Eine abgekürzte Fraktionierung-Protokoll für die Bereicherung der Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn wird beschrieben.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Anreicherung von Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
In dieser Studie beschreiben wir eine abgekürzte Einzelschritt Fraktionierung-Protokoll für die Bereicherung der Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn. Das Ionische Waschmittel N-Natriumlaurylsulfat-Sarkosin (Sarkosyl) solubilisiert effektiv nativ gefaltete Proteine im Gehirngewebe, so dass die Anreicherung von Waschmittel-unlösliche Aggregate aus einer breiten Palette von neurodegenerativen Proteinopathies, wie Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson und Amyotrophe Lateralsklerose und Prion-Krankheiten. Menschlichen Kontrolle und Post-mortem Hirngewebe AD wurden homogenisiert und sedimentierte durch Ultrazentrifugation in Anwesenheit von Sarkosyl Waschmittel-unlösliche Aggregate einschließlich pathologischer phosphorylierten Tau, das Herzstück der neurofibrillären bereichern Verwicklungen in AD. Westliche Beflecken, demonstriert die differenzielle Löslichkeit der aggregierten phosphoryliert-Tau und die Waschmittel-lösliche Protein, frühen Endosom Antigen 1 (EEA1) in Steuerung und AD Gehirn. Proteomic Analysen ergaben auch Bereicherung der β-Amyloid (Aβ), Tau, snRNP70 (U1 - 70 K), und Apolipoprotein E (APOE) in die Sarkosyl-unlösliche Bruchteilen von AD Gehirn im Vergleich zu denen der Kontrolle, konsistent mit früheren Gewebe Fraktionierung Strategien . Somit eignet sich dieses einfache Bereicherung-Protokoll für eine Vielzahl von experimentellen Anwendungen reichen von Western blotting und funktionsfähiges Protein Co Aggregation Assays, Massenspektrometrie-basierte Proteomics.
Einleitung
Neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson-Krankheit (PD), Chorea Huntington (HD), Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und die eng verwandten Prion-Krankheiten sind gekennzeichnet durch die allmähliche Anhäufung von proteinopathies Waschmittel-unlösliche Aggregate im Gehirn mit begleitenden kognitiven ablehnen. 1 , 2 diese gemeinsame pathologische Funktion wird gedacht, um eine zentrale Rolle in der Ätiologie und Pathophysiologie dieser neurodegenerativen Krankheiten. 2 diese Aggregate bestehen typischerweise aus Polymeren Amyloid Fasern, die zusammengesetzt sin....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Ethik-Erklärung: alle Hirngewebe stammen aus der Emory Alzheimer ' s Disease Research Center (ADRC) Brain Bank. Post-mortem Gewebe unter richtigen institutionellen Review Board (IRB) Protokolle erworben wurden.
1. Homogenisierung und Fraktionierung
- Gewebe Auswahl
Hinweis: Frozen Post-mortem frontalen Kortex Gewebe aus gesunden Kontrolle (Ctl) und pathologisch bestätigten AD-Fälle wurden ausgewählt von der Emory ADRC Gehirn Bank (n = 2). Post-Mortem neuropathologische Auswertung der Amyloid-Plaques Verteilung wurde entsprechend des Konsortiums, eine Registrierung für Alzheimer zu etablieren dur....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Das abgekürzte einstufigen Sarkosyl-Fraktionierung-Protokoll wurde verwendet, um Waschmittel-unlösliche Aggregate aus Kontrolle und AD Post-mortem Gehirn (Abbildung 1) zu bereichern. Proteine aus TH-S, S1, S2 und P2 Fraktionen wurden gelöst durch SDS-PAGE, für 15 min in Coomassie Blau Fixativ Puffer gefolgt von schonende Färbung mit Coomassie Brilliant Blue G-250 Färbung Puffer fest. Die Wiederfreisetzung Schritt ist optional, da gab es nicht nachweisbare Niv.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Hier wir vorstellen und diskutieren eine abgekürzte Einzelschritt Waschmittel-Fraktionierung-Protokoll, die für eine Vielzahl von experimentellen Anwendungen von Massenspektrometrie-basierte Proteomics Analysen bis hin zu funktionellen Protein misfolding assays und westliche Beflecken. 5 , 6 , 7 , 10 dieser Methodik ist vielleicht die meisten wirksam, wenn Sie zur Untersuchung neurodegenerative.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Die Autoren danken Dr. Jim Lah und Allan Levey, Emory Universitätsklinik für Neurologie, für die hilfreichen Kommentare und Anregungen. Diese Arbeit wurde teilweise finanziert durch die Beschleunigung der Medizin Partnerschaft Grant (U01AG046161-02), die Emory Alzheimer Disease Research Center (P50AG025688) und eine National Institute on Aging gewähren (R01AG053960-01) N.T.S. Diese Forschung wurde auch teilweise durch die Neuropathologie Kern von Emory Neurowissenschaften NINDS Core Facilities Grant, P30NS055077 unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Protease- und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail, EDTA-frei (100X) | Thermo Fisher | 78441 | Protease- und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail |
| Sonic Dismembrator System (Ultraschallgerät) | Fisher Scientific | FB505110 | Mikrospitzen-Ultraschallgerät |
| Optimax TLX Ultrazentrifuge | Beckman Coulter | 361545 | gekühlte Ultrazentrifuge |
| TLA120.1 Rotor | Beckman | Coulter 362224 | Ultrazentrifugenrotor |
| 500 ul (8 x 34 mm) Polycarbonat-Röhrchen, dickwandig | Beckman Coulter | 343776 | Ultrazentrifugenröhrchen für TLA120.1 Rotor |
| 4X SDS Probenpuffer | Hausgemachte | N/A | SDS-PAGE |
| TCEP-Lösung, pH-neutral | Thermo Fisher | 77720 | Reduktionsmittel |
| (TBS) Blockierungspuffer | Thermo Fisher | 37542 | Blockierungspuffer |
| (TBS) Blockierungspuffer + 0,05 % Tween 20 | Thermo Fisher | 37543 | Blockierungspuffer und Antikörperverdünnungsmittel |
| 4-12 % Bolt Bis-Tris Plus Gele, 10 Well | Thermo Fisher | NW04120BOX | vorgefertigte SDS-PAGE-Gele |
| MES SDS Laufpuffer (20X) | Thermo Fisher | B0002 | SDS-PAGE Laufpuffer |
| N-Lauroylsarcosin-Natriumsalz (Sarkosyl) | Sigma Aldrich | L5777-50G | Reinigungsmittel |
| Anti-Tau-2 (pan tau) Antikörper | Chemicon | MAB375 | Antikörper |
| Antiphospho-Threonin 231 Tau Antikörper | Millipore | MAB5450 | Antikörper |
| Antiphospho-seroin 202 und Threonin 205 Tau Antikörper (AT8) | Thermo Fisher | MN1020 | Antikörper |
| Anti-frühes Endosomen-Antigen 1 (EEA1) Antikörper | abcam | ab2900 | Antikörper |
| Alexa Fluor 680 Ziege Anti-Maus IgG (H+L) Sekundärantikörper | Thermo Fisher | A21058 | Antikörper |
| Alexa Fluor 790 Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L) Sekundärantikörper | Thermo Fisher | A11374 | Antikörper |
| iBlot2 Dry Blotting System | Thermo Fisher | IB21001 | Geltransfer |
| iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini | Thermo Fisher | IB23002 | Gel-Transfer |
Referenzen
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease. Science. 296 (5575), 1991(1991).
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).
- Ramírez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
