Erstellung eines Nagetier Modells der abdominalen Aortenaneurysma Vaskulogenese Adventitial Vasa Vasorum Perfusion

Zusammenfassung

Polyurethan-Katheter Einfügung in die Aorta Lumen und Naht Ligatur der Aorta verursachen chronische Hypoxie durch Minderdurchblutung der adventitial Vasa Vasorum. Dieser Artikel beschreibt eine neuartige Tiermodell der abdominalen Aortenaneurysma (AAA) mit Eigenschaften ähnlich denen von AAA beim Menschen.

Zusammenfassung

Die adventitial Vasa Vasorum (VV) liefert Sauerstoff und Nahrung für die Aorta Wand. Hypoxie in der aortalen Wand führt zu erweiterten abdominale Aortenaneurysmen (AAAs). Dieser Artikel stellt und beschreibt ein standard-Protokoll verwendet, um AAAs durch adventitial VV Hypoperfusion erstellt mit einer Kombination aus Polyurethan-Katheter Einfügung in die Aorta Lumen und Naht Ligatur der Bauchschlagader Infrarenal induzieren.

Das Protokoll beinhaltet die Verwendung von männlichen Ratten mit einem Gewicht von 300-400 g, das sind Nahrung und Wasser Ad Libitumzur Verfügung gestellt. Nach Laparotomie mit einem ventralen Mittellinie Bauchschnitt ist Peeling der Aorta durchgeführt, welche blockiert Blutfluss aus dem perivaskuläre Gewebe. Aortotomy mit einen kleinen Schnitt neben der Nierenarterie Zweige erfolgt, und ein Polyurethan-Katheter ist mit einer innewohnenden 18-Gauge-Nadel. Nach der Reparatur der Schnitt, die enge Verbindung der Aorta über den Katheter Blöcke VV Blutfluss aus der proximalen Richtung durch die Aortenklappe Wand ohne zu stören die Aorta Durchblutung. Diese Technik kann ein AAA mit progressive Dilatation der Aorta induzieren.

Der größte Vorteil dieses Modells ist, dass VV Hypoperfusion verursacht Gewebehypoxie und die Entwicklung eines Infrarenal AAA, die morphologische und pathologische Eigenschaften ähnlich denen von einem menschlichen AAA hat.

Einleitung

Der Bauchschlagader besteht aus den folgenden drei Schichten: der inneren Gefäßwand (Intima), mediale Schicht (Medien) und äußere Gefäßwand (Adventitia), und von diesen die Adventitia hat eine einzigartige Blut System, bekannt als der Vasa Vasorum (VV) zu liefern. Aorta Gewebe wird mit Sauerstoff durch adventitial VV Perfusion und einfache Sauerstoffdiffusion aus der Aorta Blut fließen¹geliefert. Geographisch, hat Bauchschlagader jedoch die wenigsten Verteilung der VVs im Vergleich dazu in anderen Teilen der Aorta. ²

Eine frühere Studie berichtete über Gewebehypoxie in menschlichen abdominalen Aortenaneurysma (AAA) Wände mit dicken Intraluminal Thrombus (ILT)³. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass eine adventitial VV in aneurysmal Wände mit arteriosklerotischer Veränderungen zu einem deutlich höheren Preis verdeckt ist der Gewebehypoxie in der AAA-Wände-⁴zugeordnet ist. Aufbauend auf diesen Erkenntnissen entstand eine neuartige Nagetier Modell des AAA durch Induktion adventitial VV Hypoperfusion⁵. In diesem Modell verursacht VV Hypoperfusion Gewebehypoxie und die Entwicklung eines Infrarenal AAA, die morphologische und pathologische Eigenschaften ähnlich denen eines menschlichen AAA⁶hatte. Paradebeispiele sind das Vorhandensein von ILTs und die Ansammlung von hyperplastische Adipozyten⁶und Bruch^7,8verursachen. Diese Erkenntnisse sind in früheren Nager-Modelle nur selten beobachtet worden. Daher kann dieses Modell zu einem tieferen Verständnis des Mechanismus verantwortlich für AAA-Entwicklung und Bruch erheblich beitragen. Wir stellen und beschreiben ein standard-Protokoll verwendet, um durch adventitial VV Hypoperfusion AAAs induzieren, und wir erklären, wie Hypoxie in der aortalen Wand mit chirurgischen Techniken zu induzieren.

Protokoll

Tierpflege und Experimente wurden gemäß den Richtlinien des Hamamatsu Universität Schule von Medizin Tier Pflege Committee im Zentrum für Animal Care durchgeführt.

