens 1000 μm tief in die Agarose und zentrieren Sie sie in die Tasse ( Abbildung 5b ). Visualisieren Sie sie unter dem Mikroskop mit einem 10fachen Objektiv (Wasser-Immersions-Objektiv mit einem langen Arbeitsabstand).
  15. Versetzen Sie die Spannung am Verstärker auf 0 mV für beide Referenz- und ISM-Kanäle, um die in der Agarose aufgezeichnete Spannung als Grundlinienspannung festzulegen.
  16. Auf dem Zweikanalverstärker manuell den ISM-Kanalstecker zum Spannungs-Subtraktionsausgang bewegen, um die Subtraktion 'on' zwischen den Referenz- und ISM-Kanälen einzustellen.
    HINWEIS: Die Subtraktion stellt sicher, dass die Spannungsänderungen im ISM-Kanal die Änderungen der TMA-Konzentration allein widerspiegeln.
  17. Bewegen Sie das ISM so, dass es die Spitze der Iontophorese-Mikroelektrode berührt. Zentrieren Sie die Spitzen aufeinander in allen drei Richtachsen.
  18. Zuerst die relativen Positionen beider Mikroelektroden auf derMikromanipulator-Steuerkästen. Stellen Sie sicher, dass die Mikroelektroden genau und präzise (kritisch) zentriert sind.
  19. Bewegen Sie den ISM 120 μm von der Iontophorese-Mikroelektrode in einer Achse (die linke rechte Achse, Abbildung 5b ). Geben Sie diesen Abstand in das Feld "Messelektrode" der GUI ein ( Abbildung 6a ).
  20. Starten Sie eine Aufnahme, indem Sie im GUI auf "Acquire" klicken ( Abbildung 6a ); Erlauben Sie dem Programm, eine vollständige Aufnahme aufzunehmen.
    HINWEIS: Die Iontophorese-Mikroelektrode erhält einen konstanten Vorstrom. Nach dem Klicken auf "Acquire" gibt es eine kurze Verzögerung, bevor der Hauptstrom für eine begrenzte Dauer angewendet wird.
  21. Wiederholen Sie Schritt 6.20 zwei bis drei weitere Male. Warten Sie, bis das TMA-Signal vor dem Erwerb neuer Datensätze zur Grundlinie zurückkehrt. Das Programm speichert jeden Datensatz für spätere Analyse.
  22. Überprüfen Sie den Abstand der beiden Mikroelektroden durch Verschieben der ISM-Rückseite tO die von der Steuerbox angegebene Nullstellung. Wenn die Mikroelektroden nicht mehr zentriert sind, zentrieren Sie sie wieder mit der gleichen Strategie wie in Schritt 6.17. Aufzeichnen von Änderungen in der Position der Elektroden.
    HINWEIS: Wenn sich der Abstand um mehr als etwa 2% ändert, können die in Schritt 6.19 erworbenen Aufzeichnungen nicht als richtig betrachtet werden und neue müssen genommen werden.

figure-protocol-5
Abbildung 5: Einrichtung für Experimente in Agar. ( A ) Einrichten für das Experiment in verdünntem Agar (Schritte 6.1-6.5): Ein kleiner, poröser Behälter, der mit verdünntem Agar gefüllt ist, der in eine laufende Perfusionskammer gelegt wird. Eine Iontophorese-Mikroelektrode (linke Seite) und eine ISM (rechte Seite) werden von Mikroelektrodenhaltern gehalten; Mikroelektrodenhalter werden in die Arme von Roboter-Mikromanipulatoren eingepasst. Eine Temperatursonde wird in Agar-Gel gelegt, und eine gleichgültige Masseelektrode ist plInnerhalb der Unterwasserkammer. ( B ) Vergrößerte Ansicht von Mikroelektroden in Agar: Eine Ionentophorese-Mikroelektrode (linke Seite) und eine ISM (rechte Seite) werden in Agar unter Verwendung eines 10fachen Wassereintauchobjektivs (Ziel, das hier in 150 mM NaCl eingetaucht ist) sichtbar gemacht. Mikroelektroden werden mit Mikromanipulatoren bis zu einer Tiefe von 1.000 μm positioniert; Der Abstand zwischen den Mikroelektroden beträgt 120 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

