Summary
Vasculaire endotheel bepaalt strak leukocyte werving. Onvoldoende leukocyte extravasation draagt bij tot de inflammatoire ziekten bij de mens. Daarom is zoeken naar nieuwe regelgevende elementen van endothelial activering om te ontwerpen van verbeterde therapieën voor inflammatoire aandoeningen. Hier beschrijven we een uitgebreide methodologie om te karakteriseren roman endothelial regelgevers die leukocyte handel tijdens ontsteking kunnen wijzigen.
Abstract
De endothelial laag is essentieel voor het behoud van de homeostase in het lichaam door het beheersen van veel verschillende functies. Regulering van de ontstekingsreactie door de endothelial laag is cruciaal voor het efficiënt bestrijden van schadelijke ingangen en hulp bij het herstel van beschadigde gebieden. Wanneer de endotheliale cellen worden blootgesteld aan een inflammatoire omgeving, zoals de buitenste component van gram-negatieve bacteriën membraan, lipopolysaccharide (LPS), ze uiten van oplosbare pro-inflammatoire cytokines, zoals Ccl5, Cxcl1 en Cxcl10, en leiden tot de activering van de circulerende leukocyten. Bovendien is de uitdrukking van celadhesie-moleculen E-selectine, VCAM-1 en ICAM-1 op het endotheel oppervlak kan de interactie en de hechting van de geactiveerde leukocyten aan het endotheel laag en uiteindelijk de extravasation naar het ontstoken weefsel. In dit scenario moet de endothelial functie strak geregeld omdat buitensporige of defecte activering in de aanwerving van leukocyten tot inflammatoire-gerelateerde aandoeningen leiden kan. Aangezien veel van deze aandoeningen niet over een effectieve behandeling beschikt, moeten nieuwe strategieën met een focus op de vasculaire laag worden onderzocht. Wij stellen voor uitgebreide tests die nuttig zijn voor het zoeken van nieuwe endothelial regelgevers die leukocyte functie wijzigen. We endotheel activering analyseren met behulp van de doelen van de specifieke expressie die betrokken zijn bij de aanwervingsprocedures van de leukocyten (bijvoorbeeld cytokines, chemokines en celadhesie-moleculen) met verschillende technieken, waaronder: real-time kwantitatieve polymerase kettingreactie () RT-qPCR), de western-blot, stroom cytometry en hechting testen. Deze benaderingen endothelial functie in de inflammatoire context bepalen en zijn zeer nuttig voor het uitvoeren van screening tests karakteriseren roman endothelial inflammatoire regelgevers die potentieel waardevolle voor het ontwerpen van nieuwe therapeutische strategieën.
Introduction
Ontsteking is een gunstig biologische reactie tegen infectieuze agentia, met het grote doel te elimineren van het pathogene agens en het herstellen van beschadigd weefsel. Onder bepaalde voorwaarden, zoals chronische infecties of auto-immune ziekten, ontsteking niet is opgelost. In plaats daarvan is er een afwijkende reactie met continue infiltratie van leukocyten, resulterend in een langdurige immuunrespons die leidt tot weefselbeschadiging, fibrose, verlies van functie, en de algehele, handicap en in sommige gevallen dood van de patiënt. Deze menselijke aandoeningen, gecatalogiseerd als ontstekingsziekten, alle betrekking hebben op de bloedvaten voor de controle van leukocyten extravasation1,2.
De endotheliale cellen spelen een fundamentele rol in de regulatie van de ontstekingsreactie door het beheersen van de leukocyten mensenhandel. Wanneer het endotheel laag is blootgesteld aan inflammatoire mediatoren zoals LPS, de rust endotheel activeert en spreekt van pro-inflammatoire cytokines (Cxcl10, Cxcl5, Cxcl1, enz.) en celadhesie-moleculen (E-selectine, VCAM-1 en ICAM-1) die gunst werving van circulerende leukocyten op de site van de infectie. De leukocyten primer door de vrijgegeven cytokines dan bemiddelen rollen en interactie met de endothelial laag door de correspondent zelfklevende tegenhangers: PSGL-1 selectine, α4β1 integrine aan VCAM-1 en αLβ2 integrine aan ICAM-1. Tot slot migreren de leukocyten over de therapieën richting de focus ontsteking3.
De essentiële rol van het endotheel bij het reguleren van de inflammatoire respons is aangetoond op muizen die werden genetisch gewijzigd om uit te drukken de LPS receptor, toll-like receptor 4 (TLR4), alleen op de endotheliale cellen. Deze endotheel-TLR4 dieren konden reageren op een ontsteking LPS-gemedieerde en detecteren de infectie gegenereerd na inoculatie van de bacteriën, en bijgevolg bereiken infectie resolutie en overleven op een vergelijkbaar niveau als de muizen wild type4 , 5.
Voor het endotheel-gereglementeerde ontstekingsreactie traject, heeft het is gepostuleerd dat de remming in bepaalde stadia van de leukocyten-endotheel interactie zou resulteren in de vermindering van de trans-endothelial migratie en een betere prognose voor inflammatoire-gerelateerde ziekten. In feite, zijn verschillende strategieën gericht op de endotheliale activering en leukocyten-endotheel interactie te hinderen extravasation van immune cellen als een behandeling voor inflammatoire aandoeningen6,7ontworpen.
In dit verslag beschrijven we een grondige groep van in vitro technieken om de endothelial activiteit in reactie op de inflammatoire stimulans LPS en haar rol bij activering van de leukocyten en hechting aan de vasculaire laag volledig te karakteriseren. De endothelial cell model gebruikt in dit manuscript was de muis Long endothelial cellijn (MLEC-04), zoals beschreven door Hortelano et al. 8. de MLEC-04 cellijn is gevalideerd in de literatuur als een passend systeem om te studeren endothelial activering9,10. Op basis van het onderzoeksinteresses, deze benaderingen kunnen worden gemakkelijk geëxtrapoleerd naar ieder endothelial of leukocyten systemen en inflammatoire profiel. Zodra de endothelial parameters in de geselecteerde voorwaarden zijn gedefinieerd, kan het systeem nieuwe medicijnen op de voorgestelde experimenten te evalueren van de vasculaire activering testen. In deze inflammatoire context, de cellen van de endotheel getest met de stof van belang kunnen worden vergeleken met de controlevoorwaarden van de cellen en eventuele resulterende verschillen kunnen in kennis stellen van de drug prognostische resultaat op de ontwikkeling en de vooruitgang van ontsteking. Tot slot stellen wij voor een relevante systeem karakteriseren nieuwe drug targets op de endotheliale cellen, die invloed op het ontwerp van nieuwe vasculaire-specifieke therapieën tegen inflammatoire-gerelateerde ziekten uitoefenen kunnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. endothelial celcultuur
- Weefselkweek behandeld platen
- jas 100 mm weefselkweek platen met gelatine van 2.5 mL oplossing (gesteriliseerde met autoclaaf, 0,1% gelatine in gedestilleerd water) gedurende 30 minuten bij 37 ° C; dit kunnen worden geëxtrapoleerd naar de vereist goed formaat. De gelatine oplossing gecombineerd en laat platen te drogen in de weefselkweek kap.
