Summary
Endotelio vascular controla firmemente el reclutamiento leucocitario. Extravasación leucocitaria inadecuada contribuye a enfermedades inflamatorias humanas. Por lo tanto, es necesario diseñar mejores terapias para trastornos inflamatorios buscando nuevos elementos reguladores de la activación endotelial. Aquí, describimos una completa metodología para caracterizar nuevos reguladores endoteliales que pueden modificar el tráfico de leucocitos durante la inflamación.
Abstract
La capa endotelial es esencial para mantener la homeostasis en el cuerpo mediante el control de muchas funciones diferentes. Regulación de la respuesta inflamatoria por la capa endotelial es crucial para combatir eficientemente insumos perjudiciales y ayuda en la recuperación de áreas dañadas. Cuando las células endoteliales están expuestas a un ambiente inflamatorio, como el componente externo de la membrana de bacterias Gram-negativas, lipopolisacárido (LPS), express soluble citoquinas proinflamatorias, tales como Ccl5, Cxcl1 y Cxcl10 y desencadenar la activación de leucocitos en circulación. Además, la expresión de moléculas de adhesión E-selectina, VCAM-1 y ICAM-1 en la superficie endotelial permite la interacción y adhesión de los leucocitos activados a la capa endotelial y finalmente la extravasación hacia los tejidos inflamados. En este escenario, la función endotelial debe ser estrictamente regulada debido a una activación excesiva o defectuosa en el reclutamiento de leucocitos podría conducir a trastornos inflamatorios. Puesto que muchos de estos trastornos no tienen un tratamiento eficaz, deben investigarse nuevas estrategias con un enfoque en la capa vascular. Proponemos el análisis integrales que son útiles para la búsqueda de nuevos reguladores endoteliales que modifican la función leucocitaria. Analizamos activación endotelial utilizando objetivos de expresión específicos involucrados en el reclutamiento de leucocitos (por ejemplo, citocinas, quimiocinas y moléculas de adhesión) con varias técnicas, incluyendo: (reacción en cadena de la polimerasa cuantitativo en tiempo real RT-qPCR), western-blot, ensayos de citometría y adhesión de flujo. Estos enfoques determinan la función endotelial en el contexto inflamatorio y son muy útiles para llevar a cabo ensayos de investigación para caracterizar nuevos reguladores inflamatorios endoteliales que son potencialmente valiosos para el diseño de nuevas estrategias terapéuticas.
Introduction
La inflamación es una respuesta biológica beneficiosa frente a agentes infecciosos, con el objetivo principal para eliminar el patógeno y reparar el tejido dañado. Bajo ciertas condiciones, como infecciones crónicas o enfermedades autoinmunes, la inflamación no se resuelve. En cambio, es una reacción aberrante con la continua infiltración de leucocitos, dando por resultado una respuesta inmune prolongada que conduce a daño de tejido, fibrosis, pérdida de función y en general, discapacidad y en algunos casos la muerte del paciente. Estos trastornos humanos, catalogados como enfermedades inflamatorias, todas involucran los vasos sanguíneos para el control de leucocitos extravasación1,2.
Las células endoteliales juegan un papel fundamental en la regulación de la respuesta inflamatoria al controlar el tráfico de leucocitos. Cuando la capa endotelial está expuesta a mediadores inflamatorios tales como el LPS, el endotelio reposo activa y expresa las citoquinas pro inflamatorias (Cxcl10, Cxcl5, Cxcl1, etc.) y moléculas de adhesión (E-selectina, VCAM-1 y ICAM-1) que favorecen reclutamiento de leucocitos al sitio de infección de la circulación. Los leucocitos preparados por las citoquinas liberadas entonces median del balanceo y la interacción con la capa endotelial a través de las correspondientes contrapartes adhesivo: PSGL-1 y selectina, la integrina α4β1 VCAM-1, αLβ2 integrina ICAM-1. Finalmente, los leucocitos migran a través de la vasculatura hacia el foco de inflamación3.
El papel esencial del endotelio en la regulación de la respuesta inflamatoria se ha demostrado en ratones que fueron genéticamente modificados para expresar el receptor de LPS, el receptor de tipo toll 4 (TLR4), sólo en las células endoteliales. Estos animales endotelial TLR4 eran capaces de responder a una inflamación mediada por el LPS y para detectar la infección generada después de la inoculación de bacterias y en consecuencia lograr la resolución de la infección y supervivencia en niveles similares como los ratones de tipo salvaje4 , 5.
Por la vía de la respuesta inflamatoria regulada por el endotelio, se ha postulado que la inhibición en algunas etapas de la interacción leucocito endotelio daría lugar a la reducción de la migración trans-endotelial y un mejor pronóstico para enfermedades inflamatorias. De hecho, diversas estrategias dirigidas a la interacción endotelial activación y leucocito endotelio han sido diseñados para impedir la extravasación de células inmunitarias como tratamiento para trastornos inflamatorios6,7.
En este informe, describimos un grupo completo de en vitro técnicas para caracterizar completamente la actividad endotelial en respuesta a los LPS de estímulo inflamatorio y su papel en la activación del leucocito y adherencia a la capa vascular. El modelo de célula endotelial utilizado en este manuscrito fue la línea de células endoteliales de pulmón de ratón (LMCE-04), según lo descrito por Hortelano et al. 8. línea de celular de la LMCE-04 ha sido validado en la literatura un sistema apropiado para el estudio de activación endotelial9,10. Basado en sus intereses de investigación, estos enfoques se pueden extrapolar fácilmente a cualquier endotelial o sistemas del leucocito y el perfil inflamatorio. Una vez definidos los parámetros endoteliales en las condiciones seleccionadas, el sistema puede probar nuevos fármacos en la experimentación propuesta para evaluar la activación vascular. En este contexto inflamatorio, las células del endotelio con el compuesto de interés pueden ser comparadas con las condiciones de control de las células, y las diferencias resultantes pueden informar resultado pronóstico del fármaco sobre el desarrollo y progresión de la inflamación. Para concluir, proponemos un sistema relevante para caracterizar nuevos objetivos de medicamentos a las células endoteliales, que pueden influir en el diseño de nuevas terapias vasculares específicos contra enfermedades inflamatorias.
