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Methodenartikel

In-vitro- Polymerisation von F-Aktin auf frühen Endosomen

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DOI:

10.3791/55829

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28. August 2017

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1Department of Biochemistry, University of Geneva, 2Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Frühen Endosom Funktionen hängen F-Aktin-Polymerisation. Hier beschreiben wir einen Mikroskopie-basierte in-vitro- Assay, der Keimbildung und Polymerisation von F-Aktin auf frühen Endosomal Membranen in den Reagenzgläsern, wiederherstellt wodurch dieser komplexen Abfolge von Reaktionen zu biochemischen und genetischen Manipulationen.

Zusammenfassung

Viele frühen Endosom Funktionen, insbesondere Ladung Eiweiß Sortier- und Membran Verformung, kurz F-Aktin-Filamente kernhaltige auf Endosomal Membrane Flecken hängen. Wir haben festgestellt, einen Mikroskopie-basierte in-vitro- Assay, der Keimbildung und Polymerisation von F-Aktin auf frühen Endosomal Membranen in den Reagenzgläsern, wiederherstellt, wodurch dieser komplexen Abfolge von Reaktionen zu genetischen und biochemischen Manipulationen. Endosomal Fraktionen werden von float in Saccharose Steigungen aus Zellen, die mit dem Ausdruck der frühen Endosomal Protein GFP-RAB5 vorbereitet. Cytosolischen Brüche bereiten wir aus separaten Chargen von Zellen. Endosomal und cytosolischen Brüche können gespeichert werden in flüssigem Stickstoff eingefroren bei Bedarf. In dem Assay Endosomal und cytosolischen Brüche werden gemischt und die Mischung wird bei 37 ° C unter geeigneten Bedingungen (z. B. Ionenstärke, Verringerung der Umwelt) inkubiert. Zum gewünschten Zeitpunkt die Reaktionsmischung ist fest und die F-Aktin erschließt sich mit Phalloidin. Aktin Nukleation und Polymerisation werden dann durch Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Hier berichten wir, dass dieser Test verwendet werden, um die Rolle der Faktoren zu untersuchen, die entweder in Aktin Nukleation auf der Membran oder im nachfolgenden Dehnung, Verzweigungen oder Vernetzung von F-Aktin-Filamente beteiligt sind.

Einleitung

In höheren Eukaryoten Zellen sind Proteine und Lipide in frühen Endosomen verinnerlicht wo sortieren auftritt. Einige Proteine und Lipide, die dazu bestimmt sind, bespielt werden, werden in röhrenförmigen Regionen von den frühen Endosomen aufgenommen und dann transportiert die Plasmamembran oder die Trans-Golgi-Netzwerk (TGN)1,2. Im Gegensatz dazu sind andere Proteine und Lipide selektiv in Regionen von den frühen Endosomen verpackt, die ein multivesicular Erscheinungsbild aufweisen. Diese Regionen zu erweitern und nach Loslösung von frühen Endosomal Membranen, schließlich Reifen in freien Endosomal Träger Vesikel oder multivesicular Einrichtungen (ECV/MVBs), die verantwortlich sind für die Güterbeförderung in Richtung späten Endosomen1, 2.

Aktin spielt eine entscheidende Rolle in dem Umbau Membranverfahren Endosomal Sortierkapazität und Endosom Biogenese zugeordnet. Protein sortieren auf den recycling Bahnen um die Plasmamembran oder die TGN richtet sich nach der komplexen Retromer und die damit verbundenen Proteine. Diese Sortierung Maschinen scheint die Bildung von recycling Tubuli über Wechselwirkungen von komplexen, Retromer mit der Wespe und Narbe homolog (WASH) komplexen und verzweigten Aktin3,4,5 gekoppelt werden . Im Gegensatz dazu Moleküle bestimmt für Abbau, besonders Signalisierung Rezeptoren aktiviert, die Endosomal Sortierung komplexe erforderlich für Transport (ESCRT)2,6in Intraluminal Vesikel (ILVs) sortiert sind, 7. Während die mögliche Rolle von Actin in der ESCRT-abhängige Sortiervorgang nicht bekannt ist, spielt F-Aktin eine wichtige Rolle in der Biogenese der ECV/MVBs und Transport über frühen Endosomen. Vor allem fanden wir, dass annexin A2 bindet Cholesterin angereicherte Regionen der frühen Endosom und zusammen mit spire1, nucleates F-Aktin-Polymerisation. Die Bildung der verzweigten Aktin-Netzwerks auf Endosomen beobachtet erfordert die verzweigte Aktivität des Proteins Aktin-bezogene (ARP) 2/3 Komplex, sowie der ERM-Protein-Moesin und die Aktin-bindende Protein Cortactin8,9.