- Weefsel kweekomstandigheden
- de MLEC-04-cellen binnen een biologische incubator (37 ° C, luchtvochtigheid van 95%, 5% CO 2) cultiveren. De cellen in volledige media van Dulbecco groeien ' s gewijzigd Eagle Medium: nutriënt mengsel F-12 (DMEM/F-12) aangevuld met 10% foetale boviene Serum (FBS) en 100 eenheden/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine (P/S).
- De cellen tellen de standaardmethode voor het Neubauer-kamer en de MLEC-04-cellen toevoegen aan de 100 mm gelatine-behandelde platen in 10 mL volledige media, bij een lage dichtheid van 2-11 x 10 4 cellen/cm 2. Splits de cellen 1:3, wanneer ze samenvloeiing bereiken.
Opmerking: Dit gebeurt meestal na twee tot drie dagen in cultuur. - Subcultuur de cellen door het wassen van de platen met 10 mL steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gevolgd door toevoeging van 2 mL trypsine-EDTA-oplossing (0,25% trypsine, 5 mM EDTA) en incubeer gedurende 3 minuten bij 37 ° C.
- Stop de reactie trypsine-EDTA en de zwevende cellen te herstellen door het toevoegen van 10 mL volledige media. Spin down de cellen (300 x g, 5 min), verwijder het supernatant, resuspendeer de cellulaire pellet in volledige media en subcultuur adequaat.
2. LPS behandeling en bemiddelaars
- plaat van de MLEC-04-cellen in volledige media aan sub samenvloeiing naar het volgende goed formaat: 7 x 10, 5 cellen/putje op 6-Wells-platen en 2.5 x 10 5 cellen/putje op 96-wells-platen.
- Broeden de cultuur gedurende 6 uur in een cel incubator (37 ° C, luchtvochtigheid van 95%, 5% CO 2). De cellen naar onvolledige media (DMEM-F12, P/S) en overnachting (ON) te synchroniseren en te verlagen van de activiteit van de cel verlaten.
- Verwijder het medium en testen van nieuwe farmacologische stoffen door het broeden van de endotheliale cellen met (of zonder) de drug in kwestie (bijvoorbeeld DT 10) verdund in de onvolledige media (30 min, 37 ° C); Voeg 1,4 mL/goed voor 6-well plaat of 0.14 mL/putje voor 96-wells-platen).
- Daag de cellen door toevoeging van LPS aan de incubatie-media (100 ng/mL, eindconcentratie) voor de periode van de tijd die is opgegeven bij elke test. PBS gebruiken als besturingselement.
3. Evaluatie van transcriptionele profiel op endotheel geactiveerd door RT-qPCR
- zaad de MLEC-04 cellen aan sub samenvloeiing in 6-well cultuur platen (7 x 10 5 cellen per putje). Incubeer gedurende 6 h (37 ° C, luchtvochtigheid van 95%, 5% CO 2) en daarna gaat u verder met serum honger (Incubeer ON).
- Verwijder het medium en de endothelial cel culturen met het geneesmiddel van belang verdund in de onvolledige media (incubeer 30 min, 37 ° C); Voeg 1,4 mL/goed voor 6-well plaat (30 min, 37 ° C) behandelen (of niet behandelen).
- Uitdaging van de cellen door toevoeging van 100 ng/mL LPS aan de bebroede media (zoals beschreven in stap 2.3) en incubeer voor 6 h. Zet de reactie Stop door wassen tweemaal met koude PBS en houden van platen bij-80 ° C tot monster verwerking.
- RNA extractie
- ontdooien van de platen en voeg 1 mL/putje RNA extractie buffer (38% fenol en 0,8 M guanidinium isothiocyanaat; zie tabel van materialen). Laat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) onder agitatie en verzamelen homogenaat in buizen van 1,5 mL.
- Toevoegen van 200 µL chloroform en zachtjes doorroeren voor 15 s. Incubate gedurende 3 minuten op RT en centrifuge (11,600 x g, 15 min, 4 ° C).
- Waterfase overbrengen in een andere 1,5 mL-buis. Neerslag van RNA door toevoeging van 500 µL isopropanol en gevolgd door een 10 minuten incubatie bij RT en dan centrifugeren (11.600 x g, 4 ° C).
- Verwijder het supernatant en wassen van de pellet met 75% ethanol door vortex agitatie en vervolgens centrifugeren (7500 x g, 4 ° C).
- Luchtdroog de pellet en solubilize van RNA in 25 µL pure H 2 O door incubatie gedurende 10 minuten bij 55 ° C. Houd RNA bij-80 ° C tot monster verwerking.
- Hoeveelheid en zuiverheid van RNA
- de concentratie van RNA te kwantificeren door het meten van de extinctie van het monster bij 260 nm in een spectrofotometer (Zie Tabel of Materials).
- Maatregel op 230 nm en 280 nm tot het bepalen van de zuiverheid van het RNA.
Opmerking: De verhouding tussen enerzijds tegen 260/280 geeft eiwit of fenol besmetting. Een verhouding dicht bij 2 is aanvaardbaar. De verhouding op 260/230 geeft EDTA, koolhydraten of fenol contaminanten. Waarden tussen 2.0-2.2 zijn aanvaardbaar.
- Controleren RNA integriteit
- Run 2 µg totaal RNA en een RNA ladder op een 1,5% agarose gel denaturering; visualiseren op een documentatiesysteem gel (Zie Tabel of Materials).
Opmerking: Een verhouding van 2:1 van helder en scherp 28 en 18S rRNA bands geeft een intact RNA. Gedeeltelijk afgebroken RNA Lost als een vlekkerig verschijning.
- Run 2 µg totaal RNA en een RNA ladder op een 1,5% agarose gel denaturering; visualiseren op een documentatiesysteem gel (Zie Tabel of Materials).
- RT-qPCR
- de cDNA (cDNA) te synthetiseren vanuit een enkele gestrande RNA na de standaard protocol (Zie Tabel van materialen) 11.
- Evalueren genexpressie door RT-qPCR
- het reactiemengsel voor elk monster bereiden: Meng 2 µL cDNA, 7 µL fluorescerende samengestelde 300 nM voorwaartse primer en 300 nM omgekeerde primer (tabel 1) in een eindvolume van 13 µL, en toevoegen aan de 96-Wells reactie plaat (Zie Tabel of Materials).
