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Methodenartikel

In-vitro- Biolumineszenz-Assay zirkadianen Rhythmus in Mamma Epithelzellen zu charakterisieren

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DOI:

10.3791/55832

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28. September 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Environmental and Occupational Health, School of Public Health, NIEHS Center for Environmental Exposures and Disease, Environmental and Occupational Health Sciences Institute, Rutgers University, 2Veterinary Drugs & Biologics Division, Animal and Plant Quarantine Agency

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ein in-vitro- Biolumineszenz-Assay zellulären zirkadianen Rhythmus in Mamma Epithelzellen bestimmen wird vorgestellt. Diese Methode nutzt Säugerzelle Reporter Plasmide destabilisierte Luciferase unter der Kontrolle des Veranstalters Periode 2 gen zum Ausdruck zu bringen. Es kann zu anderen Zelltypen auszuwertende Organ-spezifischen Auswirkungen auf die zirkadianen Rhythmus angepasst werden.

Zusammenfassung

Zirkadianen Rhythmus ist ein grundlegender physiologischer Prozess in allen Organismen vorhanden, der biologischen Prozesse von Genexpression Verhalten schlafen regelt. Bei Wirbeltieren ist ein molekularer Oszillator funktioniert in den suprachiasmatischen Kern (SCN; zentrale Herzschrittmacher) und einzelne Zellen bestehend aus den peripheren Geweben, zirkadianen Rhythmus gesteuert. Noch wichtiger ist die Störungen des zirkadianen Rhythmus durch die Einwirkung von Licht in der Nacht, Umweltstressfaktoren und/oder Giftstoffe mit erhöhten Risiko von chronischen Krankheiten und Alterung. Die Fähigkeit zur Identifizierung von Agenten, die zentralen und/oder peripheren biologischen Uhren stören können und -Agenten, die verhindern können oder zur Abmilderung der Auswirkungen von circadian Disruption, hat erhebliche Auswirkungen auf die Prävention von chronischen Krankheiten. Obwohl Nager-Modelle verwendet werden können, Belichtungszeiten und Agenten, die zu induzieren oder zu verhindern/mindern zirkadiane Störungen zu identifizieren, eine diese Experimente große Anzahl von Tieren. Auch in Vivo Studien erfordern erhebliche Ressourcen und Infrastruktur und benötigen Forscher eine ganze Nacht. So gibt es eine dringende Notwendigkeit für einen Zelltyp geeignete in-vitro- System zum Bildschirm für ökologische circadiane Disruptoren und Geschmacksverstärker in Zelltypen aus verschiedenen Organen und Krankheitszustände. Wir konstruierten einen Vektor, der Transkription von destabilisiert Luciferase in eukaryontischen Zellen unter der Kontrolle des menschlichen Periode 2 gen Veranstalters antreibt. Dieses Konstrukt circadiane Reporter war stabil transfizierten in menschlichen Mamma Epithelzellen und circadiane reagieren Reporter Zellen wurden ausgewählt, um die in-vitro- Biolumineszenz-Assay zu entwickeln. Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zu entwickeln und überprüfen den Assay. Wir bieten weitere Details für den Nachweis der Konzept-Experimenten demonstriert die Fähigkeit unsere in-vitro- Tests, die in Vivo Effekte verschiedener Chemikalien auf die zelluläre biologische Uhr rekapitulieren. Die Ergebnisse zeigen, dass der Test an einer Vielzahl von Zelltypen für ökologische Disruptoren und chemopräventiven Enhancer zirkadiane Uhren auf den Bildschirm angepasst werden kann.

Einleitung

Der circadiane Uhr regelt eine Vielzahl biologischer Prozesse von tagaktive Expression von Genen zu Verhalten in einem vorhersehbaren Rhythmus schlafen mit einer Periodizität von ca. 24 Std. epidemiologische Studien empfehlen, dass chronische Störungen des zirkadianen Rhythmus erhöht das Risiko von Brust- und Prostatakrebs in Schichtarbeiter, einschließlich Krankenschwestern und Flight Crews1,2,3. Diese Erkenntnisse sind von Nagetier Studien, die zeigen, dass die Exposition gegenüber konstantes Licht, Licht in der Nacht, oder leichte Zyklen, die Erhöhung der Jetlag Tumor-Inzidenz zu imitieren und beschleunigt Tumor Wachstum4,5bestätigt. Basierend auf Daten aus menschlichen und Nagetier Studien, der International Agency for Research on Cancer Schichtarbeit als eine wahrscheinliche menschliches Karzinogen (Typ 2A) in 20106eingestuft.