figure-protocol-6
Abbildung 6: Wanda Computer Software Interface. ( A ) Navigieren von Wanda grafische Benutzeroberfläche (GUI): Der Bildschirm, der nach dem Öffnen der Wanda Software erscheint. In Kasten (1) werden das entsprechende Medium, das Iontophorese-Molekül und die Technik ausgewählt. (2) "Kalibrieren" wird angeklickt, um zu öffnenDie Wanda Kalibrierbox. Nach dem Kalibrieren des ISM (siehe Abbildung 6b und Supplement B) wird das ISM in Agar oder Gehirn positioniert, wie in den Schritten 6 und 8 des Protokolls beschrieben. In Feld (6) werden alle geeigneten Werte für das durchgeführte Experiment eingegeben. (7) "Acquire" wird angeklickt, um eine Aufnahme zu machen. Ein Diagramm der Spannung über der Zeit erscheint im oberen rechten Teil der Wanda GUI. ( B ) Kalibrieren von ISM in Wanda : Das Fenster, das nach dem Klicken auf (2) "Kalibrieren" in der Wanda GUI öffnet. Die Werte aus Schritt 3.29 werden in Feld (3) eingetragen und (4) "Anpassen von Daten" ausgewählt. Die Eichkurve wird als linear bezeichnet. (5) "Accept" wird angeklickt, um zur Wanda GUI zurückzukehren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