- Zegel van de plaat met een optische zelfklevende deksel, centrifuge (300 x g, 1 min) en het uitvoeren van de reactie op een Real-Time PCR systeem (warme start 95 ° C gedurende 20 s gevolgd door 40 cycli: 95 ° C voor 3 s en 60 ° C gedurende 30 s) (Zie Tabel of Materials).
- Analyseren de resultaten door relatieve kwantificatie met behulp van de vergelijkende methode 2 -ΔΔCt met de huishouding genen glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) of zuur ribosomal phosphoprotein P0 (36B4) 12 .
4. Beoordelen Endothelial activering door Stroom Cytometry
- de MLEC-04-cellen na de in punt 2 beschreven voorwaarden behandelen en evalueren van de wijzigingen in de endotheliale oppervlakte eiwitten door stroom cytometry.
- Ontkoppelen de cellen na 6 h van LPS stimulatie met de trypsine-EDTA-methode, beschreven in stap 1.2.3, en wassen met de onvolledige media bij 4 ° C.
- Met behulp van de methode van de kamer Neubauer cellen tellen en 10 x 10 4 cellen plaats in u-onder 96-wells-platen. Centrifuge (300 x g, 5 min) en teruggooi bezinken door een 180° breuk van de pols van boven naar de beneden en snel herstel naar de oorspronkelijke positie.
- 50 µL van het geselecteerde antilichaam verdund in de onvolledige media (10 µg/mL, eindconcentratie) aan de cellen toevoegen en (30 min, 4 ° C) incuberen.
- Wassen de cellen tweemaal wITH de onvolledige media na de procedure die wordt beschreven stap 4.3, en broeden met 50 µL bij 10 µg/mL van de overeenkomstige secundair antilichaam gekoppeld aan FITC of een soortgelijk geconjugeerde (30 min, 4 ° C in een donkere ruimte).
- Was eens de cellen met de onvolledige media gevolgd door een PBS-wassen. Herstellen van de cellen met 300 µL PBS met behulp van 1 mL pipet tips en plaatsen in cytometry buizen.
- Evalueren de monsters in de stroom cytometry systeem (Zie Tabel van materialen). De bevolking van de cel door de naar voren en kant verstrooiing parameters aanpassen. Poort de bevolking van belang. Poorten op basis van de negatieve controle uit cellen geïncubeerd met isotype besturingselement aanpassen. Analyseren van de resultaten als het percentage positieve cellen of betekenen fluorescentie intensiteit 8.
5. Evalueren van Endothelial activering door de Western Blot
- zaad van het endotheel bij sub samenvloeiing in 6-well cultuur platen (7 x 10 5 cellen/well) en behandelen met LPS zoals beschreven in sectie 2. Analyseren van de inflammatoire eiwituitdrukking bij het volgende westelijke vlek protocol.
- Stoppen met de stimulatie van de LP's op verschillende tijdstippen ophelderen van verschillende aspecten van het endotheel antwoord:
- het profiel van de inflammatoire eiwitten gaan na 6 h van LPS stimulatie.
- Bepalen de cel signalering van elke 15 min een periode van 60 min door.
- In beide gevallen zet de reactie stop door het wassen tweemaal met koude PBS en bewaren van de monsters bij-80 ° C tot monster verwerking.
- Lyse cellen en eiwit extractie
- toevoegen 200 µL lysis buffer aan elk putje (1% niet-ionogene oppervlakteactieve stof, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, natriumchloride 150 mM, 30 mM natrium pyrofosfaat, 50 mM Natriumfluoride, 2.1 mM natrium orthovanadate op pH 7,6, aangevuld met proteaseinhibitor cocktail) (zie tabel van materialen).
- Voor 15 min bij 4 ° C onder agitatie, schrapen van putjes met een pipet tip en verzamelen van het homogenaat in 1,5 mL buizen Incubeer.
- De buizen bij 11.600 x g Centrifugeer bij 4 ° C.
- Bewaren de bovendrijvende substantie in schone 1,5 mL buizen bij-80 ° C tot verwerking.
- Maatregel de eiwitconcentratie door de bicinchoninic-zuur-bepaling na de standaard protocol (zie tabel van materialen) 13.
- Lossen de 30 µg totaal eiwit lysate voor elk monster door de standaard techniek van 0,1% natrium dodecyl sulfaat, 10% polyacrylamide-gel elektroforese (SDS-PAGE) 14. Voorbeelden uitvoeren met 10 mM β-mercaptoethanol (vermindering voorwaarden) of zonder (niet-reducerende omstandigheden) afhankelijk van het antilichaam gebruikt voor het opsporen van de proteïne van belang.
- De gescheiden eiwitten van het polyacrylamidegel overbrengen naar een Polyvinylideenfluoride (PVDF) difluoride overdracht membraan met 0,45 µm poriegrootte via standaardprocedure.
- Na de overdracht, wassen van het membraan tweemaal met PBS, 0,1% Polysorbaat-20 (PBS-T) en blokkeren van aspecifieke bandplaatsen door toevoegen van 20 mL 2% BSA verdund in PBS-T voor gedetecteerde phosphoproteins of 5% non-fat droge melk in PBS-T voor totale eiwitten, onder agitatie (90 min, RT).
- Verdun het geselecteerde antilichaam in 10 mL van de juiste blokkeerbuffer bij de aanbevolen concentratie en Incubeer het membraan onder agitatie (ON, 4 ° C). Als alternatief, plaats het membraan in verzegelde plastic zakken en 5 mL van de verdunde antilichaam gebruikt.
- Volgende dag wassen het membraan drie keer (overtollige PBS-T, 15 min, RT).
- Incubate het membraan onder agitatie (30 min, RT) met 10 mL van de correspondent secundair antilichaam gekoppeld met mierikswortelperoxidase (HRP) verdund op 1:10,000 in de passende blokkeerbuffer.
- Wassen van het membraan driemaal onder agitatie (overtollige PBS-T, 15 min, RT).
- Incubeer het membraan voor 1 min met 0,1 mL/cm 2 van het peroxidase substraat Verbeterde Chemiluminescentie (ECL). Plaats de gedraineerde membraan tussen twee transparante plastic vellen en plaatst u deze in het Chemoluminescentie-detectiesysteem waarin een Charged-Coupled apparaat camera (CCD).
- Gebruiken de CCD-camera voor het detecteren van het signaal en de bijbehorende software om record beelden met de cumulatieve programma (afbeeldingen weergegeven geaccumuleerde signaal op elke 30 s blootstelling gedurende een periode van totaal 15 min).
- Kwantificeren van de intensiteit van de band door densitometrie met behulp van de software van de ImageJ volgens het protocol beschreven in de gids gebruiker 15.
- Open van het monster in de ImageJ-software en selecteer de band van belang met rechthoekige selectiegereedschap.