Hier beschreiben wir einen Mikroskopie-basierte in-vitro- Assay, der Keimbildung und Polymerisation von F-Aktin auf frühen Endosomal Membranen in den Reagenzgläsern wiederherstellt. Dieser Test hat früher zu untersuchen, die Rolle von annexin A2 in F-Aktin Nukleation und Moesin und Cortactin bei der Bildung der Endosomal Aktin Netze8,9. Mit diesem Protokoll in Vitro werden die komplexen Abfolge von Reaktionen auf Endosomen während Aktin-Polymerisation der biochemischen und molekularen Analyse der sequentielle Schritte des Prozesses, einschließlich Aktin Nukleation, lineare zugänglicher Polymerisation, Verzweigung und Vernetzung.

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Protokoll

1. Lösungen und Vorbereitungen

Hinweis: alle Puffer und Lösungen sollten bereit sein, in bidestilliertem (Dd) H 2 O. Da die Hydratation Zustand von Saccharose variiert, die Endkonzentration aller Saccharose-Lösungen muss ermittelt werden mit einem Refraktometer.

  1. Prepare Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung ohne zweiwertigen kationen (PBS-): 137 mM NAKI, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4 und 6,5 mM Na 2 HPO 4. Den pH-Wert 7,4 einstellen. Sterilisieren durch Autoklavieren (1 Zyklus bei 121 ° C für 15 min) und bei Raumtemperatur lagern.
  2. 300 mM Imidazol-Stammlösung vorbereiten: 0,204 g Imidazol in 10 mL DdH 2 O.Adjust der pH-Wert 7,4 bei 4 ° C mit HCl. Filter-Sterilisieren mit 0,22 μm pore Größe Filter und Lagerung bei 4 ° c
  3. Vorbereiten Homogenisierung Puffer (HB; vorbereiten ca. 100 mL): 250 mM Saccharose in 3 mM Imidazol. Anpassen des pH-Werts 7,4 bei 4 ° C mit einem pH-Meter. Filter-Sterilisieren mit einem 0,22 μm Pore Größe Filter und Lagerung bei 4 ° C. Ergänzung der HB kurz vor Gebrauch mit einem Cocktail von Protease-Inhibitoren bei Endkonzentrationen entspricht 10 mM Leupeptin, 1 mM Pepstatin A und 10 ng/mL Aprotinin.
  4. Für Schritt Floating Farbverläufe, vorbereiten, 62 %, 39 % und 35 % Saccharose-Lösungen in 3 mM Imidazol, pH 7,4, wie unten beschrieben. Genau zu bestimmen, die Endkonzentration aller Saccharose-Lösungen mit einem Refraktometer.
    1. Vorbereiten 100 mL 62 % Saccharoselösung in 3 mM Imidazol, pH 7.4. Auflösen von DdH 2 O 80,4 g Saccharose einrühren vorgewärmt, 35 ° C. Fügen Sie 1 mL 300 mM Imidazol-Stammlösung und Füllung zu 100 mL mit DdH 2 O. anpassen den pH-Wert 7,4 bei 4 ° c Filter-Sterilisieren mit 0,22 μm Pore Größe Filter und Speicher bei 4 ° c
    2. Bereiten 100 mL 35 % Saccharoselösung in 3 mM Imidazol, pH 7.4. Auflösen von 40,6 g Saccharose in DdH 2 O. Add 1 mL 300 mM Imidazol-Stammlösung rühren und füllen bis 100 mL mit DdH 2 O. anpassen den pH-Wert 7,4 4 ° C. Filter Sterilisieren mit 0,22 μm pore Größe Filter und Lagerung bei 4 ° c