7. Agarose-Datenanalyse

  1. Öffne dasWalter Programm auf dem Computer (PC). Klicken Sie im Menü "0. Records From:" auf die Schaltfläche "Wanda / VOLTORO", um die von Wanda erzeugten Aufzeichnungen zu lesen ( Abbildung 7a ). Wenn Sie diese Ausgabe in eine Tabellenkalkulation eintragen möchten, öffnen Sie die entsprechende Software. Klicken Sie auf "Blatt 1,3" in der "1. Schreiben Excel?" Menü ( Abbildung 7b ).
  2. Wählen Sie im nächsten Popup-Fenster die zu lesenden Datensätze aus und klicken Sie auf "Öffnen" ( Abbildung 7b ); Beachten Sie, dass die Aufzeichnungen automatisch erfasst werden. Um die Anpassungsprozedur zu beginnen, führen Sie die folgenden Schritte aus.
    1. Klicken Sie im Menü "2. Optionen" auf die Schaltfläche "Select rec". Im Popup-Fenster " Bild 2 " mit der Maus das Fadenkreuz über den ersten zu verarbeitenden Datensatz verschieben ( Abbildung 7c ); Drücken Sie eine der beiden Maustasten, um den Datensatz auszuwählen.
    2. Klicken Sie auf oN "Fit Kurve" im Menü. Wählen Sie die gewünschte Anzahl von Iterationen aus. Verwenden Sie mindestens 20 Iterationen der Montage, um eine genaue Passung der Daten zu erhalten.
    3. Wählen Sie im Menü "alle", um alle Datenpunkte zu platzieren und wählen Sie "Weiter". Das Programm passt die angezeigte Kurve an. Beachten Sie die Montage und vergleichen Sie die experimentelle Aufzeichnung mit der besten angepassten Kurve erhalten.
  3. Wählen Sie die Option, um das Ergebnis in das entsprechende Tabellenkalkulationsprogramm zu schreiben, indem Sie im Menü "7. Ergebnisse" auf "Excel" klicken ( Abbildung 7d ). Beachten Sie die folgenden kritischen Daten, die zur Bestimmung der Funktionalität der Iontophorese-Mikroelektrode verwendet werden: ' D (E5) ', ' Referenz D (E5) ', ' r_app ', Transportnummer ' n t ', ' Scheinbar N t '.
    HINWEIS: " D (E5) ": Gemessene freie DiffusionskoeffizientenTx 10 5 (cm 2 / s); " Referenz D (E5) ": Theoretischer freier Diffusionskoeffizient x 10 5 (cm 2 / s). Dieser Wert wird aus einer Datenbank in Walter basierend auf dem Ion, dem Medium und dem Temperatureingang extrahiert. " R_app ": Scheinbarer Mikroelektrodenabstand (cm), berechnet auf der Grundlage der gemessenen und Referenz D (E5) . " N t ": Transportnummer (dimensionslos). Diese Zahl bestimmt den Bruchteil des Iontophorese-Stroms, der zur Freisetzung von TMA 4 verwendet wird . " Scheinbar n t ": Scheinbare Transportnummer (dimensionslos). Dies ist eine von r_app berechnete Transportnummer . Diese Zahl sollte in der Nähe der gemessenen n t liegen .
  4. Wiederholen Sie die Schritte 7.1-7.3 für jedes der Datensätze für ein ausgewähltes Paar von Mikroelektroden.
  5. Bestimmen Sie, ob die Iontophorese-Mikroelektrode verwendbar ist, indem Sie folgendes verwenden.
    1. Vergleiche " r_app" mit dem aktuellen r ( dh 120 μm); Dieses Kriterium ist erfüllt, wenn die Durchschnittswerte aus allen Prüfungen innerhalb von 4% liegen.
    2. Vergleiche " D (E5)" mit der Referenz D (E5) ; Dieses Kriterium ist erfüllt, wenn die Durchschnittswerte aus allen Prüfungen innerhalb von 8% liegen.
    3. Vergleichen Sie die " n t " zwischen Versuchen mit der gleichen Mikroelektrode; Dieses Kriterium ist erfüllt, wenn die Durchschnittswerte aller Prüfungen innerhalb von 10% liegen.
  6. Wenn eines der Kriterien aus Schritt 7.5 nicht erfüllt ist, beheben Sie die Iontophorese-Mikroelektrode oder beginnen Sie, eine andere zu testen.
  7. Wenn die Ionophorese-Mikroelektrode für das Experiment als geeignet erachtet wird, notieren Sie die durchschnittliche Transportnummer aus allen Versuchen im Feld "Transport Num N" im Wanda GUI ( Abbildung 6a ).

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Abbildung 7: Walter Computer Software Interface. ( A ) Auswahl des Datenerfassungsprogramms in Walter: Nach dem Start der Walter-Software öffnet sich das Menü "0. Records From:". Die Option zum Laden der von Wanda gespeicherten Datensätze wird durch Klicken auf die Schaltfläche "Wanda / Voltoro" ausgewählt. ( B ) Auswahl der Daten- und Datenanalyse Ausgabeort in Walter: [Links] Nach dem Öffnen des entsprechenden Tabellenkalkulationsprogramms wird "Blätter 1,3" gewählt, um alle Walter-Datenanalysen an das zuvor geöffnete Tabellenkalkulationsprogramm auszugeben. [Right] Nach dem Auswählen der Datenanalyse wird ein Popup-Fenster geöffnet, das es dem Benutzer ermöglicht, die ersten und letzten Aufnahmen von Walter zu lesen. ( C ) Auswahl der Aufnahme in Walter zu analysieren: [Rechts] Nachdem die zu lesenden Dateien ausgewählt sind, öffnet sich ein Popup-Fenster mit allen ausgewählten DatensätzenAls Grafik gespielt (" Abbildung 2 "). [Links] Im Menü "2.Options" wird "select rec" geklickt, und die Maus wird verwendet, um das Fadenkreuz zu bewegen, um die erste Aufzeichnung für die Analyse zu identifizieren. Es wird entweder die Maustaste gedrückt, um die Aufnahme zu wählen. ( D ) Export der Datenanalyse von Walter in eine Tabellenkalkulation: Nach dem Anpassen der Daten erscheint ein Popup-Fenster und das Menü "7. Ergebnisse". [Links] Grafik der gewählten Aufnahme (blau) mit der durch Walter (rot) erzeugten Diffusionskurve. [Rechts] Das Menü "7. Ergebnisse" ermöglicht es dem Benutzer, die Daten aus der Analyse in ein Tabellenkalkulationsprogramm zu schreiben, indem man auf die Schaltfläche "Excel" klickt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