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Protocol
1. cultivo de células endoteliales
- cultivo de tejidos tratados placas
- placas de cultivo de tejidos capa 100 mm con gelatina de 2,5 mL de solución (autoclave, 0.1% gelatina en agua destilada) por 30 min a 37 ° C; esta puede ser extrapolado para el formato bien requerido. Aspirar la solución de gelatina y dejar placas secar al aire en la campana de cultivo de tejido.
- Las condiciones de cultivo de tejidos
- cultivar las células de la LMCE-04 dentro de una incubadora biológica (37 ° C, 95% de humedad, 5% CO 2). Crecer las células en un medio completo de Dulbecco ' s Modified Eagle Medium: mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F-12) suplementado con 10% suero bovino Fetal (FBS) y 100 unidades/mL de penicilina y estreptomicina 100 μg/mL (P/S).
- Contar las celdas por el método estándar de la cámara de Neubauer y añadir las células LMCE-04 a las placas de gelatina tratada de 100 mm en medios completo 10 mL, en una baja densidad de 2-11 x 10 4 células/cm 2. Dividir las células 1:3 cuando alcanzan confluencia.
Nota: Esto ocurre generalmente después de dos a tres días de cultura. - Subcultivo las células lavando los platos con 10 mL estéril fosfato tampón salino (PBS) seguido añadiendo 2 mL de solución de tripsina-EDTA (0.25% tripsina, 5 mM EDTA) e incubar 3 min a 37 ° C.
- Detener la reacción de tripsina-EDTA y recuperar las células suspendidas mediante la adición de medios completo 10 mL. Desactivación de las células (300 x g, 5 min), eliminar el sobrenadante, Resuspender el precipitado celular en mas medios y subcultura apropiadamente.
2. Tratamiento de LPS y mediadores
- placa las células LMCE-04 en medios completo en sub-confluencia en el siguiente formato así: 7 x 10 5 células/pozo en placas de 6 pocillos y 2.5 x 10 5 células/pozo en placas de 96 pocillos.
- Incubar el cultivo durante 6 h en un incubador celular (37 ° C, 95% de humedad, 5% CO 2). Cambiar las celdas a media incompleta (DMEM-F12, P/S) y dejar durante la noche (ON) para sincronizar y para reducir la actividad celular.
- Quitar los medios de comunicación y probar nuevos compuestos farmacológicos incubando las células endoteliales con (o sin) el medicamento en cuestión (por ejemplo DT 10) diluido en los medios de comunicación incompleta (30 min, 37 º C); agregar 1,4 mL/pozo de placa de 6 pozos o 0.14 mL/pocillo para placas de 96 pocillos).
- Desafiar las células mediante la adición de LPS a los medios de incubación (100 ng/mL, concentración final) para el período de tiempo especificado en cada ensayo. Uso de PBS como un control de.
3. Evaluación del perfil transcripcional en el endotelio activado por RT-qPCR
- células de semilla la LMCE-04 en confluencia sub cultura bien 6 placas (7 x 10 5 células/pocillo). Incubar durante 6 h (37 ° C, 95% de humedad, 5% CO 2) y luego proceder a la inanición de suero (incubar ON).
- Quitar los medios de comunicación y trata (o no tratar) la célula endotelial culturas con la droga de interés diluyeron en los medios de comunicación incompleta (Incubar 30 min, 37 º C); agregar 1,4 mL/pozo de placa de 6 pozos (30 min, 37 º C).
- Desafiar las células mediante la adición de 100 ng/mL LPS a los medios incubados (como se describe en el paso 2.3) e Incube por 6 h. detener la reacción lavando dos veces con PBS frío y mantener las placas a-80 ° C hasta el procesamiento de las muestras.
- Extracción de RNA
- descongela las placas y añade 1 mL/pocillo RNA de tampón de extracción (38% de fenol e isotiocianato de guanidinio de 0,8 M; véase la tabla de materiales). Deja durante 30 min a temperatura ambiente (RT) bajo agitación y recoger homogeneizado en tubos de 1.5 mL.
- Añadir cloroformo μl 200 y agite suavemente para 15 s. Incubar 3 min a RT y centrífuga (11.600 x g, 15 min, 4 ° C).
- Transferencia de la fase acuosa a otro tubo de 1,5 mL. Precipitado de RNA mediante la adición de 500 de μl isopropanol, seguido por una incubación de 10 min en RT y luego a centrifugación (11.600 x g, 4 º C).
- Eliminar el sobrenadante y lavar el pellet con etanol al 75% por agitación vortex y luego centrifugación (7.500 x g, 4 º C).
- Secar el pellet y solubilizar RNA en 25 μl puro H 2 O por incubar 10 min a 55 ° C. Mantenga RNA a-80 ° C hasta el procesamiento de las muestras.
- Cantidad y pureza del ARN
- cuantificar la concentración de RNA midiendo la absorbancia de la muestra a 260 nm en un espectrofotómetro (véase Tabla de materiales).
- Medida a 230 nm y 280 nm para determinar la pureza del RNA.
Nota: La relación a 260/280 indica contaminación de proteínas o fenol. Es aceptable una proporción de cerca de 2. El cociente en el 260/230 indica EDTA, hidratos de carbono o contaminantes de fenol. Son aceptables valores entre 2.0-2.2.
- RNA comprobar integridad
- Run 2 μg de ARN total y un RNA escalera en un 1.5% gel de la agarosa de la desnaturalización, visualizar en un sistema de documentación de gel (véase Tabla de materiales).
Nota: Una proporción de 2:1 de las bandas de rRNA 28S y 18S de claridad indica un RNA intacto. Parcialmente degradado RNA resuelve como un aspecto aplastado.
