Dieses Manuskript beschreibt die richtigen Vibrio Cholerae-Instandhaltungstechniken zusätzlich zu einer Reihe von biochemischen Assays, die gemeinsam für eine schnelle und zuverlässige Differenzierung zwischen klinischen und ökologischen V verwendet werden. Cholerae-Biotypen im Laborbereich.
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Methodenartikel
Labortechniken zur Aufrechterhaltung und Differenzierung von Biotypen von
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das aquatische Gram-negative Bakterium Vibrio cholerae ist der ätiologische Wirkstoff der infektiösen Magen-Darm-Cholera. Wegen der globalen Prävalenz und Schwere dieser Krankheit, V. Cholerae wurde sowohl im Umwelt- als auch im Laborbereich umfassend untersucht und erfordert eine ordnungsgemäße Instandhaltungs- und Kultivierungstechniken. Klassik und El Tor sind zwei Hauptbiotypen, die das V bilden . Cholerae O1 Serogruppe, die jeweils einzigartige genotypische und phänotypische Eigenschaften aufweisen, die zuverlässige Mechanismen für die Biotypcharakterisierung liefern und unterschiedliche Virulenz induzierende Kultivierungsbedingungen erfordern. Unabhängig von der Biotype des ursächlichen Stammes für jede gegebene Infektion oder Ausbruch, die Standard-Behandlung für die Krankheit beinhaltet Rehydratationstherapie ergänzt mit einem Regime von Antibiotika. Allerdings kann eine Biotyp-Klassifikation für Laboruntersuchungen erforderlich sein und kann im biomedizinischen Bereich breitere Auswirkungen haben.In den frühen 2000er Jahren wurden klinische Isolate identifiziert, die genotypische und phänotypische Merkmale sowohl von klassischen als auch von El Tor Biotypen aufweisen. Die neu identifizierten Hybriden, die als El Tor-Varianten bezeichnet wurden, haben dazu geführt, dass die klinische und ökologisch isolierte Biotypidentifikation komplexer wird als die bisherigen traditionellen Einzelassay-Identifikationsprotokolle. Neben der Beschreibung von V. Cholerae-Instandhaltungs- und Kultivierungstechniken beschreibt dieses Manuskript eine Reihe von gen- spezifischen ( ctxB- und tcpA ) PCR-basierten genetischen Bildschirmen und phänotypischen Assays (Polymyxin B-Resistenz, Citrat-Metabolismus, proteolytische Aktivität, hämolytische Aktivität, Motilität und Glukosestoffwechsel über Voges- Proskauer-Assay), der gemeinsam zur Charakterisierung und / oder Unterscheidung zwischen klassischen und El-Tor-Biotypen verwendet wird. Gemeinsam bieten diese Assays einen effizienten systematischen Ansatz als Alternative oder zusätzlich zu kostspieligen, arbeitsintensiven Experimenten in der CharakteristikVon V. Cholerae klinische (und umwelt-) isolate.
Einleitung
Cholera ist eine Erkrankung des distalen Dünndarms, die durch den Verzehr von kontaminierten Lebensmitteln oder Wasser verursacht wird, die das aquatische Gram-negative Bakterium Vibrio cholerae enthalten. Symptome der Cholera sind Erbrechen und unkontrollierbare wässrige Durchfall, was zu schweren Dehydratation, die, wenn nicht richtig behandelt, wird zum Tod führen. V. Cholerae können in über 200 Serogruppen aufgeteilt werden, basierend auf der Struktur des Zelloberflächen-Lipopolysaccharids O-Antigens. Allerdings haben nur 2 Serogruppen, O1 und O139, epidemisches oder pandemisches Potential 1 ,
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Protokoll
Hinweis: Zeitliche Betrachtungen für jeden Assay müssen gemacht werden, da einzelne Medienvorbereitungen unterschiedliche Zeiten erfordern. Zum Beispiel sollten feste Agarplattenmedien ausreichend kühlen und trocknen lassen (1-2 Tage). Zusätzliche Zeitüberlegungen ( dh Einzelkolonie und Übernachtkulturwachstum) werden unter jedem Protokoll spezifiziert und sind in Tabelle 2 zu finden .