- Selecteren als het eerste lane en pers plot rijstroken om te verkrijgen van de profiel-percelen.
- Het gebied van de pieken met de lineaire selectie scheiden.
- De grootte van elke band meten door te klikken op de binnenkant van elke piek.
- Vertegenwoordigen de resultaten met betrekking tot het laden van eiwit controle (β-actine, tubuline, enz.).
6. Evalueren Endothelial Factor vrijgelaten uit leukocyten activering door hechting Assays
- verkrijgen van het endotheel geconditioneerde media.
- De MLEC-04-cellen te behandelen, zoals aangegeven in sectie 2 en het verzamelen van de cultuur supernatant na 24u stimulatie met LPS (100 ng/mL).
- Verzamelen de geconditioneerde media van de behandelde MLEC-04-cellen en centrifuge (600 x g). Houd het supernatant in 0,5 mL aliquots bij-80 ° C tot gebruik.
- Leukocyten hechting assay
- jas van de 96-wells-platen met 50 µL per putje van geselecteerde extracellulaire matrix eiwitten (met uitzondering van collageen, die is verdund in 0,1 M azijnzuur) in PBS is verdund: fibronectine (1-10 µg Mo/mL ), laminin (1-10 µg/mL) en collageen type I (10-40 µg/mL). Verlof op bij 4 ° C.
- De gecoate media negeren en blokkeren van aspecifieke bandplaatsen op putjes met 150 µL PBS, 1% BSA warmte-geïnactiveerd (1 min, 100 ° C) gedurende 90 minuten op RT.
- Was de putjes goed tweemaal met PBS en voeg 100 µL van eerder verzamelde endothelial geconditioneerd media (punt 6.1) toe aan de putjes.
Opmerking: Platen zijn klaar voor het uitvoeren van de bepaling van de wrijvingscoëfficiënt. - Cultuur de muis monocyt-macrofaag cellijn J774 in een biologische incubator (37 ° C, luchtvochtigheid van 95%, 5% CO 2) met Roswell Park Memorial Instituut Medium (RPMI), 10% FBS, 1% P/S.
Opmerking: De J774 cellen groeien in suspensie. - De J774 cellen in een tube van 15 mL en centrifuge (300 x g, 5 min) verzamelen. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellulaire pellet met 10 mL serum-vrije media. De cellen in een kamer Neubauer tellen. Centrifugeer de cellen (300 x g, 5 min), verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in serumvrij media op 15 x 10 4 J774 cellen per 50 µL media.
- Toevoegen 15 x 10 4 J774 cellen aan elk goed in 50 µL serumvrij media en incubeer gedurende 15 min bij 4 ° C, gevolgd door 1 uur bij 37 ° C in de CO 2 cel incubator.
- Was de putjes goed tweemaal, zachtjes door het toevoegen van warme PBS; centrifugeren (300 x g, 5 min) en weggeworpen door een 180° breuk van de pols van boven naar de beneden en snel herstel naar de oorspronkelijke positie. De gekoppelde cel reparerens door toevoeging van 100 µL per putje van 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS en incubeer (10 min, RT).
- Negeren de media zachtjes en permeabilize van de cellen met 2% methanol in PBS voor 2 min op RT. Discard de media zachtjes vlek de cellen door toevoeging van 50 µL per putje van 0,5% kristalviolet in 20% methanol voor 90 s op RT.
- De plaat met overvloedig stromend water wassen, verwijderen van de overtollige vloeistof en laat drogen. Verslag van de gekoppelde cellen door digitale camera gekoppeld aan een lichte Microscoop.
- Verdun de cel kleuring door 100 µL per putje van 0,1 M Natriumcitraat, 50% ethanol toe te voegen. Maatregel de absorptie bij 545 nm en vertegenwoordigen de resultaten als willekeurige eenheden van absorptie of percentage van de wrijvingscoëfficiënt door te overwegen van 100% als cel adhesie aan putjes bereikt bekleed met hogere ligand concentratie
7. Test Endothelial activering door leukocyten-endotheel co hechting Assay
- de MLEC-04-cellen op 96-wells-platen behandelen zoals beschreven in sectie 2 en met LPS (6 h, 37 ° C) incuberen.
- Fluorescently label J774 cellen met Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CSFE).
- Was de J774 cellen in PBS overeenkomstig de procedure van 6.2.5. Graaf de cellen door de Neubauer kamer methode en resuspendeer bij 1 x 10 6 cellen/mL in PBS, 0,1% BSA.
- Incubeer de cellen met CFSE (5 µM, eindconcentratie) gedurende 20 minuten bij 37 ° C. Voeg 5 mL onvolledig media en incubeer (5 min, 4 ° C).
- Een keer wassen met onvolledige media zoals uitgelegd in 6.2.5. resuspendeer op 15 x 10 4 cellen/100 µL en gaat u verder met de mede hechting assay.
- Na de behandeling van het endotheel, was de putjes drie keer met onvolledige media. CFSE-J774 cellen (15 x 10 4 cellen/100 µL) toevoegen aan elk endothelial beklede goed. Incubeer de plaat gedurende 10 minuten bij 4 ° C, gevolgd door 60 minuten bij 37 ° C.
- Was de putjes goed zacht, zoals beschreven in 6.2.7., met behulp van verwarmde PBS en verslag uitbrengen van de hechting van de J774 aan de endothelial laag door de volgende twee methoden:
- Lyse cellen in 0,1 M Tris-HCl pH 8,8, 1% SDS (100 µL per putje) en meet de CFSE-J774 signaal door fluorometry (excitatie/emissie = 492 nm/517 nm). Vertegenwoordigen van de resultaten als willekeurige eenheden van de intensiteit van de fluorescentie of percentage van de hechting ten opzichte van de positieve controle (signaal van totaal aantal cellen toegevoegd aan elk putje).
- Oplossen van de cellen in 4% PFA en verslag de bevestiging van de CFSE-J774-cellen aan het endotheel door visualiseren onder een fluorescentie Microscoop (excitatie/emissie = 492 nm/517 nm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Evaluatie van LPS-veroorzaakte endothelial cel activatie door RT-qPCR
De cellen van de MLEC-04 serum uitgehongerd werden gestimuleerd door 100 ng/mL LPS voor 6 h en de endothelial genexpressie werd beoordeeld met behulp van RT-qPCR door het vergelijken van de expressie van activering markers tot de rust toestand. Zoals blijkt uit figuur 1A, veroorzaakte de LPS-bebroede MLEC-04-cellen de uitdrukking van mRNA van geselecteerde celadhesie-moleculen die betrokken zijn bij de aanwervingsprocedures van de leukocyten tijdens de ontstekingsreactie (E-selectine, VCAM-1 en ICAM-1). PECAM-1 werd gebruikt als een interne controle, omdat de expressie is ongewijzigd onder deze experimentele behandeling. Figuur 1B vertegenwoordigt de endothelial activering door LPS gemeten door de verhoogde mRNA uitdrukking van de cytokines, Ccl5, Cxcl10 en Cxcl1. Deze moleculen zijn betrokken bij de activering van de circulerende leukocyten, met inbegrip van hun handel aan het endotheel laag en later extravasation op de site van de ontsteking. De cytokine, IL4, werd gebruikt als een interne controle onder deze experimentele behandeling.
