Methodenartikel

Neurobehavioral Bewertungen in einem Mausmodell der Neugeborenen hypoxisch-ischämische Hirnschädigung

DOI:

10.3791/55838

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24. November 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department and Research Institute of Rehabilitation Medicine, Yonsei University College of Medicine, 2Brain Korea 21 PLUS Project for Medical Science, Yonsei University, 3Department of Rehabilitation Medicine, Yonsei University Wonju College of Medicine, 4Rehabilitation Institute of Neuromuscular Disease, Yonsei University College of Medicine, 5Graduate Program of NanoScience and Technology, Yonsei University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Führten wir einseitige Halsschlagader Okklusion auf postnatale Tag 7-10 CD-1 Maus Welpen eine neonatale hypoxisch-ischämische (HI) Modell erstellt und untersucht die Auswirkungen der HI-Hirn-Trauma. Wir untersuchten neurologischen Funktionen in diesen Mäusen im Vergleich zu normalen Mäusen nicht betrieben.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir einseitige Halsschlagader Okklusion auf CD-1 Mäusen zum Erstellen eines Neugeborenen hypoxisch-ischämische (HI) Modells durchgeführt und untersucht die Auswirkungen der Neugeborenen HI-Hirn-Trauma durch das Studium der neurologischen Funktionen in diesen Mäusen im Vergleich zu nicht betrieben (z.B. normale) Mäuse. Während des Studiums war Reis-Vannucci Methode zum Neugeborenen HI Hirnschäden bei postnatalen Tag 7-10 (P7-10) Mäusen zu induzieren. Die HI-Operation wurde auf die Welpen durch einseitige Halsschlagader Ligatur und Exposition gegenüber Hypoxie (8 % O2 und 92 % N2 für 90 min.) durchgeführt. Eine Woche nach der Operation die Geschädigten Gehirn wurden mit dem bloßen Auge durch den halbtransparenten Schädel ausgewertet und in Untergruppen anhand der ("keine kortikalen Verletzung" Gruppe) oder Abwesenheit ("kortikalen Verletzung" Gruppe) der kortikalen Verletzung kategorisiert wurden, wie eine Läsion in der rechten Hirnhälfte. In Woche 6, die folgenden neurologischen Tests wurden durchgeführt, um die kognitiven und motorischen Funktionen bewerten: passive Vermeidung Aufgabe (PAT), Leiter walking Test und Griff-Stärke-Test. Diese Verhaltensstörungen Tests sind hilfreich bei der Bestimmung der Auswirkungen des Neugeborenen HI-Hirn-Trauma und in anderen Mausmodellen neurodegenerativer Erkrankungen dienen. In dieser Studie zeigten Neugeborenen HI Gehirn Verletzungen Mäuse motorische Defizite, die rechte Hemisphäre Schaden entsprach. Die behavioral Testergebnisse sind relevant für die Defizite bei menschlichen Neugeborenen HI-Patienten wie Zerebralparese oder neonatale Schlaganfall-Patienten beobachtet. In dieser Studie war ein Maus-Modell der Neugeborenen HI-Hirn-Trauma gegründet und zeigte verschiedene Grade der motorischen Defizite und kognitiver Beeinträchtigung im Vergleich zu Mäusen nicht betrieben. Dieses Werk enthält grundlegende Informationen über die HI-Maus-Modell. MRT-Aufnahmen zeigen die unterschiedlichen Phänotypen, je nach Schwere der Schädigung des Gehirns durch motorischen und kognitiven Tests getrennt.

Einleitung

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Neonatale HI-Hirn-Trauma tritt während der frühen Kindheit (etwa zwei Patienten pro 1.000 Kinder)1,2,3,4,5. Studien zum Neugeborenen HI-Hirn-Trauma sind wichtig, und mit einer etablierten neonatale HI Gehirn Verletzungen Maus-Modell kann in Vivo präklinischen Forschung auf HI-Hirn-Trauma erleichtern.