Zuvor, wir gezeigt, dass eine krebserregende Einzeldosis von Milch-Tumor spezifischen Karzinogen, N- Nitroso-N- Methylurea (NMU), gestört den zirkadianen Ausdruck der großen zirkadiane Gene (CGs) (z.B., Periode 2 , Per2) und mehrere circadiane gesteuert Gene (KVG), einschließlich der wichtigsten DNA-Schäden reagieren und reparieren (DDRR) Gene in der Ziel-Brustdrüse (aber nicht in der Leber). Darüber hinaus Zurücksetzen des zirkadianen Ausdrucks Per2 und Dislozieren Gene in die normale Richtung durch ein chemopräventiver Regime von diätetischen L-Methyl-Selenocystein (MSC) reduziert die Häufigkeit des Tumors um 63 %. Diese Erkenntnisse waren die ersten, die eine mechanische Verbindung zwischen zirkadianen Rhythmus, chemische Karzinogenese und Chemoprävention7,8. Forderungen an andere Umweltgifte gezeigt, circadiane gen Ausdruck in Vivo zu stören sind auch verbunden mit einem erhöhten Risiko von Umweltkrankheiten9,10. Das Verständnis der Mechanismen, die zirkadiane Störungen durch Umweltgifte und Pathogenese verbinden kann zu mechanistisch-basierte Ansätze zur Prävention von Krankheiten führen. Jedoch Studien zur Festlegung der Interaktionen zwischen den Aufnahmen und circadianen Rhythmus erfolgen in der Regel in-vivo. Eine typische in Vivo Experiment untersucht die Auswirkungen auf die zirkadianen Rhythmus große Zahl von Tieren, erfordert, wie Steuern, Gewebe aus mindestens drei und drei exponierten Tiere gesammelt alle 3-4 Std. über einen Zeitraum von 24 oder 48 h. Entwicklung eines validierte in-vitro- System, das in Vivo Beobachtungen und Mechanismen rekapituliert würde daher nicht nur die Zahl der Tiere, aber auch dramatisch experimentelle Kosten zu senken und die Anforderung, die Forscher arbeiten kontinuierlich über einen Zeitraum von 24-48 h. Darüber hinaus könnte eine validierte in-Vitro -System verwendet werden, für Hochdurchsatz-Screening von Verbindungen und/oder genetische Veränderung, die zirkadianen Rhythmus oder seine Reaktion auf ökologische Stressoren oder Giftstoffe beeinträchtigen. Deshalb die strategische Kombination von in Vitro und in Vivo Modelle und Experimente sind erforderlich, um verschiedene Einblicke mit unterschiedlichem Fokus zu erhalten.

Bei Säugetieren existieren circadiane Oszillatoren nicht nur in spezialisierten Neuronen des SCN, sondern auch in äußerster Randlage Zelltypen. Diese molekulare Taktgeber sind ähnlich denen in etablierten Fibroblasten-Zell-Linien und primäre Fibroblasten aus Embryonen oder ausgewachsene Tiere; Allerdings gibt es eine Notwendigkeit für Gewebe-spezifischen Zellmodellen11. Infolgedessen traditionelle Studien des Bewegungsapparates Aktivität in Vivo, SCN explants ex Vivound Zell-basierte in-vitro- Tests in verewigt Fibroblastenzellen sind weit verbreitet, Zelle-autonome circadiane Mängel zu studieren. Allerdings gibt es keine Hinweise darauf, dass eine in-vitro- Fibroblasten zellbasierte Assays circadiane Mechanismen Zusammenfassen kann und Antworten in Zellen von anderen peripheren Organe in Vivovorhanden. Verschiedene Zelltypen können unterschiedliche Muster der Genexpression, Xenobiotika Stoffwechsel und Dislozieren, und die Verbindungen zwischen Toxizität und circadiane Genexpression möglicherweise Zelltyp spezifische und/oder durch verschiedene physiologische Parameter moduliert. Darüber hinaus wurden circadiane Oszillatoren in Fibroblasten-basierten Systemen nicht vollständig bewertet für Reaktionen auf Umweltgifte, Stressoren und präventive Agenten, die Aufnahmen auf Mechanismen der Krankheitsentstehung und Prävention zu verbinden. So gibt es eine Notwendigkeit für facile, validierten Zelltyp-spezifische, in-vitro- Biolumineszenz-Assays, Organ spezifischen ökologischen circadiane Disruptoren zu studieren. Obwohl eine Vielzahl von zellulären Uhrenmodelle (z. B.in Leber, Keratinozyten, sowie Fettzellen und ein Osteosarkom-Zelllinie) haben worden in den letzten Jahren12,13,14, entwickelt 15, der hier beschriebenen Test ist das erste Handy Uhr Modell in Brust Epithelzellen und die erste Demonstration in Vivo Antworten auf ökologische Stressoren, Giftstoffe, Medikamente und chemopräventiven Agenten zu rekapitulieren.