- Run 2 μg de ARN total y un RNA escalera en un 1.5% gel de la agarosa de la desnaturalización, visualizar en un sistema de documentación de gel (véase Tabla de materiales).
- RT-qPCR
- sintetiza el ADN complementario (ADNc) de un solo RNA trenzado siguiendo el estándar protocolo (véase Tabla de materiales) 11.
- Evaluar expresión génica por RT-qPCR
- preparar la mezcla de reacción para cada muestra: mezcla 2 μl cDNA compuesto fluorescente de 7 μl, primer avance de 300 nM y 300 nM inversa la cartilla (tabla 1) en un volumen final de 13 μl y añadir a la placa de reacción de 96 pocillos (véase Tabla de materiales).
- Sellar la placa con una cubierta adhesiva óptica, centrífuga (300 x g, 1 min) y la reacción en un sistema de PCR en tiempo real (Inicio caliente 95 ° C por 20 s seguido de 40 ciclos: 95 ° C 3 s y 60 ° C para 30 s) (véase Tabla de materiales).
- Analizar los resultados de cuantificación relativa usando el método comparativo 2 -ΔΔCt con el housekeeping genes gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) o fosfoproteína ribosomal ácida P0 (36B4) 12 .
4. Evaluar activación endotelial por citometría de flujo
- tratar las células de la LMCE-04 siguiendo las condiciones descritas en la sección 2 y evaluar los cambios en las proteínas de la superficie endoteliales por el flujo cytometry.
- Separar las células después de 6 h de estimulación LPS con el método de tripsina-EDTA se describe en paso 1.2.3 y lavan con los medios de comunicación incompleta a 4 ° C.
- Contar las células con el método de cámara de Neubauer y coloque 10 x 10 4 células en placas de 96 pocillos de fondo u. Centrífuga (300 x g, 5 min) y descartar sobrenadante por un 180° encajen de la muñeca de arriba a la parte inferior y rápida recuperación a la posición original.
- Añadir 50 μl de anticuerpo seleccionado diluido en los medios de comunicación incompleta (10 μg/mL, concentración final) a las células e incubar (30 min, 4 ° C).
- Lavan las células dos veces won los medios de comunicación incompletas, siguiendo el procedimiento descrito en paso 4.3 e incuban con 50 μl a 10 μg/mL del anticuerpo secundario correspondiente acoplado a FITC o una conjugación similar (30 min, 4 ° C en un espacio oscuro).
- Lave las células una vez con los medios de comunicación incompleta seguida de un lavado con PBS. Recuperar las células con PBS 300 μL con puntas de pipeta de 1 mL y colocar en tubos de citómetro.
- Evaluar las muestras en el sistema de citometría de flujo (véase Tabla de materiales). Ajustar la población de la célula por los parámetros de dispersión lateral y hacia adelante. Puerta de la población de interés. Ajuste puertas basados en el control negativo de células incubadas con control de isotipo. Analizar los resultados como el porcentaje de células positivas o media de intensidad de fluorescencia 8.
5. Evaluar activación endotelial por Western Blot
- semilla el endotelio en las confluencia en placas de cultivo de 6 pozos (7 x 10 5 células/pocillo) y tratar con LPS como se describe en la sección 2. Analizar la expresión de la proteína inflamatoria mediante el siguiente protocolo de inmunoblot.
- Detener la estimulación LPS en diferentes puntos temporales para aclarar diversos aspectos de la respuesta endotelial:
- determinar el perfil de proteínas inflamatorias después de 6 h de la estimulación de LPS.
- Determinar la célula de señalización cada 15 min por un periodo de 60 min.
- En ambos casos, detener la reacción lavando dos veces con PBS frío y almacenar las muestras a-80 ° C hasta el procesamiento de las muestras. Buffer
- Lyse las células y la extracción de la proteína
- lisis de añadir 200 μl a cada pozo (1% de tensioactivo no iónico, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 150 mM cloruro sódico, pirofosfato de sodio de 30 mM, fluoruro de sodio 50 mM 2,1 mM ortovanadato de sodio en pH 7,6, con inhibidor de la proteasa cóctel) (véase tabla de materiales).
- Incubar por 15 min a 4 ° C bajo agitación, raspar pozos con una punta de pipeta y recoger el homogeneizado en tubos de 1.5 mL.
- Centrifugar los tubos a 11.600 x g a 4 ° C.
- Guarde el sobrenadante en tubos de 1,5 mL limpio a-80 ° C hasta el procesamiento de.
- Medida de la concentración de proteína por el análisis de ácido bicinchoninic siguiendo el estándar de protocolo (véase tabla de materiales) 13.
- Resolver el 30 μg de la proteína total lisada para cada muestra por la técnica estándar de 0.1% dodecil sulfato de sodio, 10% de poliacrilamida gel electroforesis (SDS-PAGE) 14. Ejecutar muestras con 10 mM β-mercaptoetanol (condiciones reductoras) o sin (condiciones no reductoras) dependiendo de los anticuerpos utilizados para detectar la proteína de interés.
- Transferencia de las proteínas separadas del gel de poliacrilamida a una membrana de transferencia del polivinilideno (PVDF) de difluoruro con 0.45 μm tamaño de poro usando procedimientos estándar.
- Después de la transferencia, lavar la membrana dos veces con PBS, 0,1% polisorbato-20 (PBS-T) y bloquear los sitios de Unión inespecíficos mediante la adición de 20 mL 2% BSA diluido en PBS-T para fosfoproteínas detectados o leche en polvo sin grasa 5% en PBS-T para proteínas totales, bajo agitación (90 min, RT).
- Diluir el anticuerpo seleccionado en 10 mL de la solución amortiguadora de bloqueo correspondiente a la concentración recomendada e incubar la membrana bajo agitación (ON, 4 ° C). O bien, colocar la membrana en bolsas de plástico selladas y utiliza 5 mL del anticuerpo diluido.