Traditionelle HI-Modelle sind bei erwachsenen Ratten6verwendet. Für das Neugeborene-Modell ist die Reis-Vannucci Methode häufig auf P7 Ratten7,8verwendet. Jedoch, da Ratten und Mäuse etwas andere9,10, sind obwohl sie beide Nagetiere sind, führten wir eine modifizierte Methode der Reis-Vannucci auf CD 1 Welpen auf P7-10, basierend auf früheren Studien, die zeigten, dass P7-10 ist mit Unreife Oligodendrozyten, menschlichen Begriff P011,12entspricht. Die neonatale HI-Maus-Modell wird durch beide der Ligatur der einseitigen Halsschlagader und die Exposition der Mäuse gegenüber Hypoxie mit 8 % Sauerstoff in P7-10 Welpen hergestellt.

Die Mäuse ausgesetzt das Verfahren zeigten verschiedene Grade der Hirnläsionen im Bereich Posterolateral der rechten Hemisphäre. Ermittlung der kognitiven und motorischen Defiziten, Neurobehavioral Bewertungen basierend auf der PAT, wurden Leiter walking Test und Griff-Stärke-Test durchgeführt. Die Unterschiede zwischen nicht betrieben (z.B. normal) und HI-Mäuse wurden analysiert. Dieses Werk stellt grundlegende Informationen über die HI-Maus-Modell. Die MRT-Aufnahmen zeigen die verschiedenen Phänotypen, je nach schwere Gehirnschäden mit motorischen und kognitiven Tests getrennt.

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Protokoll

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Alle Tiere waren in einem standard Käfig (27 × 22,5 × 14 cm3) untergebracht, in einer Anlage von der Association for Assessment und Akkreditierung von Laboratory Animal Care (AAALAC) akkreditiert und Nahrung gegeben und Wasser Ad Libitum unter wechselnden 12 h hell/dunkel Zyklen. Die Autoren gefolgt Tierschutzbestimmungen und experimentelle Verfahren wurden genehmigt durch die institutionelle Animal Care und Nutzung Ausschuss der Yonsei University College of Medicine (IACUC Nr. 2010-0252; 2013-0220).

(1) Maus-Modell der Neugeborenen HI-Hirn-Trauma

  1. Die Welpen mit Isofluran zu betäuben.
    1. Legen Sie die Welpen (weniger als 5) in eine betäubende Box und schließen Sie den Deckel.
    2. Schalten Sie die betäubende System für ca. 15 min; passen Sie die Gas und Isofluran mit Hilfe einer Tabelle oben Anästhesiemaschine an. Passen Sie die Sauerstoff-Flowmeter bis 1,5 L/min. Einstellen der Isofluran Verdampfer auf ca. 3-5 % für die Induktion der Anästhesie.
    3. Stellen Sie nach 15 min Verdampfer Isoflurane auf 1-2 % für die Aufrechterhaltung der Narkose.
  2. Einen vollständig betäubten Welpen unter dem Mikroskop Dissektion (Bauch vor der Forscher) legen und mit Klebeband sichern.
  3. Machen Sie einen ~0.7-mm Schnitt in den Hals mit einer sterilisierten Schere.
  4. Sorgfältig entfernen Sie das Fettgewebe mit steriler Pinzette und setzen Sie die einseitige Recht Halsschlagader.
  5. Verbinden Sie die einseitige rechts Halsschlagader mit einer 5-0 resorbierbaren Naht.
  6. Der Schnitt in den Hals Naht mit 5: 0 Naht.
  7. Jeder Welpe in einer 37 ° C warmen hypoxischen Kammer für 1 h für die Wiederherstellung zu platzieren. Schließen Sie den Deckel nicht.
  8. 1 h nach der Operation, wenn die Welpen sind hellwach, Hypoxie Kammer Deckel schließen und verringern die Gaswerte um hypoxische Bedingungen (8 % O2 und 92 % N2) herzustellen.
  9. Kehren Sie nach 90 min von Hypoxie die Welpen zu ihren Käfigen.
  10. Eine Woche nach der HI-Hirn-Trauma, wiederholen Sie Schritt 1.
    1. Machen Sie nach der Narkose einen Schnitt in der Kopfhaut mit sterilisierten Schere und Pinzette, die Gehirn-Läsion im Bereich Posterolateral der rechten Hemisphäre zu identifizieren.
      Hinweis: Diese Behandlung induziert Hypoxie in Welpen. Das Vorhandensein und das Ausmaß der Hirnschädigung in alle Mäuse wird visuell beurteilt, mit dem bloßen Auge durch den halbtransparenten Schädel. Bestimmt die Größe oder das Volumen der Verfärbung (d. h. die Gehirn-Läsion), sind Jungtiere in Gruppen eingeteilt. Wenn es keine sichtbaren kortikalen Verletzung gibt, ist die Maus in die Gruppe "keine kortikalen Verletzung" eingestuft. Ist eine sichtbare kortikale Verletzung (d. h. eine Läsion in der rechten Hemisphäre), wird die Maus in die Gruppe "kortikalen Verletzung" eingestuft. Da die Klassifizierung der Mäuse in Gruppen eine Woche nach der Operation erfolgt, können die Gruppierungen geändert werden, wenn die Morphologien der Gehirn-Proben zum Zeitpunkt der Opfer1,2,3klar definiert sind, 4.