Renilla-Luciferase (rLuc) und Firefly Luciferase sind 30-61 kDa Monomere Proteine, die erfordern keine posttranslationale Verarbeitung für enzymatische Aktivität und als genetische Reporter unmittelbar nach Übersetzung funktionieren können. Sobald das Substrat des Enzyms Luciferase zuordnet, erzeugt die biochemische Reaktion katalysiert einen Lichtblitz. Somit sind die Luciferase Konstrukte als gen Ausdruck Reporter System in Vitro und in Vivoverbreitet. Im zirkadianen Rhythmus-Studien, das Dienstprogramm der Luciferase Reporter ist jedoch begrenzt durch die relativ lange Halbwertszeit des Proteins Luciferase (T1/2 = 3,68 h) im Vergleich zum Zeitraum (vor allem auf den kurzen Zeitraum) für Änderungen im zirkadianen gen Ausdruck; Allerdings haben zahlreiche Studien über die Jahre erfolgreich eingesetzt das Luciferase-gen im pGL3 Vektor, darauf hinweist, dass schnell abbaubar Luciferase möglicherweise nicht für die zirkadianen Rhythmen, speziell für die Rhythmen mit einen längeren Zeitraum, wie z. B. Berichterstattung erforderlich 24 h. Daher hat ein Reporter Plasmid mit destabilisiert Luciferase Vektor, pGL [Luc2P/Neo], die hPEST (eine Proteinsequenz Destabilisierung) enthält entwickelt, ermöglicht es uns, als einen zirkadianen Reporter Vektor für unser aktuelles in-vitro-verwenden, Biolumineszenz-Assay. Das Protein kodiert, indem Luc2P hat eine viel kürzere Halbwertszeit (T1/2 = 0,84 h) und somit schneller und mit einem größeren Ausmaßes reagiert auf Änderungen in transkriptionelle Aktivität als Wildtyp-ichNdicating, das es sein kann, verwendet, um den rhythmischen Ausdruck der Luciferase geregelt durch den Projektträger PER2 akkurat in Echtzeit-16zu überwachen.