1. Vorbereitung der Medien
- 1x Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS)
- Wiegen 4,0 g NaCl, 0,1 g KCl, 0,72 g Na 2 HPO 4 und 0,12 g KH 2 PO 4 . Die Bestandte....
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Ergebnisse
Für die ordnungsgemäße Instandhaltung und Verwendung von Bakterienstämmen empfiehlt es sich, die Verdopplungszeit der betreffenden Stämme zu kennen. Hierbei sind die unterschiedlichen Wachstumsraten der üblichen V Cholerae-Stämme wurden durch eine Wachstumskurve nachgewiesen, und ungefähre Verdopplungszeiten wurden unter Verwendung einer linearen Regression berechnet. WT El Tor N16961 und El Tor Variante MQ1795 zeigten kürzere Verdopplungszeiten (~ 1 h bzw. ~ 1 h) als WT klassis.......
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Diskussion
Von den über 200 identifizierten V. Cholerae Serogruppen, nur O1 und O139 haben epidemisches Potential. Die O1 Serogruppe kann in zwei Biotypen unterteilt werden: klassisch und El Tor. Allerdings sind Hybrid-Stämme, die als El Tor-Varianten 13 , 17 bezeichnet werden, entstanden, die den El-Tor-Biotyp-Hintergrund besitzen und klassische Merkmale 8 , 9 , 10 .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Forschung unterstützt von New Hampshire-INBRE durch einen Institutional Development Award (IDeA), P20GM103506, vom Nationalen Institut für Allgemeine Medizinische Wissenschaften des NIH.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1 kb DNA-Leiter | New England Biolabs | N3232S | https://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder |
| 60% Glycerin | Calbiochem | 356352 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade---CAS-56-81-5---Calbiochem,EMD_BIO-356352 |
| Agar | Becto, Dickinson und Co. | 214030 http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch | |
| Agar mit Hirn-Herz-Infusion | Becto, Dickinson und Co. | 237500 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Agarose | Peqlab | 732-2789 | https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&_dynSessConf=1766917479792147141&targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&lastLanguage=en&/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&_D%3AcurrentLanguage=+¤tLanguage=en&_D%3AlastLanguage=+&_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+ |
| Wasserfreies K2HPO4 | Fisher Scientific | P288-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-dibasic-anhydrous-crystalline-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/p288500?searchHijack=true&searchTerm=P288500&searchType=RAPID |
| Blut-Agar-Platten | Remel | R01200 | Bei 4 Grad lagern; C; http://www.remel.com/Catalog/Item.aspx?name=Blood+Agar |
| Borsäure | Fisher Scientific | A73-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/boric-acid-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/a73500?searchHijack=true&searchTerm=A73500&searchType=RAPID |
| Bromthymol Blue | Fisher Scientific | B388-10 | https://www.fishersci.com/shop/products/bromothymol-blue-certified-acs-fisher-chemical/b38810?searchHijack=true&searchTerm=B38810&searchType=RAPID |
| Zirtrinsäure & Middot; H2O | Fisher Scientific | S72836-3 | https://www.fishersci.com/shop/products/citric-acid-monohydrate-4/s728363#?keyword=s728363 |
| Desoxynukleotid (dNTP) Solution Kit | New England Biolabs | N0446S | Bei -20 & deg lagern; C; https://www.neb.com/products/n0446-deoxynucleotide-solutionset |
| Dinatrium EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/ethylenediaminetetraacetic-acid-disodium-salt-dihydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-7/s311500?searchHijack=true&searchTerm=S311500&searchType=RAPID |
| DNA Clean & Konzentrator & Handel; -25 Kit | Zymo Research | D4007 | http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zymoclean-gel-dna-recovery-kit |
| GelGreen Nukleinsäure-Färbung | Biotium | 41005 | https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10,000x-in-water/ |
| Genesys 10SUV-VIS Spektralphotometer | Thermo Scientific | 840-208100 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-208100?ICID=search-840-208100 |
| Gentra Puregene Hefe/Bact. Kit | Qiagen | 158567 | https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation |
| HCl | Fisher Scientific | A144-212 | Ätzend; https://www.fishersci.com/shop/products/hydrochloric-acid-certified-acs-plus-fisher-chemical-10/a144212?searchHijack=true&searchTerm=A144212&searchType=RAPID |
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| Le Loop | Decon Labs Inc. | MP190-25 | http://deconlabs.com/products/leloop/ |
| Le Stab | Decon Labs Inc. | MP186-5 | http://deconlabs.com/products/lestab/ |
| MgSO4· 7H2O | Fisher Scientific | M63-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?searchHijack=true&searchTerm=M63500&searchType=RAPID |
| Mini-Sub Cell GT Horizontales Elektrophoresesystem | Bio Rad Labs | 1704406 | http://www.bio-rad.com/en-us/product/mini-sub-cell-gt-cell?WT.srch=1&WT.mc_id=aw-cbb-NA-sub_cell_systems_brand_gold&WT.knsh_id=7eb1981f-a011-42a3-aece-1236ff453373 |
| MR-VP Bouillon | Difco | 216300 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=216300&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3Dmr-vp%2Bmedium%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Na2HPO4 | Fisher | Scientific S374-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-phosphate-dibasic-anhydrous-granular-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s374500?searchHijack=true&searchTerm=S374500&searchType=RAPID |
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| NaNH4HPO4· 4H2O | Fisher Scientific | S218-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-ammonium-phosphate-tetrahydrate-crystalline-certified-fisher-chemical/s218500?searchHijack=true&searchTerm=S218500&searchType=RAPID |
| NanoDrop Lite Spektrophtometer | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR |
| fettfreie Trockenmilch | Nestle Carnation | N/A | N/A |
| Peptone | Becto, Dickinson and Co. | 211677 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211677&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211677%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Petrischalen (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875712#?keyword=FB0875712 |
| Petrischalen (150 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875714 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875714?searchHijack=true&searchTerm=FB0875714&searchType=RAPID |
| Polymyxin B Sulfatsalz | Sigma-Aldrich | P1004-10MU | Bei 2-4 Grad lagern; C; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p1004?lang=en®ion=US |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs | M0273S | Bei -20 ° lagern; C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer |
| Taq Reaktionspuffer | New England Biolabs | M0273S | Bei -20 ° lagern; C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer |
| Thermocycler Bio-Rad C1000 Touch™ | Bio Rad Labs | 1840148 | http://www.bio-rad.com/evportal/evolutionPortal.portal?_nfpb=true&_pageLabel=search_page&sfMode=search&sfStartNumber=1&clearQR=true&js=1&searchString=1840148&database=productskus+productcategories+productdetails+abdProductDetails+msds+literatures+inserts+faqs+downloads+webpages+assays+genes+pathways+plates+promotions&tabName=DIVISIONNAME |
| Triphenyltetrazoliumchlorid | Alfa Aesar | A10870 | https://www.alfa.com/en/catalog/A10870/ |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/tris-base-white-crystals-crystalline-powder-molecular-biology-fisher-bioreagents-7/bp1521?searchHijack=true&searchTerm=BP1521&searchType=RAPID |
| Trypton | Becto, Dickinson und Ko. | 211705 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211705&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211705%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Hefeextrakt | Becto, Dickinson und Co. | 212750 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=212750&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D212750%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| α-napthol | MP Biomedicals | 204189 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189 |
Referenzen
- Shimada, T., et al. Extended serotyping scheme for Vibrio cholerae. Curr. Microbiol. 28 (3), 175-178 (1994).
- Yamai, S., Tadayuki, O., Toshio, S., Yasuji, K. Distribution of serogroups of Vibrio cholerae non-O1 non-O139 with specific reference to their ability to produce cholera....
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Nachdrucke und Genehmigungen