    3. Bereiten 39 % Saccharose in 3 mM Imidazol, pH 7,4 50 mL. Verdünnen Sie die 62 % Saccharose-Lösung mit 35 % Saccharoselösung. Shop bei 4 ° c
  5. 3 g Paraformaldehyd (PFA) durch Rühren in 100 mL PBS-pre-warmed bis 60 ° C unter Zugabe von 1 M NaOH tropfenweise auflösen; den endgültige pH-Wert 7,4 mit NaOH einstellen. Filter-Sterilisieren mit einem 0,22-μm-Pore-Größe-Filter und Lagerung bei-20 ° c
    Achtung: 3 % PFA ist eine toxische Reagenzien.
  6. Bereiten Sie 1 M KCl-Stammlösung. 3,73 g KCl durch Rühren in 50 mL DdH 2 O. Filter-sterilisieren Sie einen 0,22-μm Pore Größe Filter verwenden und bei Raumtemperatur lagern.
  7. Vorbereiten 50 X konzentrierte Stammlösung mit 0,625 M Hepes bei pH 7,0 und 75 mM MgOAc 2 in DdH 2 O. Aliquot und Speicher bei-20 ° c
    8. Eindeckmedium
  8. vorbereiten. Durch Rühren 2,4 g Poly(vinyl alcohol) M w ~ 31.000 (PVA) mit 6 g Glycerin mischen. 6 mL DdH 2 O und lassen für mindestens 2 h bei Raumtemperatur. Fügen Sie 12 mL 0,2 M Tris-Cl (pH 8,5) und Hitze auf etwa 53 ° C mit gelegentlichen rühren, bis die PVA aufgelöst hat.
  9. Klären die Lösung durch Zentrifugation bei 5.000 X g für 20 min bei Raumtemperatur. Erfassen den Überstand und Hinzufügen von 2,5 % (w/V) 1,4 - Diazabicyclo-[2.2.2] Oktan (DABCO) Immunofluoreszenz bei Fluoreszenz-Erkennung zu verhindern. Wirbel für ca. 30 s, aufzulösen. Aliquoten in 1,5 mL-Kunststoff-Rohre und bei-20 ° c

2. Zellkultur

  1. Kultur HeLa-Zellen in Dulbecco ' s Modified Eagle Medium ergänzt mit 10 % fetalen Kälberserum, 10 % nicht-essentiellen Aminosäuren, 10 % L-Glutamin und 1 % Penicillin-Streptomycin. Pflegen sie bei 37 ° C in einem 5 % CO 2 Inkubator.
  2. Transfect Zellen 24 h vor dem Experiment mit GFP-RAB5 10, mit kommerziellen Transfection Reagens laut Hersteller ' Anweisungen s.
  3. Im Bedarfsfall bereiten Endosomal Brüche und Zytosol von Zellen eines Proteins von Interesse (z.B. Verwendung von RNAi oder CRISPR/Cas9) und/oder eine Wildtyp oder mutierte Form des Proteins des Interesses überexprimierenden erschöpft.

3. Endosomal Bruchteil Vorbereitung

Hinweis: dieses Protokoll beschreibt die direkte Vorbereitung der subzellularen Brüche mit Endosomen und anderen leichten Membranen. Bei Bedarf können gereinigtes Endosom Fraktionen auch gebrauchte 11 sein. Bereiten Sie 2 Petrischalen (10 cm Außendurchmesser; 57 cm 2) konfluierende Zellen GFP-RAB5 als Ausgangsmaterial zum Ausdruck zu bringen. Die Gesamtzahl der konfluierende HeLa-Zellen in 2 Petrischalen entspricht etwa 2,5 x 10 7 Zellen. Wenn nötig, die Endosomen auch zubereitet werden aus den Zellen eines Proteins von Interesse (z.B. Verwendung von RNAi oder CRISPR/Cas9) und/oder überexprimiert eine Wildtyp oder mutierte Form des Proteins des Interesses, immer Ausdruck GFP-RAB5 erschöpft.