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Protokoll

1. Bau PER2 Promoter getrieben destabilisiert Luciferase Reporter Vektor

  1. Kauf eine individuelle pLS [hPER2P / rLuc / Puro] Vektor, die cDNA Kodierung rLuc und menschlichen enthält PER2 Promoter Fragment (hPER2P, 941 bp) auf dem Gelände zwischen Sac ich und Hind III in mehreren Klonen Region 17.
  2. Schneiden die menschliche PER2 Promoter Fragment (hPER2P, 941 bp) aus dem Vektor.
    1. Add 2,5 µL Restriktionsenzym Puffer, 10 µL (180 ng) pLS [hPER2P / rLuc / Puro] Vektor und 1 µL der Restriktionsenzyme, Sac I (10-Einheit/µL) und Hind III (10 Einheit/µL), nach einer DNA/RNA/Nukleotid-free Microcentrifuge Schlauch. Fügen Sie Reinstwasser (10,5 µL) bis zu 25 µL und Mischung sanft durch pipettieren.
    2. Inkubation bei 37 ° C für 90 min in einem Heizblock.
    3. Führen das gesamte Volumen (25 µL) der Restriktionsenzym Reaktion auf 0,7 % Agarose-Gel mit 0,0001 % Interkalation Bromid (EtBr), die hPER2P aus dem Vektor zu trennen.
      Hinweis: EtBr, 3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridinium Bromid (CAS-Registernummer: 1239-45-8), ist eine geruchlose rote Flüssigkeit. Es ist ein intercalating Mittel, das häufig verwendet wird, wie eine fluoreszierende markieren (Nuclein-Säure Fleck) in der Agarose-Gelelektrophorese als eine orange Farbe unter UV-Licht sichtbar. Mögliche Risiken der irreversible mutagene Wirkungen ergaben sich bei Versuchstieren, obwohl keiner der Regulierungsagenturen es als Karzinogen 18 kategorisiert. Daher wir gebrauchte Agarose-Gel und Elektrophorese-Puffer mit EtBr als chemisches Risiko Abfall gesammelt und angeforderte Rutgers Environmental Health & Sicherheit (REHS) abholen und entsorgen sicher.
    4. Schneiden Sie ein Stück der Agarosegel mit einer EtBr-Fluoreszenz-Band bei 941 bp, und reinigen Sie die hPER2P-Fragmente aus dem Gel mit den DNA-Gel Extraction Kit, gefolgt von Quantifizierung auf einem Spektrophotometer durch Messung der Absorption Dichte (OD) bei 260 nm Wellenlänge.
  3. Linearisieren 1.0 µL (1 µg) des Expressionsvektors destabilisierte Firefly Luciferase, pGL [Luc2P / Neo] mit der gleichen Methode wie in den Schritten 1.2.1-1.2.2 beschrieben. Auszug den Vektor mit den DNA-Aufräum Kit gefolgt von Quantifizierung wie beschrieben oben mit einem Spektrophotometer.
  4. Die hPER2P in der linearisierten Vektor pGL verbinden [Luc2P / Neo].
    Hinweis: pro Hersteller ' s-Anweisung, die ideale Molverhältnis von Insert und Vektor beträgt 2:1. Für 50 ng Vektor errechnet die optimale Menge des Einsatzes als 23,6 ng mit einer Formel, [(50 ng vector x 1.0 kb insert)/4.242 kb Vektor] x (2/1) = 23,6 ng einfügen]. Basierend auf die Konzentrationen von hPER2P (7,26 ng/µL) und pGL [Luc2P / Neo] (50 ng/µL), das Volumen von 50 ng pGL [Luc2P / Neo] und 23,6 ng hPER2P sind jeweils als 1 µL und 3,26 µL berechnet.
    1. Add 2 µL T4 DNA-Ligase Reaktion-Puffer (10 X) (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl 2, 1 mM ATP und 10 mM DTT), 3.26 µL (23,6 ng) hPER2P, 1 µL (50 ng) pGL [Luc2P / Neo], und 13.74 µL Wasser bis zu 20 µL , vorsichtig mischen.
    2. 1 µL T4 DNA-Ligase (400 Einheit/µL) hinzufügen, vorsichtig mischen und inkubieren Sie bei 16 ° C über Nacht in einem Thermocycler und dann chill den aufgespaltenen Vektor auf Eis pro Hersteller ' Anweisung s.
  5. Verwandeln die aufgespaltenen Vektor pGL [hPer2P / Luc2P / Neo] in chemisch kompetente E. Coli 19.
    1. Set im Wasserbad bei 42 ° C warm up Super optimale Brühe mit Catabolite Repression (S.O.C.) Medium (2 % Tryptone, 0,5 % Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 10 mM MgSO 4 und 20 mM Glukose) bei Raumtemperatur , Luria-Bertani (LB) Nährbodenplatte (mit 100 µg/mL Ampicillin, 80 µg/mL X-gal und 0,5 µM IPTG) bei 37 ° C Inkubator Aufwärmen und Auftauen auf Eis ein Fläschchen von kompetenten E. Coli Zellen für jede Transformation.
    2. Hinzufügen 6 µL (21 ng) ligiert Vektor oder 1 µL (30 ng) Vektor (Negativkontrolle), ein Rohr von chemisch kompetenter E. Coli (50 µL) zu leeren und dann sanft Drehen Sie das Rohr zu mischen. Inkubation für 30 min auf Eis
    3. Hitze Schock im Wasserbad 42 ° C für 30 s ohne schütteln und dann wieder auf Ice
  6. Wählen Sie eine E. Coli-Kolonie verwandelt mit einem aufgespaltenen Vektor mit blau/weißen Screening.
    1. Fügen Sie 250 µL S.O.C. Medium in der transformierten E. Coli Rohr und 1 h bei 37 ° C mit Schütteln bei 200 u/min inkubieren.
    2. 10-50 µL der transformierten E. Coli auf der Oberfläche der LB-Agar-Platte gleichmäßig verteilt. Setzen die Platte auf dem Kopf stehend im Inkubator 37 ° C über Nacht.
      Hinweis: Eine effiziente Klonen Reaktion sollten mehrere hundert Kolonien produzieren. Plattieren zwei unterschiedliche Volumina wird empfohlen, um sicherzustellen, dass mindestens eine Platte große, klare weiße oder blaue Farbe und gut bemessenen Kolonien haben wird. Wenn die Kolonien zu klein sind und die Farbe nicht zu unterscheiden ist, ist es hilfreich, mit einem Mikroskop (X 10 oder 50 X).
    3. Wählen Sie 3-6 weißen Kolonien von den Platten mit sterilisierten Zahn Stöcken, und lassen Sie jede Kolonie in einer Kultur Röhrchen mit 4 mL LB Kulturmedium mit 50 µg/mL Ampicillin.
    4. Inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 ° C mit Schütteln bei 200 u/min über Nacht. Extrahieren Sie die DNA mit Hilfe von 4 mL 2 mL kultiviert E. Coli mit einem Plasmid DNA Extraktion Mini Prep Kit pro Hersteller ' s Anweisung.
  7. Überprüfen und analysieren den Einsatz (hPER2P, 941 bp)
    1. verdauen das Plasmid DNA mit Restriktionsenzymen und führen Sie die beschriebenen Schritte 1.2.1-1.2.3 zu bestätigen, ob es ein Insert Elektrophorese.
      Hinweis: Positivkontrolle (hPER2P bei Schritt 1.2.4 gereinigt) und Negativkontrolle (E. Coli verwandelt sich ein leerer Vektor) wurden enthalten.
    2. Reihenfolge der ausgewählten Plasmid-DNA mit Hilfe M13 vorwärts und rückwärts Primern M13 bestätigen die Orientierung und die Reihenfolge der Einfügung in das Plasmid 19.
      Hinweis: Nur eine Kolonie, die einen Einsatz mit der richtigen Größe des hPER2P in Elektrophorese und korrekte Ausrichtung und die Reihenfolge in der Sequenzierung Ergebnis hatte ausgewählt wurde.
    3. Analysieren das menschliche PER2 Promoter Fragment (hPER2P, 941 bp) Sequenz für die circadiane regulatorischen Elemente, einschließlich E-Box Motiv (Bmal1 Bindungsstelle, CAT/CGTG), CCAATC, GC-Box und Transkription beginnen Website (CAGCGG) 20.
  8. Verstärken die ausgewählten E. Coli durch Hinzufügen der übrig gebliebenen 2 mL E. Coli in 200 mL LB Kulturmedium mit 50 µg/mL Ampicillin und dann es Inkubation über Nacht bei 37 ° C kultiviert mit Schütteln bei 200 u/min.
  9. DNA extrahieren-mit einer Maxi Endotoxin-freie Plasmid prep Kit pro der Hersteller ' s Anweisung, und dann durch die Messung OD bei 260 nm Wellenlänge mit einem Spektrophotometer zu quantifizieren. Aliquoten und Plasmid-DNA, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo] bei-80 ° C Gefrierschrank für die spätere Verwendung speichern.