1. chirurgische Verfahren für die Erstellung des Modells

Hinweis: Legen Sie die chirurgischen Instrumente in einem Wulst-Sterilisator für 10 s präoperativ. Sterile Handschuhe intraoperativ.

1. Verwendung männliche Ratten mit einem Gewicht von 300-400 g. ermöglichen die Ratten Zugang zu Nahrung und Wasser Ad Libitum.
2. Betäuben die Ratte mit Isofluran Inhalation (2,0-3,0 mL/L). Richtige Anesthetization durch Zehe Prise bestätigen.
3. Haare auf dem Bauch mit einen elektrischen Rasierapparat Rasieren und schrubben den Bauch mit Alkohol und einem Povidon-Jod-Lösung.
4. Legen Sie die Ratte in die Rückenlage auf dem OP-Tisch. Verwenden Sie Tierarzt Salbe auf die Ratte ' s Augen Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
5. Führen eine Laparotomie mit einem ventralen Mittellinie Bauchschnitt mit einer Schere. Um eine klare OP-Feld zu sichern, packen den Abdominal-Inhalt in die Bauchhöhle mit steriler Gaze mit einer Wunde Retraktor.
6. Die Aorta aus dem perivaskuläre Gewebe lösen sanft abholen und reißen das Retroperitoneum mit einer Pinzette zu entlarven die aortalen Wand und ein Peeling Infrarenal Aorta im Retroperitonealraum von der Ebene der linken Nieren Ader an der Bifurkation von der perivaskuläre Gewebe ( Abbildung 1A).
7. Ligate Verzweigung aus der Bauchschlagader mit einem 5: 0 Seidenschnur in Block Blut Schiffe liefern an einem Punkt weg von der Aorta, die nicht der Aorta Lumen einengen wird.
8. , Aorten-Blutfluss blockieren platzieren vaskuläre Clips direkt unterhalb der Nierenarterien und knapp oberhalb der Bifurkation der Aorta.
   Hinweis: Die Größe der Clips sollte größer als der Aorta Durchmesser, den Blutfluss völlig zu blockieren. Eine vorübergehende 5-0 Seidenschnur Ligatur ist auch ausreichend für die Sperrung Durchblutung statt der Clips.
9. Ähnlich wie bei Erstellen einer Blutung Punkt auf der Oberfläche der aortalen Wand, schneiden die vordere aortalen Wand mit einer Mikro-Schere 5 mm distal aus der Aorta Clip, angrenzend an den Nierenarterien Zweigen, zum einen Polyurethan-Katheter einfügen.
10. Legen Sie einen Polyurethan-Katheter (außen-ø 0,55 mm Innendurchmesser 0,37 mm) mit einer 24-Gauge Innewohnung Nadel flach durch die Inzision Blut in die Aorta mit Wasser abzuwaschen. Verwalten einer 1-mL-Spritze in der Polyurethan-Katheter mit Wasser gefüllt und das restliche Blut in die Aorta mit Wasser wegspülen. Nach Bewässerung, den Katheter entfernen aus der Aorta.
11. Vor ein Polyurethan-Katheter (Außendurchmesser 1,20 mm Innendurchmesser 0,94 mm) schneiden Sie mit einer innewohnenden 18-Gauge-Nadel, die Polyurethan-Katheter bis 10 mm lang ( Abbildung 1 b).
    1. Legen Sie den Schnitt Stück der Polyurethan-Katheter in die Aorta Lumen von der Schnitt im Schritt 1,9. Komplett 10 mm Katheter in das Lumen der Aorta zu platzieren, und positionieren Sie den Mittelpunkt des Katheters an die Position des Schnittes (d. h., den Schnitt mit dem Katheter zu decken).
12. Reparieren die Inzision mit unterbrochenen Nähten mit einem 8-0 monofile Schnur ( Abbildung 1).
13. Verbinden die Bauchschlagader mit einer Kombination aus 5-0 Seidenschnur und Polyurethan-Katheter ( Abbildung 1).
    Hinweis: Die Aorta Lumen sind von der indwelling Katheter pflegbar. Verbinden Sie die Aorta fest, um zu verhindern, dass die Position des Katheters Szenario. Der Chirurg ' s Knoten wird empfohlen, da es einen extra-Kick, fügt wenn der erste Wurf des Knotens, bilden einen doppelten Überhandknoten binden und ein zusätzlicher Runde bietet mehr Reibung und Lockerung verringern kann.
14. Nach Ligation, entfernen Sie den vaskulären Clip an der Aorta Bifurkation, und entfernen Sie dann den vaskulären Clip unterhalb der Nierenarterien, den Antegrade Blutfluss wiederherzustellen. Bestätigen Brutto Aorten Pulsation.
15. In der Nähe der Bauchschnitt in zwei Schichten, das Bauchfell und andere Schichten mit einer 4: 0-Polypropylen-Naht. Fest Naht den Schnitt um eine verwinkelte Organ zu verhindern.
16. Gelten aktuell Lidocain auf den Bauchschnitt. Legen Sie die Ratte auf ein Heizkissen bis Bewusstsein zurückkehrt. Nicht unbeaufsichtigt lassen eine Ratte bis es ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wiedererlangt hat. Nicht zurück, eine Ratte, die Operation, um die Gesellschaft von anderen Ratten durchlaufen hat, bis es vollständig erholt hat.
17. Überwachen die Ratte nach der Operation. Einen Bolus von sterilen Kochsalzlösung (1,0-2,0 mL) subkutan zu injizieren, wenn eine Ratte Anzeichen von Stress oder Körper Gewichtsverlust zeigt.
18. Beobachten postoperativ, die Zeitverlauf Entwicklung der erweiterten Aorta auf eine Ultraschall-echokardiographische. Maßnahme der maximale Durchmesser von innen Kante an der Außenkante der Bauchschlagader wie beschrieben ⁵.