- Día siguiente, lavar la membrana tres veces (exceso PBS-T, 15 min, RT).
- Incubar la membrana bajo agitación (30 min, RT) con 10 mL del anticuerpo secundario correspondiente ligada a peroxidasa de rábano (HRP) diluido al 1: 10,000 en el amortiguador de bloqueo apropiado.
- Lavar la membrana tres veces bajo agitación (exceso PBS-T, 15 min, RT).
- Incubar la membrana durante 1 min con 0.1 mL/cm 2 de la quimioluminescencia de sustrato mejorado de peroxidasa (ECL). Coloque la membrana de drenado entre dos láminas de plástico transparentes e inserte en el sistema de detección de quimioluminiscencia que incluye una cámara de dispositivo Charged-Coupled (CCD).
- Usar la cámara del CCD para detectar la señal y su software para grabar imágenes con el programa acumulativo (imágenes Mostrar señal acumulada en cada exposición 30 durante un periodo total de 15 min).
- Cuantificar la intensidad de la banda por densitometría utilizando el software ImageJ siguiendo el protocolo descrito en el manual de usuario 15.
- Abrir la muestra en el software ImageJ y seleccione la banda de interés con la herramienta selección rectangular.
- Seleccionar el primer carril y prensa trazar carriles para obtener los diagramas de perfil.
- Delimitar el área de los picos con la selección straight-line.
- Medir el tamaño de cada grupo haciendo clic en el interior de cada pico de.
- Representan los resultados con respecto a la carga del control de la proteína (β-actina, tubulina, etc).
6. Evaluar el Factor endotelial libera de activación del leucocito por ensayos de adherencia
- obtener los medios condicionados endoteliales.
- Tratar las células de la LMCE-04 como se indica en la sección 2 y recoger el sobrenadante del cultivo después de la estimulación de 24 h con LPS (100 ng/mL).
- Recopilar los medios condicionados de las células tratadas de LMCE-04 y centrífuga (600 x g). No el sobrenadante en alícuotas de 0.5 mL a-80 ° C hasta su uso.
- Ensayo de adherencia del leucocito
- cubrir las placas de 96 pocillos con 50 μL/pocillo de proteínas de matriz extracelular seleccionado diluido en PBS (a excepción de colágeno, que se diluye en ácido acético de 0,1 M): fibronectina (1-10 μg/mL ), laminina (1-10 μg/mL) y colágeno tipo I (10-40 μg/mL). EN licencia a 4 ° C.
- Descartar los medios recubiertos y bloquear sitios de Unión inespecíficos en pozos con 150 μL de PBS, 1% de BSA inactivado con calor (1 min., 100 ° C) durante 90 minutos a TA.
- Lavar los pozos dos veces con PBS y añadir 100 μl de previamente recogida endotelial acondicionado los medios de comunicación (sección 6.1) a los pocillos.
Nota: Las placas están listas para realizar el ensayo de adherencia. - La línea del celular del monocito-macrófago del ratón J774 en un incubador biológico (37 ° C, 95% de humedad, 5% CO 2) de la cultura con Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI), 10% FBS, 1% P/S.
Nota: Las células J774 crecen en suspensión. - Recoger las células J774 a un tubo de 15 mL y centrifugar (300 x g, 5 min). Deseche el sobrenadante y resuspender el sedimento celular con medios libres de suero de 10 mL. Contar las células en una cámara de Neubauer. Centrifugar las células (300 x g, 5 min), eliminar el sobrenadante y resuspender las células en medios libres de suero en 15 x 10 4 J774 células por medios μl 50.
- Agregar 15 x 10 4 J774 células a cada bien en 50 μl suero los medios de comunicación e Incubar 15 min a 4 ° C, seguida por 1 h a 37 ° C en la incubadora de CO 2 celular.
- Lavar los pozos dos veces, suavemente agregando PBS caliente, centrifugar (300 x g, 5 min) y descarte el sobrenadante por un ajuste de 180° de la muñeca de arriba a la parte inferior y rápida recuperación a la posición original. Fijar la celda adjuntas mediante la adición de 100 μL/pocillo de paraformaldehído al 4% (PFA) en PBS e incubar (10 min, RT).
- Deseche con cuidado los medios de comunicación y permeabilizar las células con metanol al 2% en PBS por 2 min en RT. desechar los medios de comunicación suavemente y mancha las células añadiendo 50 μL/pocillo de violeta de cristal de 0,5% en metanol al 20% para 90 s en RT.
- Lavar la placa con abundante agua corriente, deseche el exceso de líquido y dejarlo secar al aire. Informe de las células conectadas con cámara digital acoplada a un microscopio de luz.
- Diluir la célula tinción mediante la adición de 100 μL/pocillo de citrato de sodio de 0.1 M, 50% de etanol. Medir la absorbancia a 545 nm y representan los resultados como unidades arbitrarias de absorbancia o porcentaje de adherencia, considerando 100% como la adhesión celular alcanzaron a pozos recubierta con mayor concentración de ligando
7. Prueba de activación endotelial por análisis de la adherencia del leucocito endotelio
- tratar las LMCE-04 las células en placas de 96 pocillos como se describe en la sección 2 e incubar con LPS (6 h, 37 ° C).
- De la etiqueta fluorescente las células J774 con éster de Succinimidyl Carboxyfluorescein (CSFE).
- Lavado el J774 células en PBS siguiendo el procedimiento en 6.2.5. Recuento de las células por la Neubauer método del compartimiento y resuspender en 1 x 10 6 células/mL en PBS, 0,1% BSA.
- Incubar las células con CFSE (5 μm, concentración final) por 20 min a 37 ° C. Añadir 5 mL incompleta los medios de comunicación e incubar (5 min, 4 ° C).
- Lave una vez con los medios de comunicación incompleta como se explica en 6.2.5. resuspender en 15 x 10 4 células/100 μl y continuar el ensayo de adherencia Co.