2. Transiente Transfektion

  1. Kauf und Kulturzellen MCF10A
    1. Kauf einer verewigt, nicht verwandelt normale menschliche Mamma epithelialen Zelllinie (MCF10A) von einer kommerziellen Zellbank, wo Zellen cytogenetically sind getestet und mit authentifizierten tandem repeat Kurzanalyse vor dem Einfrieren. Auftauen und halten jedes Fläschchen von gefrorenen Zellen in Kultur für maximal 8 Wochen.
      Hinweis: Im Gegensatz zu anderen Zellen, diese Zellen haben Kontakt Hemmung wenn sie erst einmal bis ~ 70 % Zusammenfluss. Es erfordert, dass Subkultur erfolgt bei ~ 70 %.
    2. Kultur der Zellen mit Mamma Epithelzelle Wachstumsmedium (MEGM), mit Mamma epithelialen basal Medium (MEBM), Ergänzungen und Cholera-Toxin in eine Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 % und 5 % CO 2.
      Hinweis: Kaufen Sie Ready-to-Use Wachstumsfaktoren zur Verfügung gestellt in SingleQuot (SQ) und erhalten Sie Cholera Toxin separat. Endkonzentrationen von Ergänzungen sind 0,4 % bovine Hypophysen-Extrakt, 0,1 % Insulin, 0,1 % Hydrocortison, 0,1 % menschlichen epidermalen Wachstumsfaktoren, 100 ng/mL Cholera Toxin und 0,05 % Gentamycin Sulfat und 0,05 % Amphotericin B.
    3. Distanzieren die Zellen in der Kulturschale 10 cm durch Inkubation mit 10 mL Trypsin/EDTA für ~ 20 min und dann neutralisieren die Trypsin durch Zugabe von 10 mL Trypsin Lösung neutralisieren. Sammle alle Zellen mit HEPES gepufferten Kochsalzlösung (HBSS).
    4. Zählen die Zellen mit einem Hemocytometer unter einem inversen Mikroskop und berechnen Sie die Konzentration der einzelnen Zellsuspension und Samen dann eine bestimmte Anzahl von Zellen, je nach Bedarf. Schwenken Sie die Platten sorgfältig, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen in jeder Platte zu erhalten. Inkubieren Sie Zellen in der Zelle-Kultur-Inkubator bei 37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 % und 5 % CO 2.
      Hinweis: Kaufen Sie eine Subkultur-Reagenz-Pack enthält Trypsin/EDTA, Trypsin neutralisierende Lösung und HBSS verwenden.
  2. Transiente Transfektion von Zellen mit der circadianen Vektor konstruiert.
    1. 2 x 10 5 MCF10A Samenzellen gleichmäßig im 35 mm-Kultur Schüssel mit MEGM und wachsen, um 20-30 % Zusammenfluss (Folgetag).
    2. Warm bis die reduzierte Serum Medien (z. B. Opti-MEM) bei 37 ° C Wasser Bad und Transfection Reagens bei Raumtemperatur für 30 min. verdünnen das Plasmid DNA konstruiert (pGL [hPer2P / Luc2P / Neo]) bis 30 ng/µL mit Endo-Toxin frei Tris-EDTA (TE)-Puffer und halten bei Zimmertemperatur.
    3. Bereiten die Plasmid Transfektion Mischung in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch durch Hinzufügen von 63,6 µL warm reduzierte Serum Medien zuerst, dann Hinzufügen von 33,4 µL (0,1 µg) Plasmid DNA und vorsichtig mischen, indem pipettieren, und dann schließlich 3 µL Transfektion Reagenz direkt in der Mitte des Rohres ohne die Wand zu berühren. Nach dem Mischen sanft durch pipettieren, halten Sie bei Raumtemperatur für 30 min.
    4. Fallen die gesamte Plasmid-Mischung (100 µL) direkt auf die Mitte des Mediums in der Platte und dann durch schütteln die Schüssel vorsichtig mischen. Kultur der Zellen in einem CO-2-Inkubator für zusätzliche 48-72 h
      Hinweis: Es wird prognostiziert, dass die höchste Effizienz der Transfektion wäre am Zusammenfluss von 40-70 % dieser Zellen aufgrund ihrer Kontakt-Hemmung bei ~ 70 %. Daher Transfektion funktioniert am besten ab ~ 20 bis Haltestelle ~ 70 % Zusammenfluss.