Figuur 1: evaluatie van LPS-veroorzaakte endothelial cells activering door RT-qPCR. De MLEC-04 cellen werden gestimuleerd met 100 ng/mL LPS voor 6 h (rode balken) in vergelijking met de controle voorwaarde (blauwe staven), en de genexpressie werd geanalyseerd door RT-qPCR. Grafieken tonen vouw inductie van mRNA met betrekking tot de toestand van de controle van geselecteerde endothelial celadhesie-moleculen (A) en cytokines (B) die betrokken zijn bij de activering van de leukocyten en rekrutering tijdens de ontstekingsreactie. PECAM-1 en IL4 werden gebruikt als negatieve controles onder deze voorwaarde. Resultaten worden uitgedrukt als bedoel ± SEM uit één experiment, uit drie uitgevoerd, uitgevoerd in drievoud. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Eiwit expressie van celadhesie-moleculen op LPS-behandelde endotheliale cellen
Inflammatoire stimulatie werd uitgevoerd op de cellen van de MLEC-04 zoals beschreven in de vorige sectie en de eiwituitdrukking werd onderzocht door westelijke vlek techniek. De rust endotheel presenteert bijna onvindbare niveaus van de celadhesie-moleculen VCAM-1 en ICAM-1 (met de markering-). In aanwezigheid van LPS (+) is het endotheel geactiveerde fenotype duidelijk door de opregulatie van de expressie van de beschreven markers (Figuur 2). De membranen werden genormaliseerd door de detectie van de β-actine, die werd gebruikt als het laden-besturingselement voor het berekenen van de dichtheid van de relatieve band na densitometrie analyse.
Figuur 2: eiwit expressie van celadhesie-moleculen op de endotheliale cellen LPS-behandeld. Representatieve westelijke vlek beoordelende VCAM-1 en ICAM-1 eiwit expressie in rust (-) ten opzichte van LPS-behandeld (+) MLEC-04-cellen. De β-actine werd gebruikt als een besturingselement laden. Het moleculaire gewicht van elke proteïne is tussen vierkante haken. De waarden vertegenwoordigen de halve kwantificering van relatieve band dichtheden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Endotheel oppervlakte markeringen in LPS-gemedieerde ontsteking
De endothelial activering in de inflammatoire context werd beoordeeld door stroom cytometry na 6 uur-stimulatie door LPS (100 ng/mL). In deze voorwaarde, werd de detectie van lijm-gerelateerde moleculen betrokken bij leukocyte interactie geëvalueerd. Het linkerdeel van figuur 3A vertegenwoordigt basale expressie van de opgegeven markers in de rust MLEC-04-cellen (rood-solid histogram) in vergelijking met de negatieve controle van isotype (zwart-bezaaid histogram). Het rechterdeel van figuur 3A toont de resultaten afgeleid van gestimuleerd MLEC-04. De LPS-behandeling aanzienlijk upregulated de uitdrukking van de E-selectine, celadhesie-moleculen VCAM-1 en ICAM-1 in het plasma-membraan (rood-solid histogram) in vergelijking met de rust toestand (zwart-bezaaid histogram). Zoals in de cytometry profielen en aangehaald, voordat de expressie van PECAM-1 is ongewijzigd in deze experimentele toestand. Figuur 3B toont de kwantificering waarden gebruikt als verwijzingen voor het evalueren van mogelijke bemiddelaars van het endotheel ontstekingsreactie. %: percentage positieve cellen; MFI: bedoel intensiteit van de fluorescentie.
Figuur 3: Endothelial oppervlakte markeringen in LPS-gemedieerde ontsteking. Stroom cytometry profielen van de celadhesie-moleculen op rust en MLEC-04 LPS-gestimuleerd cellen. Het linker paneel toont eiwit expressie op de rustende cellen (antigeen label-rood histogram) met betrekking tot de isotype gematched controle (Ctrl-zwart histogram). Het rechterpaneel vergelijkt het celoppervlak eiwit expressie (zwarte histogrammen) naar de LPS-behandelde endotheliale cellen (rode histogram). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Signaalroutes geactiveerd door LPS stimulatie in de endotheliale cellen
De mechanismen die betrokken zijn bij de activering van de vasculaire compartiment tijdens ontsteking worden onderzocht door signalering sleutelmoleculen te evalueren. De MLEC-04-cellen gestimuleerd met LPS in verschillende periodes werden verwerkt voor eiwit extractie, en de mate van activering werd geanalyseerd door westelijke vlek techniek. Figuur 4 blijkt dat de IκB-α onderdrukker van NF-recombination signalering is phosphorylated na de 15 min LPS-incubatie, en keert terug naar de basale niveaus na 1 uur. Aan de andere kant, de LPS activeert ERK 1/2 signalering na 15 min, waarin een essentiële traject deelnemen endothelial activering tijdens de ontstekingsreactie. De membranen werden genormaliseerd door β-actine of ERK 1/2 detectie, die werden gebruikt als het laden besturingselementen voor het berekenen van de dichtheid van de relatieve band na densitometrie analyse.
Figuur 4: Signaling pathways getriggerd door LPS op endotheliale cellen. De MLEC-04-cellen gestimuleerd met 100 ng/mL LPS voor de tijden aangegeven in de figuur en de signaalroutes ERK 1/2 (P-ERK 1/2) en NF-kB (via P-IκBα) werden beoordeeld door westelijke vlek. Het ERK 1/2 totaal en β-actine werden gebruikt als het laden van de besturingselementen in elke voorwaarde. Het moleculaire gewicht voor elke proteïne is tussen vierkante haken. De waarden vertegenwoordigen de halve kwantificering van relatieve band dichtheden. Gelieve Klik hier om een grotere versie vanDit cijfer.