8. Echtzeit-Iontophorese in Gehirnscheiben

  1. Lege ein 400 μm dickes Gehirn sLäuse in der Aufnahmekammer, um sicherzustellen, dass es vollständig in den fließenden ACSF untergetaucht ist. Positionieren Sie die Scheibe mit einem Aquarell-Pinsel und sichern Sie sie vorsichtig mit einem Raster.
  2. Bewegen Sie sowohl die Iontophorese-Mikroelektrode als auch die ISM über dem interessierenden Bereich auf der Gehirnscheibe. Tauchen Sie beide in die fließende ACSF, aber über die Scheibe.
  3. Versetzen Sie die Spannung sowohl für die Referenz- als auch die Ionen-Sensorkanäle auf "0" mV. Warten Sie, bis sich die Spannung in beiden Kanälen stabilisiert hat. Markieren Sie auf dem Kartenrekorder die auf dem Ionensensorkanal des ISM gemessene Spannung. Verwenden Sie diese Option, um den Grundlinien-V-Parameter in Wanda zu berechnen.
  4. Legen Sie die ISM- und Iontophorese-Mikroelektrode 200 μm tief in die Scheibe und 120 μm voneinander weg. Warten auf die Stabilisierung des Signals nach dem Bewegen der Mikroelektrode in die Gehirnscheibe.
    HINWEIS: Der Bias-Strom, der auf die Iontophorese-Mikroelektrode angewendet wird, bewirkt eine kleine Akkumulation von TMA. Es ist ein häufiger Fehler, ar zu nehmenEcording zu früh und unterschätzen den Signalaufbau.
  5. Auf dem Kartenrekorder markieren Sie die stabilisierte Spannung, die in der Hirnscheibe auf dem Ionenerkennungskanal des ISM gemessen wird. Berechnen Sie die Spannungsdifferenz zwischen dem in Schritt 8.3 und Schritt 8.4 gemessenen TMA-Signal und geben Sie diesen Wert in das Feld "Baseline V (mV)" in der Measuring Electrode Box der Wanda GUI ein ( Abbildung 6a ).
  6. Auf der linken Seite der GUI sicherstellen, dass alle experimentellen Parameter korrekt aufgezeichnet / eingegeben werden. Setzen Sie "Medium" auf "Gehirn", "Transportnummer" auf den Mittelwert, der für die Iontophorese-Mikroelektrode in Schritt 7.4 berechnet wurde, und "Temperatur" auf die Temperatur des Bades, das die Scheibe enthält.
    HINWEIS: V muss für jeden Satz von Messungen aufgezeichnet werden. Die Grundlinie V wird von Wanda in den Baseline- C (mM) -Parameter ( dh die Konzentration von TMA im Hirngewebe) umgewandelt.
  7. Starten Sie die Aufnahme, indem Sie auf "Acquire" klicken und es erlauben, eine vollständige Aufnahme zu machen. Warten Sie, bis das TMA-Signal vor dem Erwerb einer neuen Aufnahme zur Grundlinie zurückkehrt.
  8. Nehmen Sie zwei bis drei aufeinanderfolgende Aufnahmen, bevor Sie die Mikroelektroden aus dem gewählten Gehirnort entfernen. Geben Sie die Temperatur vor der Aufnahme sofort in die Wanda Software ein.
  9. Bewegen Sie beide Mikroelektroden diagonal zurück auf die Oberfläche der Scheibe. Heben Sie beide auf mindestens 50 μm über der Scheibe an. Mit dem Kartenrekorder legen Sie jede Änderung zwischen dem nun gemessenen V und seiner Messung aus Schritt 8.3 fest.
  10. Zentrieren Sie die Spitzen des ISM und die iontophoretischen Mikroelektroden relativ zueinander in den x-, y- und z-Achsen. Erhalten Sie Abstandsänderungen, falls vorhanden, aus der Anzeige der Mikromanipulator-Steuerbox.