3. Gründung des In-vitro- Biolumineszenz Assays in vorübergehend transfizierten MCF10A Zellen

  1. verhungern, die kultivierten Zellen bei ~ 70 % Zusammenfluss (nach Transfektion für 48-72 h) in MEBM ohne Wachstumsfaktoren für 24 h.
  2. Behandlung der Zellen mit Synchronisation Agent (z.B. 50 % Pferd Serum (HS)) in MEBM für 1,5 h in einem Inkubator CO 2.
    Hinweis: Für die Auswahl der idealen Synchronisation Agent, 10 µM Forskolin 1 nM Melatonin, 0,1 µM Dexamethason, 50 % HS und 100 % SQ waren im Vergleich in Bezug auf die circadiane Amplitude und Zeit in den circadianen Vektor transfected Zellen. Leerer Vektor transfected Zellen werden mit 100 % behandelt SQ als Negativkontrolle.
  3. Pre-prepare 20 mL Aufzeichnungsmedium (für 10 der 30-mm-Kultur Gerichte) durch Zugabe von 5 mL MEGM, 15 mL MEBM, 150 µL Natriumbicarbonat 200 µL HEPES und 40 µL Luciferin Lager Lösung (50 mM) in ein Zentrifugenröhrchen 50 mL sterilisiert.
    Hinweis: Die Endkonzentrationen der einzelnen Komponenten: 20 % SQ und 20 ng/mL Cholera Toxin, 0,06 % Natriumbicarbonat, 1 % Penicillin/Streptomycin und 10 mM HEPES. Erwärmen Sie vorbereitete Aufnahme Medium und 1 X PBS für 30 min bei 37 ° C Wasserbad sterilisiert. Hinzufügen von 100 µM Luciferin unmittelbar vor der Anwendung.
  4. Waschen der Zellen mit warmen 1 x Dulbecco ' s Phosphate-Buffered Kochsalzlösung (D-PBS) für 3 Mal nach der Inkubation mit der Synchronisation-Agent, und dann 2 mL Aufnahme Medium.
  5. Dichtung das Gericht mit einer sterilisierten Deckel Klasse mit Silikonfett zur Vermeidung von Verdampfung und beschriften Sie sie auf der Seite.
  6. Setzen die versiegelte Schale in den Sitz in die Luminometer, und aktivieren Sie die Option für den Speicherort der Datei in den Ordner speichern (für Details, siehe Abschnitt 6).

4. Auswahl von stabil transfizierten Zellen

  1. eine ideale G418 Konzentration (800 µg/mL) mit einem Kill Kurve Assay nach Angaben des Herstellers zu optimieren ' s Anleitung zur Auswahl der stabil transfizierten Zellen.
  2. Nach transiente Transfektion für 48 h oder 72 h, Subkultur und die Zellen mit MEGM in größeren Gerichten auf 5.000 Samen Zellen/Gericht (100 mm). Nach 24 Stunden behandeln Kultur in der Zelle-Kultur-Inkubator (37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 % und 5 % CO 2), die Zellen mit 800 µg/mL G418 ersetzt das alte Medium mit neuen Medium enthält 800 µg/mL G418 alle 3-4 Tage für 2 Wochen.
  3. Subkultur der Überlebende stabil transfizierten Kolonien für 1-3 Passagen mit MEGM mit 500µg/mL G418 zu pflegen die stabile Expression von hPer2P/Luc2P und Einfrieren in flüssigem Stickstoff für die zukünftige Verwendung.
  4. 500µg/mL G418 nach allgemeinen Subkultur, die stabil transfizierten Population von Zellen, wählen erneut zu behandeln, wenn die Biolumineszenz-Intensität am Ausgang des in-vitro- Biolumineszenz-Assay nach Gebrauch in vielen Passagen immer niedrigere wird.