2. Ernte, Befestigung und Elastica-van Gieson (EVG) färben

1. achtundzwanzig Tage postoperativ, Natrium-Pentobarbital verwalten ≥ 100 mg/kg intraperitoneal, die Ratten einzuschläfern.
2. Aufschneiden die Ratte ' s Bauch Hohlräume ventral. Machen Sie den ersten Schnitt mit einem Skalpell. Das Aneurysma mit einer Schere zu ernten und legen Sie die geernteten Hauptschlagadern in 10 % neutral gepufferte Formalin für 24-48 h
   Hinweis: Der Chirurg muss vorsichtig, Verletzung der Aorta und andere Organe zu verhindern, wenn das Aneurysma auszusetzen sein. Ein erhöhter Abdominal-Organ sollte beobachtet werden, AAA Bildung angibt. Abbildung 2 zeigt eine in Vivo und ex Vivo Bild; Dieses repräsentative Stichprobe von AAAs ist nicht gebrochen.
3. EVG Färbung ⁹
   1. Vorbereitung der Lösung
      1. Prepare Verhoeff ' s Hämatoxylin durch Mischen der folgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge: alkoholische Hämatoxylin 20 mL, 10 % Eisenchlorid 8,0 mL und Lugol ' s Jod 8 mL. Mischen Sie die Lösung zwischen jeder Zugabe. Diese Lösung nach Bedarf frisch zubereitet werden.
      2. Vorbereiten Van Gieson ' s Lösung durch Mischen von 1 % saures Fuchsin 1 mL und gesättigten Pikrinsäure 45 mL. Lassen Sie über Nacht stehen und gut mischen. Diese Lösung ist für 2 Wochen stabil.
      3. Bereiten differenzierenden Lösung (2 % Eisenchlorid) durch das Mischen von 10 % FeCl ₃ 10 mL in 40 mL destilliertem Wasser. Diese Lösung kann frisch nach Bedarf zubereitet werden.
      4. Vorbereitung 5 % Hypo durch 5,0 g Natriumthiosulfat in 100 mL destilliertem Wasser auflösen. Diese Lösung ist für 1 Jahr stabil.
   2. Retikuläres Verfahren
      Hinweis: siehe Referenz ⁹ für Details.
      1. Kurz, Hydrat die feste Paraffin Abschnitte des geernteten Hauptschlagadern in destilliertem Wasser für 10 Minuten statt der Hauptschlagadern in Verhoeff ' s Hämatoxylin für 25 min. Waschen mit Wasser und Tauchen 10 - 30 Mal in Lösung (2 % FeCl ₃) zu unterscheiden. Wasser abspülen. Legen Sie in 5 % Hypo für 1 min. unter Wasser reinigen. Ort in Van Gieson ' s Lösung für 5 min.
      2. Gelief in Alkohol in der folgenden Reihenfolge: 75 %, 90 %, 95 %, 100 % und 100 % Alkohol für 30 s. Dann deaktivieren Sie in Xylol für 5 min, zweimal. Auf einem Deckgläschen mit harzigen Eindeckmedium.
         Hinweis: die elastischen Fasern erscheinen blauschwarz bis schwarz; Kerne: blau in BlaCk; Kollagen: rot; und andere Gewebe Elemente: gelbe.