Vorsicht: sollten alle Schritte des Protokolls Fraktionierung auf Ice durchgeführt werden

  1. Die Petrischalen auf eine nasse Metallplatte in eine flache Eiskübel und waschen Sie die Zellen zweimal mit 5 mL eiskaltem PBS-.
  2. Entfernen Sie alle PBS - aus dem letzten Waschen und 3 mL eiskaltem PBS-pro Schale. Zellen sollten nicht während der Behandlung trocken: bei Bedarf legen Sie den Eiskübel auf eine rockende Plattform, die Zellen mit Flüssigkeit ausreichend abdeckt.
  3. Mechanisch entfernen die Zellen mit PBS-Puffer aus die Petrischalen mit einem flexiblem Polizisten (d. h. hausgemachte Zelle Schaber). Kratzen Sie die Zellen aus der Gerichte zuerst in einer schnellen, kreisförmigen Bewegung um die Außenseite der Schale, gefolgt von einer Abwärtsbewegung in der Mitte der Schale. Schaben sanft zu " Blätter " der angeschlossenen Zellen. Sanft zu übertragen die Zellen mit einer Kunststoff Pasteurpipette mit einer weiten Öffnung, eine 15 mL konische Polypropylen Rohr auf Ice
  4. Zentrifuge für 5 min bei 175 X g und 4 ° C.
  5. Sanft entfernen den überstand (SN) und 1-3 mL HB zum Pellet. Mit einer Kunststoff Pasteurpipette mit einer weiten Öffnung sanft nach oben und unten einmal um die Zellen zu Aufschwemmen pipette.
  6. Zentrifuge für ca. 7-10 min bei 1.355 x g und 4 ° C. sanft entfernen die SN.
  7. Zelle Homogenisierung führen.
    Hinweis: Bedingungen sollen sanft damit die Plasmamembranen der Zellen gebrochen sind, aber die Endosomen intakt bleiben.
    1. Hinzufügen eines bekannten Volumens von HB mit Protease-Inhibitoren auf jede Zelle Pellet (ca. 100 μl pro Zelle Pellet). Pipette mit einer Mikropipette 1.000 µL, sanft nach oben und unten, bis die Zellen Nukleinsäuretablette sind. Tue nicht Luftblasen einzuführen.
    2. Vorbereitung eine 1-mL Tuberkulin-Spritze mit einer 22G Nadel vorher gespült mit HB und frei von Luft oder Luftblasen.
    3. Füllen Sie die Spritze mit der Zellsuspension relativ langsam (damit keine Luftblasen), legen Sie die abgeschrägte Spitze der Nadel an der Wand des Rohres und vertreiben die Zellsuspension schnell auf die Plasmamembranen der angeschlossenen Zellen zu scheren.
    4. Nehmen Sie eine kleine aliquoten Homogenat (ca. 3 µL) und in 50 µL HB auf einen Objektträger zu verdünnen. Mischen und mit einem Glas Deckgläschen abdecken. Homogenat unter dem Phasenkontrast-Mikroskop verfügt über einen 20 X oder 40 X Objektiv zu inspizieren.
      Hinweis: Unter optimalen Bedingungen, die meisten Zellen sind gebrochen, aber Kerne, die als dunkelgrau erscheinen und Runde Strukturen, sind nicht ( Abbildung 1).
    5. Wiederholen Sie Schritt 3.7.3 und 3.7.4 bis die meisten Zellen sind gebrochen; in der Regel 3-6 wechselvollen Striche durch die Nadel notwendig sind. Halten Sie eine kleine aliquoten (10-30 µL) von Homogenat zur Proteinbestimmung.
  8. Zentrifuge Homogenat für 7 min bei 1.355 x g und 4 ° c
    Hinweis: nach der Zentrifugierung, das Pellet (definiert als die nuklearen Pellet; NP) enthält die Kerne und der Überstand (definiert als die postnukleare überstand; PNS) enthält die Zellflüssigkeit und die Organellen auf Homogenisierung und frei schwebend veröffentlicht.
  9. Sammeln sorgfältig die PNS. Halten Sie kleine aliquoten (10-30 µL) des PNS und NP zur Proteinbestimmung und entsorgen Sie die NP.
  10. Einstellen der PNS 40,6 % Saccharose durch das Verdünnen der 62 % Saccharose-Lösung mit PNS 1:1.1 Verhältnis von PNS:62 % Saccharose. Mischen Sie sanft aber gründlich, ohne Luftblasen zu erstellen. Überprüfen Sie die Saccharose-Konzentration mit dem Refraktometer.
  11. Ort der PNS bei 40,6 % Saccharose am unteren Rand eine Ultrazentrifugation Rohr. Sorgfältig mit 2,5 mL 35 % Saccharoselösung überlagern und füllen die Zentrifugenröhrchen mit HB.
    Hinweis: Die Saccharose-Lösungen sollten geschichtet werden, so dass Schnittstellen deutlich sichtbar sind.
  12. Ultrazentrifuge Gradienten für 1 h bei ̴165, 000 X g und 4 ° c
  13. Entfernen Sie vorsichtig die weiße Schicht von Lipiden auf den Farbverlauf. Sammeln Sie als nächstes die Schnittstelle mit Endosomen zwischen HB und 35 % Saccharose, mit einer 200 μL Mikropipette mit Cut Spitze.
    Hinweis: Die Endosomal Brüche können direkt in die in-vitro- Actin Polymerisierung Assay verwendet werden oder kann regelmÄÑig auf dem Eis, Blitz in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-80 gelagert ° C.
  14. Bestimmen die Proteinkonzentration der PNS und Endosomal Brüche.
    Hinweis: Diese Konzentration sollte mindestens 100 µg/mL. Ca. 2,5 x 10 7 Zellen in 2 Petrischalen gewachsen sind notwendig, um ein PNS mit mindestens 100 µg/mL zu erhalten (siehe Hinweis oben).