9. Hirndatenanalyse

  1. Öffnen Sie eine neue Kalkulationstabelle für die Analyseausgabe.
  2. Wiederholen Sie die Schritte 7.1-7.4 in Walter, um zu analysierenDie Aufnahmen aus dem Gehirn.
  3. Schreiben Sie die Daten in das Tabellenkalkulationsprogramm, indem Sie im Walter-Menü auf "Excel" klicken. Aufzeichnen des α , Volumenanteils des Gehirns ECS; Λ , Tortuosität des Gehirns ECS; Und k (s -1 ), unspezifischer Abstand.

10. Transportnummer und ISM-Kalibrierung überprüfen

  1. Messen Sie die ISM-Transportnummer ( n t ) am Ende des Experiments mit dem untenstehenden Protokoll. Alternativ können Sie n t nach kritischen Studien oder bei Messungen anomal erscheinen. Allerdings kann die Überprüfung von n t zu viele Male zu Trauma auf die Gehirnscheibe führen.
  2. Neue Aufnahmen in Agarose aufnehmen. Siehe Schritte 6.4, 6.11, 6.12, 6.14, 6.15 und 6.17-6.22.
  3. Wiederholen Sie die Schritte 7.1-7.4 in Walter, um die n t aus den neuen Agaroseaufnahmen zu erhalten. Überprüfe die Kalkulationstabelle: Wenn sich das n t um mehr verändert hatAls 10% aus dem vor der Gehirnmessung erhaltenen n t , sind die mit dieser iontophoretischen Mikroelektrode erhaltenen Daten nicht zuverlässig.
  4. Führen Sie eine neue Kalibrierung durch (siehe Schritt 3.29) für das ISM, nachdem alle Gehirndaten gesammelt wurden. Verwenden Sie neu eingegebene ISM-Kalibrierdaten als Eingabe in der Wanda Calibrate Box (siehe Schritte 6.9 und 6.10) und prüfen Sie, ob sich der Slope-Wert um weniger als 10% gegenüber der vorherigen Kalibrierung unterscheidet.
    HINWEIS: Die mit diesem ISM erhaltenen Daten sind nicht zuverlässig, wenn sich der Neigungswert um mehr als 10% gegenüber der vorherigen Kalibrierung unterscheidet.

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Ergebnisse

Der Nutzen der RTI-Technik wird in einem Experiment demonstriert, das entworfen ist, um die Änderungen in α und während einer hypoosmolaren Herausforderung zu messen ( Abbildung 8 und Abbildung 9 ). Es wurde bereits gezeigt, dass die Verringerung der Osmolarität des ECS durch Waschen auf hypotonischem ACSF eine Abnahme von & agr; und eine Erhöhung von & lgr; 13 bewirkt. ...