- Después del tratamiento de endotelio, lavar los pozos tres veces con los medios de comunicación incompleta. Añadir las células J774 CFSE (15 x 10 4 células/100 μL) a cada uno endotelial-cubierto bien. Incubar la placa por 10 min a 4 ° C seguido de 60 min a 37 ° C.
- Lave los pocillos suavemente, como se describe en 6.2.7., utilizando PBS precalentada e informar la adherencia J774 a la capa endotelial de los dos métodos siguientes:
- Lyse las células en 0.1 M Tris-HCl pH 8.8, SDS 1% (100 μL/pocillo) y medir la CFSE-J774 señal por fluorometría (excitación/emisión = 492 nm nm/517). Representan los resultados en unidades arbitrarias de intensidad de la fluorescencia o el porcentaje de adherencia con respecto al control positivo (señal de células totales añadidas a cada pocillo).
- Fijar las células en 4% PFA y el informe de la fijación de las células J774 CFSE al endotelio visualizando bajo un microscopio de fluorescencia (excitación/emisión = 492 nm nm/517).
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Representative Results
Evaluación de la activación de células endoteliales inducida por LPS por RT-qPCR
El suero de hambre LMCE-04 las células fueron estimuladas por 100 ng/mL de LPS durante 6 h, y la expresión de genes endoteliales se evaluó mediante RT-qPCR comparando la expresión de marcadores de activación a la condición de reposo. Como se muestra en la figura 1A, las células se incubaron LPS LMCE-04 indujeron la expresión de mRNA las moléculas de adhesión implicadas en el reclutamiento de leucocitos durante la respuesta inflamatoria (E-selectina, VCAM-1 y ICAM-1). PECAM-1 se utilizó como control interno, porque la expresión es sin cambios bajo este tratamiento experimental. Figura 1B representa la activación endotelial por LPS medido por la mayor expresión del mRNA de las citoquinas Ccl5, Cxcl10 y Cxcl1. Estas moléculas están implicadas en la activación de leucocitos, incluyendo su tráfico a la capa endotelial y posterior extravasación en el sitio de inflamación que circulan. La citocina, IL4, se utilizó como control interno bajo este tratamiento experimental.
Figura 1: evaluación de inducida por LPS endothelial células activación por RT-qPCR. El LMCE-04 las células fueron estimuladas con 100 ng/mL de LPS por 6 h (barras rojas) en comparación con el control (barras azules), y se analizó la expresión génica por RT-qPCR. Los gráficos muestran la doble inducción de mRNA con respecto a la condición de control seleccionado endotelial de moléculas de adhesión (A) y citoquinas (B) participan en la activación del leucocito y reclutamiento durante la respuesta inflamatoria. PECAM-1 y IL4 se utilizaron como controles negativos bajo esta condición. Los resultados se expresan como media ± SEM de un experimento, cada tres realizado, llevado a cabo por triplicado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Expresión de la proteína de las moléculas de adhesión en células endoteliales tratadas con LPS
Se realizó estimulación inflamatoria en las células de la LMCE-04 como se detalla en la sección anterior y la expresión de la proteína fue investigada por la técnica de western blot. El endotelio descanso presenta niveles casi imperceptibles de las moléculas de adhesión VCAM-1 y ICAM-1 (con-). En presencia de LPS (+), el fenotipo endotelial activado es evidente por el upregulation de la expresión de los marcadores descritos (figura 2). Las membranas fueron normalizadas por la detección de β-actina, que fue utilizada como control de carga para calcular la densidad relativa de la banda tras el análisis de densitometría.
Figura 2: expresión de la proteína de las moléculas de adhesión en células endoteliales tratadas con LPS. Inmunoblot representativos evaluación VCAM-1 e ICAM-1 expresión de la proteína en reposo (-) en comparación con tratados con LPS (+) las células LMCE-04. Se utilizó el β-actina como control de carga. El peso molecular de cada proteína está entre corchetes. Los valores representan la semi-cuantificación de densidad relativa de la banda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Marcadores de superficie endoteliales inflamación mediada por el LPS
La activación endotelial en el contexto inflamatorio se evaluó por citometría de flujo después de 6 horas-estimulación por LPS (100 ng/mL). En esta condición, se evaluó la detección de moléculas relacionadas con adhesivo en interacción de leucocitos. El panel izquierdo de la Figura 3A representa la expresión basal de los marcadores especificados en las células de LMCE-04 descanso (histograma rojo sólido) en comparación con el control negativo del isotipo (histograma de punteado de negro). El panel de la derecha de la Figura 3A muestra los resultados derivados del LMCE estimulado-04. El tratamiento de LPS significativamente upregulated la expresión de las moléculas de adhesión E-selectina, VCAM-1 y ICAM-1 en la membrana plasmática (histograma rojo sólido) en comparación con la condición de reposo (histograma de punteado de negro). Como se muestra en la citometría de perfiles y citado antes, la expresión de PECAM-1 es sin cambios en esta condición experimental. Figura 3B muestra los valores de cuantificación utilizados como referencias para evaluar posibles mediadores de la reacción inflamatoria endotelial. %: porcentaje de células positivas; IMF: significa intensidad de fluorescencia.