4. Zytosol Vorbereitung

Hinweis: bereiten Sie 2 Petrischalen (10 cm Durchmesser; 57 cm 2) konfluierende HeLa-Zellen als Ausgangsmaterial. Bei Bedarf kann die Zellflüssigkeit auch aus Zellen eines Proteins von Interesse (z.B. Verwendung von RNAi oder CRISPR/Cas9) und/oder überexprimiert ein Wildtyp oder die mutierte Form des Proteins des Interesses erschöpft vorbereitet werden. Für das Endosom Fraktionierung Protokoll sollten alle Schritte durchgeführt werden, auf Ice

  1. Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.8.
  2. Legen Sie die PNS in ein Zentrifugenröhrchen und Ultrazentrifugen für 45 min bei ̴250, 000 X g und 4 ° c
  3. Sorgfältig entfernen Sie die weiße Schicht an der Spitze und die SN (Zytosol Bruch) zu sammeln, ohne störende Microsome Pellet. Halten Sie ein Aliquot der Zellflüssigkeit Fraktion zur Proteinbestimmung.
    Hinweis: Die Zellflüssigkeit kann direkt in die in-vitro- Actin Polymerisierung Assay verwendet werden oder kann regelmÄÑig auf dem Eis, Blitz in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-80 gelagert ° C.
  4. Bestimmen die Konzentration des Proteins von dem Zytosol.
    Hinweis: Es sollte mindestens 3 mg/mL.