5. Behandlung mit Chemikalien

  1. bei 48 h oder 72 h nach Transfektion, verhungern, die Zellen von Wachstumsfaktoren in MEBM für 24 h.
  2. Nach der Synchronisierung mit 50 % HS 2 h behandeln Zellen mit 0,25 oder 0,5 mM Nitrosomethylurea (NMU), 20 nM EX527 oder 1 µM Cambinol für 1 h in MEBM mit 20 % sq
  3. Nach dem Waschen mit 1 x D-PBS, mittlere mit 12,5 µM MSC Aufnahme, allein oder in Kombination mit 20 nM EX527 oder 1 µM Cambinol, zu den Zellen hinzufügen. Überwachung der Biolumineszenz mit der Luminometer.
  4. Behandeln die stabil transfizierten MCF10A / PER2-dLuc Zellen mit NMU bei 0,5, 1 oder 2 mM, EX527 bei 40 nM oder Cambinol bei 2,0 µM, 1 h nach der Synchronisierung mit 50 % HS, und inkubieren Sie die Zellen in der Aufnahme Medium mit 12,5 µM von MSC oder verschiedenen Dosierungen (5, 10 oder 20 µM) von n-Acetylcystein (NAC). Legen Sie die Platten in die Luminometer, Datensatz und die Biolumineszenz durch Luminometer für 4-8 Tage zu speichern, wie beschrieben in Abschnitt 3.6.
    Hinweis: NMU ist eine methylierte Nitrosourea Gehege mit Mutagene, Karzinogene und teratogene Eigenschaften. NMU ist eine direkt wirkende Alkylierungsmittel und hat eine kurze Halbwertszeit (T 1/2 = ~ 30 min). Es liegt stabil bei sauren Zustand (pH 4-5), aber instabil bei alkalischen Bedingungen (pH 9-10) und bei Temperaturen über 20 ° C. Daher kann Bleichmittel bei 10 % als eine effiziente Desaktivierungsmittels für Reinigung Bank von Oberflächen und Labor waren potenziell kontaminiert durch NMU Soluti verwendet werdenauf. Übrig gebliebene Stammlösung wird abgeholt und sicher von REHS entsorgt. Basierend auf die Wirkungsweise von Chemikalien, können synchronisierte Zellen für kürzere Zeiten vor der Kultivierung auf Aufzeichnungsmedium behandelt werden. Zellen können auch in das Aufnahmemedium für eine längere Zeit (mehrere Tage) behandelt werden.

6. Datenerhebung, Analyse und Präsentation

Hinweis: Zellviabilität muss noch geklärt werden mit standard-Methoden (z. B. MTT-Assay) nach der Behandlung der Zellen in den gleichen Konzentrationen für die gleichen Zeiten angegeben. Alle Behandlung-Konzentrationen in der in-vitro- Biolumineszenz-Assay verwendet wurden weniger als 30 % tödliche Konzentration (LC30). Alle Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung und repräsentative Ergebnisse wurden.

  1. Nach der Versiegelung der Schale (Schritt 3.5), laden die Gerichte auf die Sitze im Luminometer, die in einem Inkubator bei 37 ° C ohne H 2 O und CO 2 gesetzt und an einen Computer angeschlossen aufbewahrt wird.
  2. Klicken Sie " speichern " und geben Sie die Namen für den Ordner und die Datei wo das aufgezeichnete Lumineszenz-Signal aus der entsprechenden Schale gespeichert werden.
    Hinweis: Das System erkennt die Lumineszenz-Signal in Echtzeit aus den Zellen in der Schale an den einzelnen Positionen. Die Signale werden über 4-Photon counting Photomultiplier Röhren, an den Computer übertragen und gespeichert und durch die Datenerfassungs-Software auf dem Computer angezeigt.
  3. Analysieren die Signale nach der Aufnahme für 4-7 Tage, mittlere Wandel und kontinuierliche Aufzeichnung für eine zweite Woche bei Bedarf gefolgt werden könnte.
    Hinweis: Circadiane Parameter, einschließlich Rhythmus Amplitude, Phase, Periodenlänge und Dämpfung Rate, erhalten wir verwendet Luminometer-Analyse-Software die Biolumineszenz-Daten analysieren.
  4. Detrend raw-Daten mit laufender Durchschnitt, und analysieren die besten passt zu einer Sinuswelle, Periode, Phase, Amplitude und Dämpfung Rate 21 , 22.
  5. Durch die hohe transiente Biolumineszenz auf Behandlung und mittlere Veränderung des ersten Zyklus der Daten vom Analyse ausschließen.
  6. Für die Datendarstellung, plot-Rohdaten (Biolumineszenz, Graf/s) gegen die Zeit (h oder Tag). Bei Bedarf können Daten Grundlinie abgezogen, Amplitude und Phase zu vergleichen geplottet werden.

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Ergebnisse

Circadiane Biolumineszenz Reporter Vektor: menschliche PER2 Projektträger-gesteuerte Ausdruck destabilisierte Luciferase-Variante

Die DNA-Sequenz bestehend aus 941 bp Fragment abgeleitet aus dem menschlichen PER2 Promotor verwendet, um die circadiane Reporter-Vektor, pGL konstruieren [hPer2P/Luc2P/Neo, war zunächst auf das Vorhandensein von regulatorischen Elemente bekannt, regulieren analysiert ...