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Diskussion

figure-discussion-1
Abbildung 10: Nicht-ideale Daten, die gemeinsame technische Probleme demonstrieren. ( A ) Diagramme allgemeiner technischer Fragen mit Iontophorese-Mikroelektroden: Vergleich der normalen Freisetzung von TMA aus einer funktionierenden Iontophorese-Mikroelektrode mit drei Quellen, die technische Probleme zeigen. [Hohe Vergrößerung, a1] Der Strom in einer idealen iontophoretischen Quelle wird glei...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Die Arbeit wurde von NIH NINDS bewilligt R01 NS047557 unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
A/D- und D/A-WandlerNational Instruments CorporationNI USB-6221 DatenerfassungDas NI USB-6221 wird von NI nach wie vor als "Legacy"-Gerät verkauft. Für Neuinstallationen wird die Verwendung von Datenerfassungsgeräten der USB-6341-X-Serie von NI empfohlen, die neueren Geräte wurden jedoch nicht getestet. Wir beschreiben die Verwendung des NI USB-6221 mit MATLAB und Windows 7 (32-Bit). Alternativen: der deutlich ältere PCI-MIO-16E-4 A/D-Wandler (wird nur unter Windows XP oder älteren Betriebssystemen verwendet) mit BNC-2090 BNC-Anschlussfeld und SH68-68-EP-Kabel. Wie im Wanda-Handbuch erwähnt, steht ein experimentelles MATLAB-Programm zur Verwendung von Axon-Binärdateien zur Verfügung.
AgaroseLonza NuSieve GTG Agarose #50081zur Herstellung von verdünntem Agarose-Gel für RTI-Messungen
Verstärker für ISMDaganModell IX2-700 Dual Intracellular VorverstärkerIonen- und Referenzspannungsverstärker mit N=0,1 (für Referenzzylinder) und N=0,001 (für Ionenzylinder) Kopftische
Biologisches Verbindungsmikroskop (mit 4x und 10x Objektiv)zum Chippen der Mikroelektrodenspitzen und zur Inspektion von Mikroelektroden; diverse Anbieter, z.B. AmScope
Borosilikat-Theta-KapillarglasröhrenHarvardApparatus Warner Instruments Modell TG200-4; Best.#64-0811Doppelläufige Glasröhren für ionenselektive Mikroelektroden und iontophoretische Mikroelektroden; AD 2,0 mm, I.D. 1,4 mm, Septum 0,2 mm, Länge 10 cm
BürsteWinsor & NewtonUniversity Series 233,Bürste mit rundem Griff der Größe 0, erhältlich bei Amazon
BunsenbrennerFisher-Kamera
zur Visualisierung von MikropipettenOlympusOLY-150erfordert Monitor, IR-Filter an der Untertischbeleuchtung ist optionaler
Diagrammschreiberkontinuierliche Aufzeichnung der Spannungen an der ionenselektiven Mikroelektrode während der Kalibrierung in Tetramethylammonium-Standards und während des RTI-Experiments; z.B. Kipp & Zonen Typ BD112 Doppelkanaldiagramm aufgezeichnet, verfügbar generalüberholtes
Chlortrimethylsilan, puriss., > 99%Sigma-AldrichKatalog # 92360für die Silanisierung; ACHTUNG: brennbar, akute Toxizität (oral, dermal, inhalativ), Korrosion der Haut, Augenschäden, reagiert heftig mit Wasser, siehe Sigma-Aldrich Sicherheitshinweise für eine vollständige Beschreibung
Kommerzielle SoftwareThe MathWorksMATLAB, Datenerfassungs-Toolboxzur Datenerfassung und -analyse mit Wanda- und Walter-Programmen. Beachten Sie, dass eine akademische Lizenz verfügbar ist.
AugenschutzbrilleFisher Compound-Mikroskop
festem TischOlympusBX51WIkann andere Compoundmikroskope mit festen Tischen verwenden