Verordening van het gedrag van de leukocyten door het endotheel gestimuleerd met LP 's
De biologische relevantie van het Reglement van endothelial activering op de progressie van de inflammatoire reactie wordt bepaald door functionele testen van leukocyten prestaties. Zoals beschreven in de sectie Protocol, zijn twee verschillende benaderingen opgenomen voor het testen van leukocyten functie geregeld endotheliale cellen. Hoewel de testen ondervragen verschillende aspecten van de ontstekingsreactie (RT-qPCR voor endothelial cytokines uitgebracht door de activering van de leukocyten en westelijke vlek voor endothelial celadhesie-moleculen in de leukocyten interactie), zijn de gegevens die verkregen beide evalueren microscopische details van leukocyten bijlage. De activering van de leukocyten door het endotheel oplosbare factoren is essentieel voor de ontwikkeling van een efficiënte ontstekingsreactie, zoals het gunsten cel hechting op diverse ondergronden. Figuur 5A toont de J774 cel adhesie naar 0,5 µg/mL fibronectine bekleed putten in eerder verzamelde geconditioneerde media naar aanleiding van het besturingselement of LPS behandeld endotheliale cellen. De heldere veld beelden en spectrofotometrische metingen geven aan dat de factoren die zijn uitgebracht in de geconditioneerde media van LPS-behandelde endotheel volstaan om efficiënt induceren J774 activering, zoals blijkt uit de inductie van cel gehechtheid aan fibronectine. Figuur 5B vertegenwoordigt een co hechting assay voor de evaluatie van het vermogen van de vasculaire laag ter ondersteuning van leukocyten stevige hechting door de nieuwe expressie van endothelial celadhesie-moleculen. Kort, waren de culturen serum uitgehongerd subconfluent van de MLEC-04-cellen gestimuleerd met LPS gedurende 6 uur meerdere keren gewassen en co geïncubeerd met de lijn van de leukocyten die j774 eerder gelabeld met de fluorescerende sonde, CFSE. Zoals blijkt uit het microfoto en metingen van de spectrofluorometric, gunsten de LPS-vasculaire stimulatie de interactie van het endotheel enkelgelaagde cellen CFSE-J774.
Figuur 5: leukocyten interactie aan LPS-bebroede endothelial enkelgelaagde door co hechting assay. (A) de lichte microscopie van afbeeldingen tonen kristalviolet kleuring van de cellen van de J774 gekoppeld aan 0,5 µg/mL fibronectine gecoat putjes in geconditioneerde media naar aanleiding van het besturingselement of de endotheliale cellen LPS-behandeld. Schaal bar, 50 µm. De spectrofotometrische analyse hieronder geeft de meting van de extinctie uitgedrukt als willekeurige eenheden (a.u.) ± SEM voor een representatieve experiment uitgevoerd in drievoud. (B) fluorescentie microfoto Toon aangesloten CFSE-J774 cellen naar het besturingselement of LPS-behandeld MLEC-04 cellen geëvalueerd door co hechting assay. Schaal bar = 50 µm. De fluorimetrische analyses hieronder toont u de intensiteit van de fluorescentie uitgedrukt als willekeurige eenheden (a.u.) ± SEM voor een representatieve experiment uitgevoerd in drievoud. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Doel | NCBI RefSeq ID | Doorsturen van de reeks (5´-3´) | Omgekeerde volgorde (5´-3´) |
| GAPDH | NM_001289726.1 | ACT GTG GAT GGC CCC TCT GG3 | TGA CCT TGC CCA CAG CCT GS |
| 36B4 | NM_007475.5 | AGA TGC AGC AGA TCC GCA T | GTT CTT GCC KAT CAG CAC C |
| Cxcl10 | NM_021274.2 | CAA AGC ATC CCG TTT CAC T | CCC CTT CTT GGT GAG GAA TA |
| Ccl5 | NM_013653.3 | TCT CTG CAG CTG CCC TCA CC | TCT TGA ACC CAC TTC TTC TC |
| Cxcl1 | NM_008176.3 | GGG AAG AAA TGC AAG CTG AA | CTG TAC AGC AGG GTC CTT GAC |
| IL1R2 | NM_010555.4 | AGT GCA GCA AGA CTC TGG TAC CTA | AGT TCC ACA GAC ATT TGC TCA CA |
| IL10 | NM_010548.2 | CTG GAC AAC ATA CTG CTA ACC G | GGG KAT CAC TTC TAC CAG GTA A |
| PECAM-1 | NM_008816.3 | CGA TGC GAT GGT GTA TAA CG | TGT CAC CTC CTT TTT GTC CAG |
| E-selectine | NM_011345.2 | GCA TGT GGA ATG ACG AGA GA | GTC AGG GTG TTC CTG TGG TT |
| VCAM-1 | NM_011693.3 | GGC TGA ACA CTT TTC CCA GA | CCG ATT TGA GCA ATC GTT TT |
| ICAM-1 | NM_010493.3 | CCG CTA CCA TCA CCG TGT A | GGC GGC TCA GTA TCT CCT C |
Tabel 1: Lijst van inleidingen gebruikt in deze studie.
| Rust | LPS | |||
| % | MFI | % | MFI | |
| CTRL | 1.79 | 3.5 | 0,55 | 3.48 |
| PECAM-1 | 37.52 | 12.09 | 37.82 | 12.24 |
| E-selectine | 17,12 | 8.06 | 88,13 | 49.84 |
| VCAM-1 | 53.08 | 20,51 | 99.30 | 204.05 |
| ICAM-1 | 99,76 | 114.81 | 99.82 | 363.89 |
Tabel 2: Endothelial oppervlakte markeringen in LPS-gemedieerde ontsteking. Kwantificering van cel adhesie moleculen meningsuiting op de MLEC-04-cellen rust en LPS-gestimuleerd door stroom cytometry analyse. De representatieve waarden voor iedere markeerdraad die overeenkomt met het percentage positieve cellen (%) en gemiddelde fluorescentie intensiteit (MFI's) in de endotheliale cellen van rust en LPS-gestimuleerd. PECAM-1 werd gebruikt als een negatieve controle onder deze experimentele omstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit endotheel protocol beschrijft een stapsgewijze technologie die de basis leggen voor verkennen nieuwe mechanismen die betrokken zijn bij de regulering van de ontstekingsreactie vaststelt. Deze benaderingen zijn gebaseerd op de studie van het endotheel activiteit gestimuleerd door LPS en evalueren van de kritische stappen betrokken bij de aanwervingsprocedures van de leukocyten tijdens de ontstekingsreactie, specifiek: endothelial cytokines release, endotheel hechting moleculen expressie en leukocyten hechting aan de vasculaire laag. Zodra de endothelial parameters zijn vastgesteld, het systeem voor nieuwe stoffen die betrokken zijn bij de regulering van endothelial functie kunt zoeken en bijgevolg, inflammatoire progressie. Die wettelijke drugs kunnen potentieel van belang zijn voor de farmaceutische markt. De grote projectie van dit sequentiële protocol is het opzetten van een Stichting voor het uitbreiden van deze studies verschillende endothelial typen en stimulerend voorwaarden door aan te passen aan de parameters van hun relatieve vasculaire activiteit.