Ergebnisse

Die beschriebenen Operationstechniken erstellen eine neuartige Tiermodell eine chronische Hypoxie-induzierten Aortenaneurysma mithilfe einer Kombination aus Polyurethan-Katheter Einfügung und Naht Ligatur der Bauchschlagader Infrarenal bei Ratten. Die Ratten im Abschnitt Protokoll beschrieben wurden euthanasierten 28 Tage nach dem Eingriff. Die Hauptschlagadern wurden geerntet und abgebildet um Aneurysma Bildung sichtbar zu machen. Abbildung 2 zeigt die Entwicklung der spindelförmig AAA. Die oberen und unteren Enden der Aorta in ex Vivo haben einen normalen Durchmesser ohne Dilatation. Aorta Durchmesser wurden mit transabdominalen Sonographie (Abbildung 3) bewertet. Der Durchmesser erreicht seine maximale Größe im Allgemeinen bei etwa 14 Tage nach dem Eingriff; Danach, es bleibt unverändert oder leicht erhöht. Abbildung 4 zeigt das histopathologische Bild des Aneurysmas an ihrem maximalen Durchmesser nach EVG Färbung. Das Bild des Gewebes am 28. Tag (Aneurysma) zeigten prominenten Schädigung der elastischen Fasern im Vergleich dazu am Tag 0.

Abbildung 1: Chirurgische Eingriffe induzieren eine abdominalen Aortenaneurysma (AAA).
(A) die Infrarenal Aorta ist aus dem umgebenden Gewebe abgeblättert. (B) ein Polyurethan-10 mm langen Schnitt wird durch einen kleinen Schnitt in der Aorta Katheter. (C) der Schnitt wird mit einem 8: 0 Monofile Naht repariert und Durchblutung wird wiederhergestellt. (D) die Aorta ist mit einer 5-0 Seide Naht über den Katheter ligiert. Maßstabsleiste = 5 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Postoperative repräsentative Ergebnisse.
Makroskopische Ansicht auf postoperativen Tag 28 zeigt Entwicklung der spindelförmig abdominalen Aortenaneurysmen. Der erhöhte Rand das Retroperitoneum entspricht bis zum äußeren Rand des Aneurysmas (gestrichelt; links). Die oberen und unteren Enden der Aorta in ex Vivo sind normal (rechts). Maßstabsleiste = 3 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: Maximale Aorten Durchmessern mit transabdominalen Ultraschall gemessen.
Der Aorta Durchmesser vergrößert stetig in diesem Rattenmodell. Aorta Durchmesser werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt (n = 12). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4: Repräsentative Bilder von aneurysmal Gewebe mit Elastica van Gieson Färbung.
Histologische Auswertung mit EVG Färbung zeigt der degenerativen elastischen Lamina in den Medien und Bildung von einer Intraluminal Thrombus 28 Tage nach dem Eingriff (rechts). Fragmentierung der elastischen Fasern in der Aorta Medien und spärlich kollagene Faser in die Aorta Adventitia werden am 28. Tag eingehalten. Tag 0 ist vor dem Eingriff (links). Maßstabsleiste = 500 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Diskussion

Unter physiologischen Bedingungen werden die inneren Schichten der aortalen Wand durch Diffusion aus der luminalen Durchblutung ernährt, während die äußeren und mittleren Schichten durch die VV genährt werden, die von der Adventitia in der medialen VV¹eindringen. VV Blutfluss in die Aorta Bauchdecke kann stammen aus den folgenden drei Richtungen/Bereichen: (1) die proximalen Richtung durch die Wand der Aorta, (2) distale Richtung durch die Aortenklappe Wand und (3) perivaskuläre Gewebe¹⁰. Zuvor identifiziert unser histologische Analyse der menschlichen Geweben signifikanten Stenose oder Verschluss von der VV in der AAA-Wand, darauf hindeutet, dass VV Blutfluss in die Aorta Bauchdecke reduzierten⁴sein kann. Es ist ein sehr wichtiger Punkt in diesem Protokoll, das eine Infrarenal AAA durch eine Kombination aus Polyurethan-Katheter Einfügung und Naht Ligatur der Bauchschlagader Infrarenal verursacht wurde. Um die Gewebeschicht sorgfältig ein Peeling, müssen Chirurgen reibungslos einfügen einen Polyurethan-Katheter in die Aorta und fest verbinden die Aorta um chronische Hypoxie durch Minderdurchblutung der adventitial VV und Aneurysma-Bildung führen. Mit diesen Techniken Blutfluss in der aortalen Wand wird somit verringert und eine lokale Hypoxie Umgebung induziert wird. Das Blut fließen Reduktion und Hypoxie-induzierten Aneurysma Bildung zeigt, dass VV Blutfluss in die Aorta Bauchdecke eine Rolle in der Pathogenese der AAA-Bildung spielt.