PinzetteFine Science Tools#11251-10zum Absplittern von Glaskapillaren; Dumond #5, bevorzugt verwendet und nicht mehr benötigt für Feinarbeitsabzüge
zur Silanisierung und Befüllung der Spitze des ionenselektiven Zylinders mit flüssigem Ionenaustauscher; verschiedene Halterungen, z.B. Kappe mit passendem Filter, verkauft von Erlab
Glasmikroskop-ObjektträgerFisher#12-550Azum Chipen von Mikroelektrodenspitzen
Heizung/RührerFisherCorning PC-420Dzur Herstellung von verdünntem Agarosegel und Rührlösungen
iontophoretische EinheitDaganION-100 und PS-100ION-100 eine Einkanal-Iontophoreseeinheit mit +/- 130 V Konformität; PS-100 ist ein externes Netzteil; Alternativen: z.B. Axoprobe-1A von Axon Instruments (jetzt Molecular Devices), nicht mehr in Produktion, auf Verfügbarkeit von generalüberholten Geräten prüfen (eBay und andere Websites)
Flüssiger Ionenaustauscher (LIX) für TetramethylammoniumWorld Precision InstrumentsIE190 Kalium-IonenaustauscherHinweis: Dies entspricht dem originalen Corning Kaliumaustauscher 477317 auf Basis von Tetraphenlyborat - nicht mit neutralem Träger-Kaliumaustauscher verwechseln aus dem Laboartorium von Dr. Simon, ETH, Zürich, das Tetramethylammonium nicht erkennt, und wird von Fluka vertrieben. Sie können auch selbst einen flüssigen Ionenaustauscher für Tetramethylammonium herstellen: 3 Gew.-% Kaliumtetrakis = (p-Chlorphenyl) Borat, gelöst in 2,3-Dimethylnitrobenzol. Kaufen Sie Chemikalien von Fluka (jetzt Teil von Sigma). Vgl. Oehme und Simon (1976) Anal. Chim. Akta 86: 21-25; ACHTUNG: Die toxikologischen Eigenschaften dieses flüssigen Ionenaustauschers sind noch nicht vollständig bestimmt. Das Verschlucken oder der Kontakt mit dem menschlichen Körper kann schädlich sein. Seien Sie vorsichtig! Flüssigionenaustauscher sollten an einem kühlen Ort ohne direkte Sonneneinstrahlung gelagert werden.
MikroelektrodenhalterWPIM3301EHzum Halten von ionenselektivem Mikroeletrod-Vorgefertigtem für die Silanisierung und zum Befüllen der Spitze des ionenselektiven Zylinders mit flüssigem Ionenaustauscher; WPI verkauft zwei Versionen dieses Halters, klares M3301EH und schwarzes M3301EH. Unserer Erfahrung nach scheint das klare M3301EH stabiler zu sein als das schwarze M3301EH.
MikromanipulatorNarishigeMM-3zum Positionieren der ionenselektiven Mikroelektrode vorgefertigt während der Silanisierung und Befüllen der Spitze des ionenselektiven Zylinders mit dem flüssigen Ionenaustauscher; kann durch einen beliebigen dreiachsigen Mikromanipulator in gutem Betriebszustand ersetzt werden
MikropipettenabzieherSutter InstrumentsModell P-97zum Ziehen von doppelläufigen Glasröhren; Andere Abzieher können verwendet werden, solange sie ein doppelläufiges
MikrosondenthermometerPhysiotempModell BAT-12RDie feine Sonde dieses Thermometers wird in der Nähe der
Nadel der Aufzeichnungsstelleder BD-Spritzenund der Nadeln # 305122 (25 Gauge)für die Silanisierung platziert; BD PrecisionGlide Nadeln 25 G x 5/8 Zoll (0,5 mm x 16 mm)
Objektiv 5X trockenOlympusMPlan N
Objektiv 10X WasserimmersionOlympusUMPlan FL N10X Objektiv ist Wasserimmersion, numerische Apertur beträgt 0,3, Arbeitsabstand beträgt 3,3 mm