5. Measuring Endosom-abhängige Aktin-Polymerisation In Vitro Assay

Hinweis: Endosom-abhängige Aktin-Polymerisation kann mit zwei alternative Vorgehensweisen durchgeführt werden. Bei dem ersten Ansatz werden die Materialien gemischt in einem Reagenzglas, fixiert, und auf einem Deckgläschen übertragen und analysiert. Im zweiten Ansatz, der hier beschrieben wird kann der Test direkt in der bildgebenden Kammer durchgeführt werden und können behoben und analysiert werden ohne mechanische Störung ( Abbildung 2). In diesem zweiten Ansatz die Assay-Mischung ist nicht aus einem Reagenzglas auf einem Deckgläschen übertragen und somit bleibt unbeirrt, verringert die Gefahr von F-Aktin-Netzwerken wird physisch während der Übertragung gestört. Darüber hinaus ist der zweite Ansatz kompatibel mit einer Zeitraffer-Analyse der F-Aktin-Polymerisation. Es sei darauf hingewiesen, dass kein Unterschied in der Analyse von F-Aktin-Polymerisation mit beiden Ansätzen beobachtet wurde.
Hinweis: Verwendung schneiden Tipps im gesamten Protokoll.

  1. In einem Reagenzglas
    1. sanft Mischung eiskalte gereinigten GFP-RAB5 Endosomen (Schritt 3) mit Zytosol (Schritt 4) in einem Verhältnis von 01:10 (Proteinkonzentration) in eine eiskalte 1,5 mL konische Röhrchen.
      Hinweis: Ein typisches Experiment erfolgt mit ca. 40-50 µL.
    2. Stellen Sie das eiskalte Reaktionsgemisch zu Endkonzentrationen von 125 mM KCl (mit 1 M KCl Vorratslösung), 12,5 mM Hepes und 1,5 mM MgOAc 2 (mit den 50 x Stammlösung). Passen Sie dann die Mischung mit Protease-Inhibitoren, Endkonzentrationen von 10 mM Leupeptin, 1 mM Pepstatin A und 10 ng/mL Aprotinin. Vorsichtig mischen aller Komponenten.
    3. Legen Sie das Reagenzglas mit der Reaktionsmischung bei 37 ° C, ohne Zittern, und die gewünschte Zeit inkubieren.
      Hinweis: In der Regel dauert es ca. 3 min, Aktin-Polymerisation Endosomen und 30 min für die Bildung eines umfassenden Netzwerks erkennen.
    4. Zum gewünschten Zeitpunkt (z.B. 3 min oder 30 min), die Reaktion zu stoppen, indem man das Reagenzglas auf Eis und fügen Sie 1/10 (Vol:vol) der vorgekühlte 3 % PFA Lösung.
    5. 0.3:10 (Vol:vol) von 200 Einheiten/mL (~6.6 μM) Phalloidin konjugiert, rot-Orange Färbung der polymerisierte Actin Fleck hinzufügen.
    6. Ort 12 μL der Mischung auf 12 μL PVA Eindeckmedium auf einem Mikro Objektträger. Setzen Sie ein 18 x 18 mm 2 Coverslipon Glasplatte.
    7. Analyse die Probe mit der konfokalen Mikroskopie.
  2. In der bildgebenden Kammer
    1. um mikroskopische Bildgebung Kammern, verwenden Plasma Reiniger für 1 min zu einem Deckgläschen rund 18 mm Durchmesser und rund 35 mm Durchmesser Petrischale, ausgestattet mit einem 20 mm Glasboden reinigen (0,16 0,19 mm).
    2. Inkubieren Sie die gereinigten Oberflächen mit 1 % β-Casein für 20 min, Proteinbindung, das Glas zu minimieren. Waschen zweimal mit 3 mM Imidazol.
    3. Add Endosom und Zytosol, in der gleichen Mischung wie in den Schritten 5.1.1 und 5.1.2, in eine vorgekühlte 1,5 mL Teströhrchen assay und ergänzen die Assay-Mischung mit 0,1 μg/μL Rhodamin-Aktin.
    4. Einstellen der endgültigen Brechungsindex des Gemisches auf 1,375 (26,5 % Saccharose) mit 39 % Saccharoselösung.
      Hinweis: In der Regel wird das gleiche Volumen hinzugefügt; Dies muss jedoch werden empirisch nachjustiert, abhängig von der Saccharose-Konzentration von der gesammelten Bruch, anhand einer Refractometer, da die Saccharose-Konzentration von Experiment zu Experiment leicht ändern kann.
    5. Legen Sie die Mischung auf die vorbehandelte 35-mm-Schale (Schritt 5.2.1) und bedecken Sie es mit der vorbehandelten 18 mm Deckglas (Schritt 5.2.1).
    6. Legen Sie die Kammer bei 37 ° C ohne schütteln.
    7. Analyse der Probe mittels konfokale Fluoreszenzmikroskopie.

