In-vitro- Biolumineszenz-Assay zirkadianen Rhythmus in Mamma Epithelzellen zu charakterisieren

Mingzhu Fang; Hwan-Goo Kang; Youngil Park; Brian Estrella; Helmut Zarbl

doi:10.3791/55832

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Methodenartikel

In-vitro- Biolumineszenz-Assay zirkadianen Rhythmus in Mamma Epithelzellen zu charakterisieren

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DOI:

10.3791/55832

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28. September 2017

Mingzhu Fang¹ , Hwan-Goo Kang² , Youngil Park² , Brian Estrella¹ , Helmut Zarbl¹

¹Department of Environmental and Occupational Health, School of Public Health, NIEHS Center for Environmental Exposures and Disease, Environmental and Occupational Health Sciences Institute, Rutgers University, ²Veterinary Drugs & Biologics Division, Animal and Plant Quarantine Agency

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ein in-vitro- Biolumineszenz-Assay zellulären zirkadianen Rhythmus in Mamma Epithelzellen bestimmen wird vorgestellt. Diese Methode nutzt Säugerzelle Reporter Plasmide destabilisierte Luciferase unter der Kontrolle des Veranstalters Periode 2 gen zum Ausdruck zu bringen. Es kann zu anderen Zelltypen auszuwertende Organ-spezifischen Auswirkungen auf die zirkadianen Rhythmus angepasst werden.

Zusammenfassung

Zirkadianen Rhythmus ist ein grundlegender physiologischer Prozess in allen Organismen vorhanden, der biologischen Prozesse von Genexpression Verhalten schlafen regelt. Bei Wirbeltieren ist ein molekularer Oszillator funktioniert in den suprachiasmatischen Kern (SCN; zentrale Herzschrittmacher) und einzelne Zellen bestehend aus den peripheren Geweben, zirkadianen Rhythmus gesteuert. Noch wichtiger ist die Störungen des zirkadianen Rhythmus durch die Einwirkung von Licht in der Nacht, Umweltstressfaktoren und/oder Giftstoffe mit erhöhten Risiko von chronischen Krankheiten und Alterung. Die Fähigkeit zur Identifizierung von Agenten, die zentralen und/oder peripheren biologischen Uhren stören können und -Agenten, die verhindern können oder zur Abmilderung der Auswirkungen von circadian Disruption, hat erhebliche Auswirkungen auf die Prävention von chronischen Krankheiten. Obwohl Nager-Modelle verwendet werden können, Belichtungszeiten und Agenten, die zu induzieren oder zu verhindern/mindern zirkadiane Störungen zu identifizieren, eine diese Experimente große Anzahl von Tieren. Auch in Vivo Studien erfordern erhebliche Ressourcen und Infrastruktur und benötigen Forscher eine ganze Nacht. So gibt es eine dringende Notwendigkeit für einen Zelltyp geeignete in-vitro- System zum Bildschirm für ökologische circadiane Disruptoren und Geschmacksverstärker in Zelltypen aus verschiedenen Organen und Krankheitszustände. Wir konstruierten einen Vektor, der Transkription von destabilisiert Luciferase in eukaryontischen Zellen unter der Kontrolle des menschlichen Periode 2 gen Veranstalters antreibt. Dieses Konstrukt circadiane Reporter war stabil transfizierten in menschlichen Mamma Epithelzellen und circadiane reagieren Reporter Zellen wurden ausgewählt, um die in-vitro- Biolumineszenz-Assay zu entwickeln. Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zu entwickeln und überprüfen den Assay. Wir bieten weitere Details für den Nachweis der Konzept-Experimenten demonstriert die Fähigkeit unsere in-vitro- Tests, die in Vivo Effekte verschiedener Chemikalien auf die zelluläre biologische Uhr rekapitulieren. Die Ergebnisse zeigen, dass der Test an einer Vielzahl von Zelltypen für ökologische Disruptoren und chemopräventiven Enhancer zirkadiane Uhren auf den Bildschirm angepasst werden kann.

Einleitung

Der circadiane Uhr regelt eine Vielzahl biologischer Prozesse von tagaktive Expression von Genen zu Verhalten in einem vorhersehbaren Rhythmus schlafen mit einer Periodizität von ca. 24 Std. epidemiologische Studien empfehlen, dass chronische Störungen des zirkadianen Rhythmus erhöht das Risiko von Brust- und Prostatakrebs in Schichtarbeiter, einschließlich Krankenschwestern und Flight Crews¹^,²^,³. Diese Erkenntnisse sind von Nagetier Studien, die zeigen, dass die Exposition gegenüber konstantes Licht, Licht in der Nacht, oder leichte Zyklen, die Erhöhung der Jetlag Tumor-Inzi....