Kunststoffbehälter (mit Deckel)Fisher#14-375-148zur Lagerung von Tetramethylammonium-Standardlösungen und Mikroelektroden
Plattform und x-y-Translationstisch für festes MikroskopEXFOGibraltar Burleigh-Plattformfür Scheibenkammer, Mikromanipulatoren und Zubehör, x-y-Translationstisch bewegt das Mikroskop ohne Kompromisse bei der Aufnahmestabilität
Poröser Minicupfür RTI-Messungen in einem verdünnten Agarose-Gel; selbstgemachter
wiederverwendbarer KlebstoffBostikBlu-Tackzur Befestigung von Mikroelektroden an einem Haltegefäß und für andere Zwecke; Verschiedene Anbieter, erhältlich bei Amazon
Roboter-Mikromanipulator mit präziser X,Y,Z-PositionierungSutter InstrumentsMP-285werden zwei Mikrominipulatoren benötigt, um die ionenselektive Mikroelektrode und die iontophoretische Mikroelektrode getrennt zu halten. Es ist auch möglich, Mikropipetten in einem beabstandeten Array zu kleben (siehe Text).
Signalkonditioniergerät mit TiefpassfilterAxon InstrumentsCyberAmp 320 oder 380Hersteller nicht mehr lieferbar, evtl. aber bei E-Bay; Alternativen: z.B. FLA-01 Filter/Verstärker von Cygnus Technology. Dabei handelt es sich um ein Einkanal-Instrument mit einer minimalen Grenzfrequenz von 10 Hz unter Verwendung eines mehrpoligen Bessel-Filters, aber das Unternehmen ist möglicherweise bereit, es bei Bedarf für eine niedrigere Grenzfrequenz (2 Hz) zu modifizieren.
SilberdrahtA-M Systems#7830Durchmesser 0,015", blanke (keine Beschichtung)
ScheibenkammerHarvard ApparatWarner Modell RC-27Ldies ist eine Tauchschicht-Schichtkammer; verwenden Sie kein Grenzflächen-Schichtkammer-Stereomikroskop
zur Silanisierung und zum Befüllen der Spitze des ionenselektiven Zylinders mit Flüssigkeits-Ionenaustauscher; horizontal montiert;
Spritze verschiedener Lieferanten, 10 mLBDSpritzen und Nadeln #309604zum Hinterfüllen von Mikroelektroden und zur Silanisierung; BD Luer-Lok Spitze
Spritzenfilter 0,22 & Mikro; m PoreWhatman#6780-1302zum Filtern von Verfülllösungen; erhältlich von Fisher
Spritzennadel, 28 Gauge, 97 mmWorldPrecision Instruments MicroFil MF28G-5zum Verfüllen von Mikroelektroden
Teflon (=PTFE) SchlauchKomponentenversorgungSTT-28 PTFE Schlauch Lichtwand (28 Gauge)zur Silanisierung von ionenselektiven Zylindern; passt auf BD PrecisionGlide Nadeln 25 G x 5/8 Zoll. Hinweis: Teflon ist unerlässlich, PVC-Schläuche würden durch heißes Wachs schmelzen.
TemperaturregelsystemHarvard ApparatWarner Modelle TC-344B und SH-27ATC-344B ist ein dualer automatischer Temperaturregler, SH-27A ist ein Inline-Heizer; Regler und Heizung arbeiten mit Warner Slice Chambers
Tetramethyammonium (TMA)chlorid Sigma-AldrichT-34115 M Lösung; ACHTUNG: akute Toxizität (oral, dermal, inhalativ), Karzinogenität, gefährlich für die aquatische Umwelt, siehe Sigma-Aldrich Sicherheitshinweise für eine vollständige Beschreibung
vibrierendes KlingenmikrotomLeicaVT1000Szum Schneiden von Gehirnschnitten
Xylole FisherX5-1zur Silanisierung; ACHTUNG: brennbar, akute Toxizität (oral, dermal, inhalativ), Ätzwirkung auf die Haut, Augenschäden, Karzinogenität, siehe Fisher Sicherheitsinformationen für eine vollständige Beschreibung
mit ist die mit doppeltem Durchmesser aufnehmen können , vom

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