Figura 3: marcadores de superficie endoteliales inflamación mediada por el LPS. Flow cytometry perfiles de las moléculas de adhesión celular en reposo y estimulada por LPS LMCE-04. El panel de la izquierda muestra la expresión de la proteína en las células de reclinación (histograma de antígeno marcado de rojo) con respecto al control de isotipo emparejado (histograma de Ctrl-negro). El panel de la derecha compara la expresión de la proteína de superficie de la célula del control (histogramas negro) a las células endoteliales tratadas con LPS (histograma roja). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Vías de señalización desencadenadas por el estímulo de LPS en células endoteliales
Los mecanismos implicados en la activación del compartimiento vascular durante la inflamación son investigados mediante la evaluación de moléculas de señalización claves. Las células de la LMCE-04 estimuladas con LPS en diferentes períodos fueron procesadas para la extracción de proteínas y el grado de activación se analizó mediante la técnica de western blot. La figura 4 muestra que el represor de IκB-α de señalización de NF-κB es phosphorylated después de lo 15 min de incubación LPS y regresa a niveles basales después de 1 hora. Por otra parte, el LPS activa ERK 1/2 señalización después de 15 min, que establece un camino esencial en la activación endotelial durante la respuesta inflamatoria. Las membranas fueron normalizadas por β-actina o ERK 1/2 detección, que fueron utilizadas como los controles de carga para calcular la densidad relativa de la banda tras el análisis de densitometría.
Figura 4: señalización de vías provocadas por LPS en células endoteliales. Las LMCE-04 las células estimuladas con 100 ng/mL de LPS de los tiempos indicaron en la figura y las vías de señalización ERK 1/2 (P-ERK 1/2) y NF-kB (a través de la P-IκBα) fueron evaluadas por western blot. ERK 1/2 total y β-actina se utilizaron como controles en cada condición de carga. El peso molecular de cada proteína está entre corchetes. Los valores representan la semi-cuantificación de densidad relativa de la banda. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande deEsta figura.
Regulación del comportamiento de leucocitos por el endotelio estimulada con LPS
La importancia biológica de la regulación de la activación endotelial en la progresión de la reacción inflamatoria está determinada por ensayos funcionales de rendimiento del leucocito. Como se describe en la sección de protocolo, dos enfoques diferentes se incluyen pruebas de función leucocitaria regulada por las células endoteliales. Aunque los ensayos cuestionar diferentes aspectos de la respuesta inflamatoria (RT-qPCR para citocinas endoteliales liberados por la activación del leucocito y western blot para las moléculas de adhesión endotelial en la interacción de leucocitos), los datos obtenidos son tanto evaluación detalles microscópicos de adjunto del leucocito. La activación del leucocito endotelial factores solubles es esencial para el desarrollo de una eficiente respuesta inflamatoria, ya que favorece la adhesión celular a varios sustratos. Figura 5A muestra la adherencia de células J774 a 0.5 μg/mL fibronectina recubiertos pozos en respuesta a medios condicionados previamente recogidos desde el control o LPS trataron las células endoteliales. Las imágenes de campo claro y medidas espectrofotométricas indican que los factores liberados en los medios condicionados de endotelio tratados con LPS son suficientes para inducir eficiencia J774 activación, como se muestra por la inducción de la adhesión celular a fibronectina. Figura 5B representa un ensayo de adherencia Co para evaluar la capacidad de la capa vascular de adhesión del leucocito de la ayuda por la novedosa expresión de moléculas de adhesión endotelial. Brevemente, las culturas subconfluente hambreado del suero de las células de la LMCE-04 estimuladas con LPS durante 6 h se lavaron varias veces y co se incubaron con la línea del leucocito que j774 previamente marcados con la sonda fluorescente, CFSE. Como se muestra en las fotografías y las medidas spectrofluorometric, la estimulación LPS-vascular favorece la interacción de las células J774 CFSE a la monocapa endotelial.
Figura 5: interacción de leucocitos a la monocapa endotelial LPS incubados por ensayo de adherencia Co. (A) imágenes de microscopía de luz mostrando violeta cristal tinción de las células J774 a pozos de fibronectina revestido de 0,5 μg/mL en respuesta a medios condicionados desde el control o células endoteliales tratadas con LPS. Barra de escala 50 μm. El análisis espectrofotométrico que se muestra a continuación indican la medida de absorbancia expresada en unidades arbitrarias (a.u.) ± SEM de un experimento representativo en triplicado. Fluorescencia (B) las fotografías muestran al control o células tratadas con LPS LMCE-04 evaluadas por análisis de la adherencia a las células J774 CFSE. Barra de escala = 50 μm. El análisis fluorométrico que se muestra a continuación indica la intensidad de fluorescencia, expresada en unidades arbitrarias (a.u.) ± SEM de un experimento representativo en triplicado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Blanco | NCBI RefSeq ID | Adelante la secuencia (5´-3´) | Inversa (5´-3´) |
| GAPDH | NM_001289726.1 | LEY GTG GAT CGG CCC TCT GG3 | TGA CCT TGC CCA CAG CCT TG |
| 36B4 | NM_007475.5 | AGA TGC AGC AGA TCC GCA T | GTT CTT GCC CAG DE GATOS CAC C |
| Cxcl10 | NM_021274.2 | CAA AGC ATC CCG TTT CAC T | CCC CTT CTT GGT GAG GAA TA |
| Ccl5 | NM_013653.3 | TCT CTG CAG CTG CCC TCA CC | TCT TGA CAC CAC TTC TTC TC |
| Cxcl1 | NM_008176.3 | GGG AAG AAA TGC AAG CTG AA | CTG TAC AGC AGG GTC CTT GAC |
| IL1R2 | NM_010555.4 | AGT ACG ACG AGA CTC TGG TAC CTA | AGT TCC ACA GAC ATT TGC TCA CA |
| IL10 | NM_010548.2 | CTG GAC AAC ATA CTG CTA ACC G | GGG CAC CAT TTC CAG TAC GTA A |
| PECAM-1 | NM_008816.3 | CGA TGC GAT GGT GTA TAA CG | TGT CAC CTC CTT TTT GTC CAG |
| E-selectina | NM_011345.2 | ACG TGT GGA ATG ACG AGA GA | GTC AGG GTG TTC CTG TGG TT |
| VCAM-1 | NM_011693.3 | GGC TGA ACA CTT TTC CCA GA | CCG ATT TGA GCA ATC GTT TT |
| ICAM-1 | NM_010493.3 | CCG CTA CCA TCA CCG TGT A | GGC GGC TCA GTA TCT CCT C |
Tabla 1: Lista de los primers utilizados en este estudio.