Insbesondere eine Aortenaneurysma Modell muss folgende Voraussetzungen erfüllen: ein 1,5-facher Anstieg der vaskulären Durchmesser im Vergleich zum Ausgangswert, Degeneration der Tunica Media und Entzündung der Aorta Wand. Die beliebtesten Tiermodelle sind konstruiert worden, durch Induktion Entzündungsreaktionen mit Substanzen wie CaCl₂¹¹, Elastase¹²und Angiotensin II¹³. Diese Modelle haben eine hohe Reproduzierbarkeit und offensichtlich pathologischen Veränderung bewirken können, und sie sind häufig in Studien benutzt worden. In unserem Modell untersuchten wir die aortalen Durchmesser mit Ultraschall alle 7 Tage ab, bevor das Verfahren bis zum 28. Tag nach dem Eingriff (Abbildung 3) durchgeführt wurde. Ergebnisse zeigten, dass die Aorta Durchmesser mäßig in den 28 Tagen darauf hinweist erhöht, dass diese Änderung im Durchmesser ähnlich wie in früheren Nager-Modelle ist. Grobe Beobachtung der vaskulären Form angegeben eine glatte fusiformis Form (Abbildung 2). Am 28. Tag wir die Ratten geopfert und histopathologische Analyse der Aorta Gewebe, das geborgen wurde. Reißen und das Verschwinden der elastischen und Kollagen Fasern der Tunica Media und Adventitia beobachtet (Abbildung 4). Darüber hinaus präsentierten sich Entzündungszellen, wie z. B. Makrophagen, aus der Tunica Adventitia, Tunica Media.

Derzeit sind die Behandlungsmöglichkeiten für AAAs auf chirurgische Reparatur und endovaskulären Stent Pfropfen mit Sterblichkeit von 30-50 % bei Patienten mit AAA Bruch¹⁴beschränkt. Jedoch ist kein Medikament für die klinische Anwendung zur Behandlung von AAAs genehmigt worden. Es gibt Debatte gibt es Abweichungen in die pathologische Befunde zwischen Mensch und etablierten Tiermodelle in der AAA-Forschung eingesetzt. Ähnlichkeiten in der Pathogenese zwischen menschlichen AAA und Tiermodellen AAA sind essentiell für die Entwicklung der pharmakologischen Behandlungen. Über die Wirksamkeit der Nager-Modelle ist unsere Rattenmodell morphologisch ähnlich wie beim Menschen in Bezug auf Intraluminal Thrombus⁵ und angereizte⁸. Darüber hinaus etwa 20 % der Ratten in dieser Studie hatten AAA Bruch und starb innerhalb von 28 Tagen nach dem Eingriff. Obwohl Aortenaneurysma-Ruptur die wichtigste Veranstaltung für diese Krankheit ist, Bruch ist selten mit etablierten experimentellen AAA-Modellen, und der Mechanismus noch nicht geklärt. Daher eignet sich dieses Modell für das Verständnis des Mechanismus der Dilatation der Aorta Durchmesser und Ruptur des Aneurysmas.

Dieses Modell ist für einige chirurgische Eingriffe erforderlich. Daher müssen Forscher üben dieses Modell, das eine Beschränkung dieses Modells zu schaffen. In Zukunft möchten wir ein Nagetier Modell zu erstellen, in denen wir Blutfluss verringern kann durch schrittweise Verdickung der VV-Wände, was zu spontanen Aortenaneurysma.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ratte	Japan SLC. Inc	Slc:SD	Ratte Sprague– Dawley ratTM
Povidon-Jod-Lösung	Libatape Pharmaceutical Co., Ltd.
5-0 Seidenschnur	Akiyama Medical MFG. CO., LTD	JIS Nr. 1
Gefäßclips	Natsume Seisakusho Co., Ltd.	C-42-S-2
Polyurethan-Katheter (24-Gauge-Verweilnadel)	MEDIKIT	24G	Supercath Z4VTM, 24-Gauge-Verweilnadel
Polyurethan-Katheter (18-Gauge-Verweilnadel)	MEDIKIT	18G	Supercath Z3VTM, 18-Gauge-Verweilnadel
8-0 monofile	String-Ethicon-Naht	c-42-S-2	PROLENE Polypropylen-Nahtmaterial, Reparatur des Schnitts mit der Naht