6. Bild-AcFassung und Analyse von Aktin Netzwerk

  1. Bildaufnahme
    1. erwerben die Bilder auf einem inversen Scan confocal Mikroskop.
      Hinweis: Erwerb Bildeinstellungen wurden für eine invertierte Scan confocal Mikroskop mit einem 63 X 1,25 NA Öl Ziel optimiert. Passen Sie die Leistung des Lasers (in der Regel ca. 50 %), ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen.
  2. Quantifizierung des Aktin-Netzwerks
    1. fluoreszierenden Mikrographen zu analysieren. Die Opensource-Software CellProfiler (v2.1.1) 12 verwenden, um die Menge an Aktin pro Endosom messen (alternative Software kann verwendet werden).
      1. Ermitteln Sie zuerst Endosomen als das primäre Objekt mit der GFP-RAB5-Signal. Dann die F-Aktin verbunden mit individuellen Endosomen mit der Ausbreitung der Aktin-Signals zu quantifizieren (rot-Orange Farbstoff konjugiert Phalloidin) als sekundäre Objekt.
      2. Durchschnittliche und normalisieren die Nummer des zugehörigen Materials für jedes Objekt in der Kontrollbedingung.

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Ergebnisse

Um Einblicke in die Entstehung von F-Aktin-Patches auf frühen Endosom Membranen, folgten wir das Protokoll gemäß Abbildung 2. Kurz, Zellen wurden mit GFP-RAB5 transfiziert und dann frühen Endosomen von subzellulären Fraktionierung vorbereitet wurden. Diese gereinigten frühen Endosomen wurden mit Zytosol inkubiert, um Aktin sowie andere Faktoren, die möglicherweise in der Reaktion zur Verfügung zu stellen. Am Ende der Inkubationszeit war die Reaktion durch Fix...

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Diskussion

Aktin spielt eine entscheidende Rolle im Endosom Membran Dynamik4,14. Wir berichteten bereits, dass Aktin Nukleation und Polymerisation auf frühen Endosomen auftreten bilden kleine F-Aktin Patches oder Netzwerke. Diese F-Aktin-Netzwerke sind absolut erforderlich für Membrantransport über frühen Endosomen den Abbau Weg. Eingriffe bei jedem Schritt dieses Prozesses Keimbildung und Polymerisation verhindert Endosom Reifung und somit nachgelagerten Transport zur spät...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Danksagungen