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Diskussion

Periodizität der circadianen Uhr unterliegt in Säugerzellen miteinander verbundenen transkriptionelle/translationale Feedback-Schleifen. Heterodimere Bmal1 und Uhr oder Npas2 regulieren zirkadiane Transkription durch Bindung an E-Box-Elemente in die Promotoren des Kerns CGs, einschließlich Per2 und Schreiund zahlreiche CCGs4. Wie sie in der Zelle, Heterodimere der sammeln pro: Schrei sind posttranslational modifiziert und transportiert in den Zellkern, Uhr: Bmal1 transkriptionell...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch 2012 Gesellschaft für Toxikologie (SOT)-Colgate Palmolive Grant für Alterative Forschung (M. Reißzahn) und die internationale Zusammenarbeit-Forschung zu finanzieren, von Tier und Pflanze Quarantäne, Republik Korea (M. Fang), und gewähren den NIEHS P30ES005022 (H. Zarbl). Wir möchten danken Dr. Zheng Chen (McGovern Medical School an der University of Texas Health Science Center in Houston), für seine hilfreiche Diskussion, Mr Shao-An Juan für seine experimentelle Unterstützung und Frau Kimi Nakata für ihr Korrekturlesen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
pLS[hPER2P/rLuc/Puro]-VektorSwitchGear GenomicsS700000kundenspezifischer Vektor
pGL4.18[Luc2P/Neo]-VektorPromega9PIE673destabilisierter Luciferase-Expressionsvektor
T4-DNA-LigaseInvitrogen15224041Für die Subklonierung
von TOPO TA-KlonierungskitInvitrogenK4500-02mit One Shot TOP10 chemisch kompetente E. coli
Sac INew England BioLabsR0156SRestriktionsenzym
Hind III-HFNew England BioLabsR3104SRestriktionsenzym
CutSmart-PufferNew England BioLabsB7204SRestriktionsenzympuffer
DNA-Gel-ExtraktionskitQiagen28704Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegel-PCR-Aufreinigungskit
Qiagen28104DNA-Reinigung
LB Miller's ModifikationTEKNOVAL8600Für transformierte E. Coli-Kultur
LB Agar PlateTEKNOVAL1902Für die Weiß/Blau-Auswahl
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104Für die Extraktion von Plasmid-DNA
EndoFree Plasmid Maxi Prep KitQiagen12362Für die Extraktion von Plasmid-DNA
FuGene HDPromegaE2311Transfektionsreagenz
Opti-MEM reduziertes SerummediumInvitrogen31985-062Für die Transfektion
MCF10A ZelllinieAmerican Type Culture CollectionCRL-10317Brustepithelzellen
MEGM BulletKitLonzaCC-3150Brustepithelwachstumsmedium
MEBMLonza LonzaCC-3151Brustepithel-Basalmedium
MEGM SingleQuot KitLonzaCC-4136Zubehör & Zubehör Growth Factors
ReagentPackLonzaCC-5034Reagenz für Subkulturen
D-PBS (10X)SigmaD1408Waschzellen in Kulturschalen
UltraPure Distilled WaterInvitrogen10977Dilute 10X D-PBS
Gewebekulturschale (35 mm)BD/Falcon353001Zellkulturschale passend für LumiCycle
SilikonfettFisherNC9044707Zur Versiegelung der Schale mit Aufzeichnungsmedium
Rundes DeckglasHarvard Bioscience64-1500 (CS-40R)Zur Versiegelung der Schale mit dem Aufzeichnungsmedium
CholeratoxinSigmaC8052Ergänzung für das Wachstumsmedium
G418 Sulfat (Geniticin)Invitrogen10131035Antibiotikum zur Selektion stabil transfizierter Zellen
AmpicillinSigmaA9393Für die Kolonieauswahl
ForskolinSigmaF6886Synchronisationsmittel
MelatoninSigmaM5250Synchronisationsmittel
DexamethasonSigmaD4902Synchronisationsmittel
PferdeserumSigmaH1138Synchronisationsmittel
d-Luciferin, NatriumsalzInvitrogenL2912Luciferase-Substrat
IC261Sigma10658Positivkontrolle für zirkadianen
Disruptor Methylnitrosoharnstoff (NMU)SigmaN1517Mamma-spezifisches Karzinogen
Methylselenocystein (MSC)SigmaM6680Organisches Selen (chemopräventives Mittel)
EX527SigmaE7034SIRT1-spezifischer Inhibitor
CambinolSigmaC0494SIRT1 & SIRT2-Inhibitor
NanoDrop SpektralphotometerThermo ScientificNanoDrop 8000Quantifizierung des Nukleotids
GeneAmp PCR System 9700Applied BiosystemsN805-0200Für molekularbiologisches Experiment
CO2-InkubatorNAPCO Serie 8000 DHFür Zellkulturen bei 5% CO2 bei 37 &°; C
Tischzentrifuge mit RefrezeratorEppendorf5430RFür molekularbiologische
Experimente Zentrifuge mit SchwenkeimerEppendorf5810 RFür Zellkultur
Inverses MikroskopNikon80124Phasenkontrast optional
GewebekulturhaubeLabconcoKlasse II A2BSL-2 zertifiziert
LumiCycle 32ActimetricsNicht verfügbarLuminoszen-Detektor

Referenzen

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