| Descanso | LPS | |||
| % | MFI | % | MFI | |
| Ctrl | 1.79 | 3.5 | 0.55 | 3.48 |
| PECAM-1 | 37.52 | 12.09 | 37.82 | 12,24 |
| E-selectina | 17.12 | 8.06 | 88.13 | 49,84 |
| VCAM-1 | 53.08 | 20.51 | 99.30 | 204.05 |
| ICAM-1 | 99.76 | 114,81 | 99,82 | 363.89 |
Tabla 2: marcadores de superficie endoteliales inflamación mediada por el LPS. Cuantificación de la expresión de moléculas de adhesión celular en las células de LMCE-04 reposo y estimulados por LPS por análisis de citometría de flujo. Los valores representativos para cada marcador correspondiente al porcentaje de células positivas (%) y la intensidad de fluorescencia media (IFM) en las células endoteliales reposo y estimulados por LPS. PECAM-1 se utilizó como control negativo bajo estas condiciones experimentales.
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Discussion
Este protocolo endotelial describe una tecnología paso a paso que establece las bases para explorar nuevos mecanismos implicados en la regulación de la respuesta inflamatoria. Estos enfoques se basan en el estudio de la actividad endotelial estimulado por LPS y evaluar los pasos críticos involucrados en el reclutamiento de leucocitos durante la respuesta inflamatoria, específicamente: liberación de citoquinas endotelial, adhesión endotelial las moléculas expresión y leucocito adherencia a la capa vascular. Una vez que se establecen los parámetros endoteliales, el sistema puede buscar nuevos compuestos implicados en la regulación de la función endotelial y por lo tanto, la progresión inflamatoria. Los medicamentos reglamentarios pueden ser de interés para el mercado farmacéutico. La proyección principal de este protocolo secuencial es establecer una base para extender estos estudios a diferentes tipos endoteliales y condiciones estimulantes ajustando sus parámetros de actividad vascular relativa.
Medicamentos seleccionados por esta prueba constituirá a candidatos interesantes para el diseño de nuevas estrategias terapéuticas contra trastornos inflamatorios. Por un lado, los compuestos que favorecen la respuesta endotelial y contribuyan al reclutamiento leucocitario será promisorios para inmunodeficiencia condiciones16,17. Por el contrario, los inhibidores endoteliales constituye excelentes terapias para enfermedades inflamatorias crónicas10.
Caracterización de los cytokines expresados por el endotelio estimulado predice la evolución de la inflamación. Citoquinas son pequeñas proteínas liberadas por la capa endotelial en el contexto inflamatorio y regulan fuertemente el comportamiento del leucocito. Miembros pro-inflamatorias, como Ccl5, Cxcl10 y Cxcl1, unen a sus receptores específicos en la superficie del leucocito y la señal para inducir la interacción de leucocitos con las moléculas de adhesión recientemente expresada en la capa vascular (E-selectina, VCAM-1 y ICAM-1), y migración de leucocitos al área patológica (figura 1, figura 2, figura 3)8,10,18. Otros miembros de la misma familia de proteínas participan en la resolución de la inflamación y por lo tanto la reparación de los tejidos. La expresión de estas citoquinas antiinflamatorias es relevante para las enfermedades inflamatorias crónicas porque impiden el reclutamiento leucocitario y favorecen la inmunidad separación10,19,20. Para seleccionar los reguladores inflamatorios endoteliales posible, se recomienda realizar este análisis de la expresión de citocinas y evaluar la expresión de moléculas de adhesión endotelial en la presencia de los compuestos de interés. De hecho, analizar los niveles entre antiinflamatorias frente citoquinas proinflamatorias puede ser utilizado como un valor predictivo de progresión de la enfermedad y revela la droga de interés terapéutico21.
Los LPS vinculante a sus provocadores de receptor de superficie celular complejas cascadas de señales intracelulares liderados por MAP quinasas ERK 1/2, JNK y p38 y el NF-kB signalosome para inducir el programa transcripcional inflamatorio. Muchas de estas vías son comunes a otros estímulos inflamatorios como TNF-α o IL-110,22. La activación endotelial se determina mediante la detección de la forma fosforilada de los miembros de la cinasa del mapa como se muestra para ERK 1/2 en la figura 4. Por otra parte, la activación endotelial por LPS induce la actividad enzimática de la IKKβ complejo que fosforila y degrada el inhibidor de NF-kB complejo IκB, permitiendo así la miembros de efector de NF-kB de translocación nuclear para llevar a cabo la correspondiente actividad transcripcional (figura 4). Caracterizar los mecanismos por el cual el compuesto de drogas afecta a la respuesta inflamatoria endotelial es muy útil, no sólo en describir la droga, pero también en diseño de nuevos tratamientos inflamatorios en combinación con terapias convencionales compatibles 23.