Von der Swiss National Science Foundation unterstützt wurde; Das Schweizer Sinergia-Programm; die polnisch-schweizerischen Forschungsprogramm (PSPB-094/2010); die NFS in der chemischen Biologie; und LipidX von der Schweizer SystemsX.ch Initiative, durch den Schweizerischen Nationalfonds (, J. G.) ausgewertet. O. M. wurde durch eine EMBO langfristige Fellowship (ALTF-516-2012) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
NaClSigma-Aldrich71380
KClAcros Organics196770010
KH2PO4AppliChemA1042
Na2HPO4Acros Organics424370025
HepesAppliChemA3724
Magnesiunacetat-TetrahydratFluka63047
Dithiothreitol (DTT)AppliChemA2948
ImidazolSigma-Aldrich10125
NaOHFluka71690
SaccharoseMerck Millipore107687
LeupeptinRoche11017101001
PepstatinRoche10253286001
AprotininRoche10236624001
ParaformaldehidePolysciences. Inc380
Alexa Fluor 555 PhalloidinMolekulare SondenA34055
Aktin RhodaminZytoskelett. IncAPHR-A
Mowiol 4-88Sigma-Aldrich81381Poly(vinylalkohol), Mw ~31 000
DABCOSigma-AldrichD-2522
Tris-HClAppliChemA1086
β-CaseinSigma-AldrichC6905
Filter 0,22 μ mMillexSL6V033RS
Runde 10 cm Schalen für die ZellkulturThermo Fisher Scientific150350
Kunststoff-PasteurpipetteAssistent569/3 40569003
15-mL Polypropylen-RöhrchenTPP91015
Injektionsnadel 22G Schwarz 30mmBD Microlance300900
Sterile Luer-Slip 1mL Spritzen ohne NadelBD Plastipak300013
Mikroglas-ObjektträgerAssistent2406
18 x 18 mm GlasdeckglasAssistent1000/1818
SW60 ZentrifugenröhrchenBeckman-Schar344062
TLS-55 ZentrifugenröhrchenBeckman-Schar343778
200-μ L gelbe SpitzeStarlabS1111-0706
1.000-μ L Blue Graduierte SpitzeStarlabS1111-6801
1,5-ml-ReagenzglasAxygenMCT-175-C 311-04-051
Rundes Deckglas mit 18 mm DurchmesserAssistent1001/18
Runde Schale mit 35 mm Durchmesser und 20 mm Glasboden (0,16 - 0,19 mm)In vitro ScientificD35-20-1,5-N
RefraktometerCarl Zeiss79729
PlasmareinigerHarrick PlasmaPDC-32G
Sorvall WX80 UltrazentrifugeThermo Fisher Scientific46900
Tisch-UltrazentrifugeBeckman-ScharTL-100
SW60 RotorBeckman-Schar335649
TLS-55Rotor Beckman-Schar346936
KonfokalmikroskopieCarl ZeissLSM-780
Fugene HD TransfektionsreagenzPromegaE2311
Proteinassay-Reagenz ABio-Rad500-0113
Proteinassay-Reagenz BBio-Rad500-0114
Proteinassay-Reagenz SBio-Rad500-0115
ZellschaberHausgemachtSilikonkautschukstück von ca. 2 cm, in einem sehr spitzen Winkel geschnitten und an einer Metallstange befestigt oder mit einer Pinzette gehalten
RefraktometerCarl Zeiss
Minimum Essential Medium Eagle (MEM)Sigma-AldrichM0643
FCSThermo Fisher Scientific10270-106
MEM Nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA)Thermo Fisher Scientific11140-035
L-GlutaminThermo Fisher Scientific25030-024
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific15140-122
pH-Messgerät 691Metrohm
ImageJ SoftwareNIH, Bethesda MD

Referenzen

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  2. Scott, C. C., Vacca, F., Gruenberg, J. Endosome Maturation, Transport and Functions. Semin. Cell Dev Biol. 31, 2-10 (2014).
  3. Puthenveedu, M. A., et al. Sequence-dependent sorting of recycling proteins by actin-stabilized endosomal microdomains. Cell. 143 (5), 761-773 (2010).
  4. Seaman, M. N., Gautreau, A., Billadeau, D. D. Retromer-mediated endosomal protein sorting: all WASHed up! Trends Cell Biol. 23 (11), 522-528 (2013).
  5. Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (2), a016774(2014).
  6. Woodman, P. G., Futter, C. E. Multivesicular bodies: co-ordinated progression to maturity. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 408-414 (2008).
  7. Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Emr, S. D. The ESCRT pathway. Dev Cell. 21 (1), 77-91 (2011).
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