Drugs geselecteerd door deze screening zal vormen interessante kandidaten voor het ontwerpen van nieuwe therapeutische strategieën tegen inflammatoire aandoeningen. Aan de ene kant, zullen de verbindingen die het voordeel van het endotheel antwoord en bijdragen aan leukocyte werving veelbelovende voor immunodeficiëntie voorwaarden16,17. Aan de andere kant zou het endotheel remmers uitstekende therapieën voor chronische ontstekingsziekten10vormen.
Karakterisering van de cytokinen die gestimuleerd endotheel voorspelt de evolutie van de ontsteking. Cytokines zijn kleine eiwitten uitgebracht door het endotheel laag in de inflammatoire context en sterk leukocyte gedrag te reguleren. Pro-inflammatoire leden, zoals Ccl5, Cxcl10 en Cxcl1, binden aan hun specifieke receptoren op het oppervlak van de leukocyten en signaal voor het opwekken van leukocyten interactie met de nieuw geformuleerde celadhesie-moleculen op de vasculaire laag (E-selectine, VCAM-1 en ICAM-1), en migratie naar de pathologische gebied (Figuur 1, Figuur 2, , Figuur 3)8,10,18. Andere leden van dezelfde familie van eiwitten zijn betrokken bij de resolutie van de ontsteking en bijgevolg weefselherstel. De uitdrukking van deze anti-inflammatoire cytokines is relevant voor chronische ontstekingsziekten omdat ze leukocyte werving belemmeren en immuniteit klaring10,19,20 gunst. Schakel mogelijke endothelial inflammatoire toezichthouders, is het aanbevolen om deze cytokine-expressie-test uitvoeren en evalueren van de expressie van het endotheel hechting moleculen in het bijzijn van de verbindingen van belang. In feite, analyseren de niveaus tussen anti-inflammatoire versus pro-inflammatoire cytokines kan worden gebruikt als een voorspellende waarde voor progressie van de ziekte en onthult de drug van therapeutisch belang21.
De LPS binden aan haar cel oppervlakte receptor triggers complexe intracellulaire signalering cascades o.l.v. kaart kinases ERK 1/2, JNK, en p38 en de NF-kB signalosome voor het opwekken van de inflammatoire transcriptionele programma. Veel van deze trajecten gelden voor andere inflammatoire stimuli zoals TNF-α of IL-110,22. De endothelial activering wordt bepaald door het detecteren van de gefosforyleerd vorm van de kaart kinase leden zoals voor ERK 1/2 in Figuur 4. Bovendien, de endothelial activering door LPS induceert enzymatische activiteit van de complexe, IKKβ die kinaseenzym en degradeert de NF-kB-remmer complexe IκB, waardoor NF-kB effector Ledenvande nucleaire translocatie voor het uitvoeren van de correspondent transcriptionele activiteit (Figuur 4). Karakterisering van de mechanismen waarmee de drug compound het endotheel inflammatoire respons beïnvloedt is zeer nuttig, niet alleen in het beschrijven van de drug, maar ook in het ontwerpen van nieuwe inflammatoire behandelingen in combinatie met compatibele conventionele therapieën 23.
Verbindingen geselecteerd uit het endotheel inflammatoire screening tests, moet verder worden bestudeerd om te bevestigen hun functionele relevantie in de kritische stappen van leukocyten gedrag testen, aangezien de cellen uiteindelijk verantwoordelijk zijn voor de inflammatoire aandoeningen. Deze testen analyseren de leukocyten activiteit in twee verschillende experimentele instellingen. De eerste is bij de beoordeling van de rol van cytokines endotheel-vrijgegeven op leukocyten activering door integrine-gemedieerde hechting testen. Het verschijnsel van de leukocyten worden geactiveerd door het endotheel vrijgegeven cytokines. Leukocyten zelfklevende kunnen integrine liganden is dus een representatieve meting voor leukocyten functie8,10,18. De tweede is bij het bestuderen van de rol van de nieuw geformuleerde endothelial celadhesie-moleculen op de interactie van de leukocyten op de vasculaire laag door co hechting testen. Het endotheel celadhesie-moleculen uitgedrukt in de inflammatoire context is essentieel voor leukocyten werving aan het omliggende weefsel. Analyseren van de leukocyten interactie met het endotheel-behandeld enkelgelaagde van cellen vormt dus, een prognostische waarde voor inflammatoire progressie (Figuur 5)8,10,18. De resultaten afgeleid uit deze benaderingen zou suggereren dat de geselecteerde verbindingen serieuze kandidaten zijn bij het ontwerpen van toekomstige strategieën voor behandeling van inflammatoire aandoeningen
Het experimentele voorstel hier gedefinieerd is een veelzijdig instrument voor toekomstige toepassingen vanwege de mogelijkheid om te extrapoleren naar andere systemen voor cellulaire of stimulerend. De procedure kan worden gewijzigd aan het endotheel van verschillende oorsprong of soort, en voor het testen van de functionaliteit op verschillende immuuncellen, evenals verschillende inflammatoire agenten zoals LPS, TNF-α, bacteriën, virussen, enz. Zoals beschreven in de tekst, onderzoekers moeten eerst de endothelial activering te karakteriseren in hun eigen systeem te later karakteriseren de rol van een geselecteerde stof op de ontstekingsreactie. Beperkingen van het protocol zijn de keuze van een passende negatieve controle en juist in het geval van het endotheel activiteit-parameters die onderscheiden de rust van de gestimuleerd staat te definiëren. In het geval dat de in dit document beschreven voorwaarden niet voor een ander systeem werken, moeten onderzoekers de experimentele parameters oplossen door extra tijd-afhankelijke testen uitvoeren en het gebruik van een gradiënt van de concentratie van de inflammatoire stimulus het definiëren van een stimulerend venster waarmee voor het testen van nieuwe geneesmiddelen voor de regulering van de ontstekingsreactie.