Compuestos seleccionados a partir de los ensayos de cribado inflamatoria endotelial, debe ser más estudiado para confirmar su relevancia funcional en los pasos críticos de análisis de comportamiento del leucocito, como en última instancia, las células son responsables de los desordenes inflamatorios. Estas pruebas analizan la actividad leucocitaria en dos diferentes contextos experimentales. El primero es evaluar el papel de cytokines lanzado endotelial activación de leucocitos por análisis de adhesión mediada por integrinas. Las integrinas del leucocito son activadas por las citocinas endoteliales liberadas. Así, la capacidad adhesiva del leucocito a ligandos de integrinas es una medida representativa de leucocitos función8,10,18. La segunda es estudiar el papel de las moléculas de adhesión endotelial recientemente expresada en la interacción de leucocitos a la capa vascular por análisis de la adherencia. Las moléculas de adhesión endotelial expresadas en el contexto inflamatorio es esencial para el reclutamiento de leucocitos al tejido circundante. Por lo tanto, analizar los leucocitos interactuando con la monocapa de células endoteliales tratadas constituye un valor pronóstico para la progresión inflamatoria (figura 5)8,10,18. Los resultados derivados de estos planteamientos sugeriría que los compuestos seleccionados son candidatos serios en el diseño de estrategias futuras para el tratamiento de trastornos inflamatorios
La propuesta experimental definida aquí es una herramienta versátil para futuras aplicaciones debido a su capacidad de extrapolar a diferentes sistemas celulares o estimulantes. El procedimiento puede ser modificado al endotelio de diferentes orígenes o especies y para probar su funcionalidad en varias células inmunes, así como diferentes agentes inflamatorios como LPS, TNF-α, bacterias, virus, etcetera. Como se describe en el texto, los investigadores primero deben caracterizar la activación endotelial en su propio sistema para posteriormente caracterizar el papel de un compuesto seleccionado en la respuesta inflamatoria. Limitaciones del protocolo son la selección de un apropiado control negativo y definir precisamente los parámetros de la actividad endotelial que discernir la reclinación del estado estimulado. En caso de que las condiciones descritas en este artículo no funcionan por un sistema diferente, los investigadores deben solucionar los parámetros experimentales realizar ensayos adicionales de dependiente del tiempo y el uso de un gradiente de concentración del estímulo inflamatorio para definir una ventana estimulante que permite probar nuevos medicamentos para la regulación de la respuesta inflamatoria.
Para concluir, este protocolo inflamatoria endotelial se recomienda para la búsqueda de nEW endotelial los reguladores dirigidos a la respuesta inflamatoria. Realizar este procedimiento proporcionará novela, interesantes compuestos que pueden aplicarse a estudiar sus aplicaciones futuras y el diseño de innovadoras terapias vasculares específicos contra enfermedades inflamatorias, y que potencialmente podría ser de interés para el mercado farmacéutico.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) y el Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (número de licencia IERPY 1149/16 para A.L.; MPY 1410/09 para S. Hortelano); por el MINECO a través del Fondo de Investigación en Salud (FIS) (otorga números PI11.0036 y PI14.0055 a S. Hortelano). S. Herranz fue apoyada por IERPY 1149/16 del ISCIII.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| DMEM-F12 | Lonza | BE12-719F | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | A4503 | |
| Penicillin streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Trypsine | Lonza | BE17-160E | |
| EDTA | Sigma | ED2SS | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| Trizol | Sigma | T9424 | RNA extraction buffer |
| Isopropanol | Sigma | 33539 | |
| Ethanol absoluto | Panreac | 1,310,861,612 | |
| Pure H2O | Qiagen | 1017979 | RNAse free |
| Agarose | Pronadisa | 8020 | |
| Stain for agarose gels | Invitrogen | s33102 | |
| SuperScript III First-Strand Synth | Invitrogen | 18080051 | Reagents for RT-PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385610 | Fluorescent stain for qPCR |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well | Applied Biosystems | 4346906 | Plates for qPCR |
| U-bottom 96 well plates | Falcon | 353072 | |
| Cytometry tubes | Falcon | 352054 | |
| TX100 | Panreac | 212314 | Non-ionic surfactant |
| Tris-HCl | Panreac | 1,319,401,211 | |
| Sodium chloride | Merck | 1,064,041,000 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Sodium fluoride | Sigma | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | sigma | 13721-39-6 | |
| Protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | Reagents for bicinchoninic acid assay |
| β-mercaptoethanol | merck | 805,740 | |
| PVDF Transfer Membrane, 0.45 µm | Thermo Scientific | 88518 | |
| Tween-20 | Panreac | 1,623,121,611 | Polysorbate 20 |
| PBS | Lonza | BE17-515Q | |
| ECL | Millipore | WBKLS0500 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Collagen type I | Sigma | c8919 | |
| Acetic acid | Panreac | 1,310,081,611 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Panreac | 1,310,911,612 | |
| Crystal violet | Sigma | HT90132 | |
| Sodium citrate | Sigma | C7254 | |
| Ethanol 96% | Panreac | 1,410,851,212 | |
| CFSE | Sigma | 21888 | |
| RPMI | Lonza | BE12-115F | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Infinite M200 | Tecan | M200 | Multi mode microplate reader |
| Gel Doc 2000 | Bio-Rad | 2000 | Gel documentation system |
| StepOnePlus | Applied Biosystems | StepOnePlus | qPCR system |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | Analyzer 10 | Cytometry equipment |
| ChemiDoc MP | Bio-Rad | MP | Chemiluminescence detection system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| PECAM-1 | BD Biosciences | 553370 | Use at 10 µg/mL |
| ICAM-2 | Biolegend | 1054602 | Use at 10 µg/mL |
| E-selectin | BD Biosciences | 553749 | Use at 10 µg/mL |
| VCAM-1 | BD Biosciences | 553330 | Use at 10 µg/mL |
| ICAM-1 | Becton Dickinson | 553250 | Use at 10 µg/mL |
| anti-rat IgG-FITC | Jackson Immuno Research | 112-095-006 | Use at 10 µg/mL |
| anti armenian hamster-FITC | Jackson Immuno Research | 127-095-160 | Use at 10 µg/mL |
| Rat IgG isotyope control | Invitrogen | 10700 | Use at 10 µg/mL |
| Armenian hamster IgG isotype control | Invitrogen | PA5-33220 | Use at 10 µg/mL |
| P-IκΒ-α | Cell Signaling | 2859 | Use at 10 µg/mL |
| β-Actin | Sigma | A5441 | Use at 10 µg/mL |
| P-ERK | Cell Signaling | 9101 | Use at 10 µg/mL |
| anti-mouse HRP | GE Healthcare | LNXA931/AE | Use at 1:10,000 |
| anti-rabbit HRP | GE Healthcare | LNA934V/AG | Use at 1:10,000 |
| anti-rat HRP | Santa Cruz | Sc-3823 | Use at 1:10,000 |
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