Tot slot, wordt dit endotheel inflammatoire protocol aanbevolen voor het zoeken van nEW endothelial regelgevers gericht op de ontstekingsreactie. Uitvoeren van deze procedure zorgt voor roman, interessante verbindingen die kunnen worden toegepast in het bestuderen van haar toekomstige toepassingen en ontwerpen van innovatieve vasculaire-specifieke therapieën tegen inflammatoire-gerelateerde ziekten, en die mogelijk zou kunnen zijn van belang zijn voor de farmaceutische markt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) en het Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (subsidie getal IERPY 1149/16 A.L.; MPY 1410/09 naar S. Hortelano); door de MINECO via het Fondo de Investigación en Salud (FIS) (S. Hortelano verleent nummers PI11.0036 en PI14.0055). S. Herranz werd gesteund door IERPY 1149/16 van ISCIII.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| DMEM-F12 | Lonza | BE12-719F | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | A4503 | |
| Penicillin streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Trypsine | Lonza | BE17-160E | |
| EDTA | Sigma | ED2SS | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| Trizol | Sigma | T9424 | RNA extraction buffer |
| Isopropanol | Sigma | 33539 | |
| Ethanol absoluto | Panreac | 1,310,861,612 | |
| Pure H2O | Qiagen | 1017979 | RNAse free |
| Agarose | Pronadisa | 8020 | |
| Stain for agarose gels | Invitrogen | s33102 | |
| SuperScript III First-Strand Synth | Invitrogen | 18080051 | Reagents for RT-PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385610 | Fluorescent stain for qPCR |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well | Applied Biosystems | 4346906 | Plates for qPCR |
| U-bottom 96 well plates | Falcon | 353072 | |
| Cytometry tubes | Falcon | 352054 | |
| TX100 | Panreac | 212314 | Non-ionic surfactant |
| Tris-HCl | Panreac | 1,319,401,211 | |
| Sodium chloride | Merck | 1,064,041,000 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Sodium fluoride | Sigma | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | sigma | 13721-39-6 | |
| Protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | Reagents for bicinchoninic acid assay |
| β-mercaptoethanol | merck | 805,740 | |
| PVDF Transfer Membrane, 0.45 µm | Thermo Scientific | 88518 | |
| Tween-20 | Panreac | 1,623,121,611 | Polysorbate 20 |
| PBS | Lonza | BE17-515Q | |
| ECL | Millipore | WBKLS0500 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Collagen type I | Sigma | c8919 | |
| Acetic acid | Panreac | 1,310,081,611 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Panreac | 1,310,911,612 | |
| Crystal violet | Sigma | HT90132 | |
| Sodium citrate | Sigma | C7254 | |
| Ethanol 96% | Panreac | 1,410,851,212 | |
| CFSE | Sigma | 21888 | |
| RPMI | Lonza | BE12-115F | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Infinite M200 | Tecan | M200 | Multi mode microplate reader |
| Gel Doc 2000 | Bio-Rad | 2000 | Gel documentation system |
| StepOnePlus | Applied Biosystems | StepOnePlus | qPCR system |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | Analyzer 10 | Cytometry equipment |
| ChemiDoc MP | Bio-Rad | MP | Chemiluminescence detection system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| PECAM-1 | BD Biosciences | 553370 | Use at 10 µg/mL |
| ICAM-2 | Biolegend | 1054602 | Use at 10 µg/mL |
| E-selectin | BD Biosciences | 553749 | Use at 10 µg/mL |
| VCAM-1 | BD Biosciences | 553330 | Use at 10 µg/mL |
| ICAM-1 | Becton Dickinson | 553250 | Use at 10 µg/mL |
| anti-rat IgG-FITC | Jackson Immuno Research | 112-095-006 | Use at 10 µg/mL |
| anti armenian hamster-FITC | Jackson Immuno Research | 127-095-160 | Use at 10 µg/mL |
| Rat IgG isotyope control | Invitrogen | 10700 | Use at 10 µg/mL |
| Armenian hamster IgG isotype control | Invitrogen | PA5-33220 | Use at 10 µg/mL |
| P-IκΒ-α | Cell Signaling | 2859 | Use at 10 µg/mL |
| β-Actin | Sigma | A5441 | Use at 10 µg/mL |
| P-ERK | Cell Signaling | 9101 | Use at 10 µg/mL |
| anti-mouse HRP | GE Healthcare | LNXA931/AE | Use at 1:10,000 |
| anti-rabbit HRP | GE Healthcare | LNA934V/AG | Use at 1:10,000 |
| anti-rat HRP | Santa Cruz | Sc-3823 | Use at 1:10,000 |
References
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn's disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Skeoch, S., Bruce, I. N. Atherosclerosis in rheumatoid arthritis: is it all about inflammation? Nat Rev Rheumatol. 11 (7), 390-400 (2015).
- Gerhardt, T., Ley, K. Monocyte trafficking across the vessel wall. Cardiovasc Res. 107 (3), 321-330 (2015).
- Andonegui, G., et al. Mice that exclusively express TLR4 on endothelial cells can efficiently clear a lethal systemic Gram-negative bacterial infection. J Clin Invest. 119 (7), 1921-1930 (2009).
- McDonald, B., Jenne, C. N., Zhuo, L., Kimata, K., Kubes, P. Kupffer cells and activation of endothelial TLR4 coordinate neutrophil adhesion within liver sinusoids during endotoxemia. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (11), G797-G806 (2013).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat Rev Immunol. 7 (10), 803-815 (2007).
- Chamorro, Á, Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation. Lancet Neurol. 15 (8), 869-881 (2016).
- Hortelano, S. ILK mediates LPS-induced vascular adhesion receptor expression and subsequent leucocyte trans-endothelial migration. Cardiovasc Res. 86 (2), 283-292 (2010).
- Palazón, A. Agonist anti-CD137 mAb act on tumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes. Cancer Res. 71 (3), 801-811 (2011).
- Jiménez-García, L. 8,9-Dehydrohispanolone-15,16-lactol diterpene prevents LPS-triggered inflammatory responses by inhibiting endothelial activation. Biochem J. 473 (14), 2061-2071 (2016).
- SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RT-PCR. , Life Technologies. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/superscriptIIIfirststrand_pps.pdf (2013).
- Livak, K. J., Schmittge, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Pierce BCA Protein Assay Kit. , Thermo Scientific. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf (2017).
- He, F. Laemmli-SDS-PAGE. BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).
- ImageJ User Guide. , ImageJ. Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide-USbooklet.pdf (2017).
- Hohsfield, L. A., Humpel, C. Intravenous infusion of monocytes isolated from 2-week-old mice enhances clearance of Beta-amyloid plaques in an Alzheimer mouse model. PloS One. 10 (4), e0121930 (2015).
- Hofland, R. W., Thijsen, S. F. T., Verhagen, M. A. M. T., Schenk, Y., Bossink, A. W. J. Tuberculosis during TNF-α inhibitor therapy, despite screening. Thorax. 68 (11), 1079-1080 (2013).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Tedgui, A., Mallat, Z.
- Zheng, Y., Humphry, M., Maguire, J. J., Bennett, M. R., Clarke, M. C. H. Intracellular interleukin-1 receptor 2 binding prevents cleavage and activity of interleukin-1α, controlling necrosis-induced sterile inflammation. Immunity. 38 (2), 285-295 (2013).
- Pripp, A. H., Stanišić, M. The correlation between pro- and anti-inflammatory cytokines in chronic subdural hematoma patients assessed with factor analysis. PloS One. 9 (2), e90149 (2014).
- Guha, M., Mackman, N. LPS induction of gene expression in human monocytes. Cell Signal. 13 (2), 85-94 (2001).
- Tabas, I., Glass, C. K. Anti-inflammatory therapy in chronic disease: challenges and opportunities. Science. 339 (6116), 166-172 (2013).