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Abbildung 1: Modellierung neonatale HI-Hirn-Trauma bei Mäusen.
(A) sieben Tage alte Maus Pup operiert, und die einseitige Recht Halsschlagader war ligiert. (B) Welpen wurden in einer Hypoxie Kammer für 90 min mit 8 % O2 und 92 % N2platziert. (C, D und E) Die Gehirne mit Neugeborenen HI Verletzung zeigte verschiedene schwere Schäden und kategorisiert wurden, basierend auf den Grad der Schädigung. In Woche 14 die Gehirn stammen, und die Läsionen wurden visualisiert. (C) Bild eines Gehirns, als ein "keine kortikalen Verletzung" eingestuft. Beide (D) und (E) wurden in der Gruppe "kortikalen Verletzung" eingeteilt. (F, G und H) Repräsentative MRI (c), (D) und (E) Mäuse, beziehungsweise. (F) der Schaden im Hippocampus ist mit einem gelben Pfeil, und Läsionen in der rechten Hemisphäre sind auch mit gelben Pfeilen (G und H) gekennzeichnet. Skalieren von Balken = 1 mm Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

(2) Neugeborenen Verhaltens Tests

Hinweis: Hier die Verhaltensstörungen Tests wurden im Alter von 6 Wochen durchgeführt.

  1. Passive Vermeidung Aufgabe.
    Hinweis: Um Memory-Funktion basierend auf lernen und die Vermeidung von einen aversiven Reiz zu bewerten, sollte eine Zweikammer-Durchstieg PAT durchgeführten13,14,15,16.
    1. Legen Sie eine Maus in hellen Abteil des Shuttle Plexiglasbox (41,5 × 21 × 35 cm3) von einem PAT Apparat.
    2. Nach 30 s, die Guillotine-Tür öffnen und erfassen die Latenzzeit für die Maus in den dunklen Raum zu bewegen (bis zu 300 s).
    3. Schließen Sie die Guillotine-Tür, wenn alle vier Gliedmaßen der Maus vollständig in den dunklen Raum sind.
    4. Elektrische Fuß Schock zu verwalten (0,5 mA) für 2 s und Rückkehr der Maus in seinem Käfig.
    5. Ersetzen Sie die Maus in die helle Kammer 24 h nach dem elektrischen Fuß Schock.
    6. Die Guillotine Tür 10 s zu öffnen, nachdem die Maus vollständig in die helle Kammer platziert ist, und notieren Sie die Wartezeit für die Maus in den dunklen Raum zu bewegen (bis zu 300 s).
  2. Leiter-Gehtest.
    Hinweis: Die Leiter Sprosse zu Fuß Aufgabe ermöglicht die Unterscheidung zwischen subtilen Störungen der motorischen Funktion durch die Kombination von qualitativen und quantitativen Analysen von qualifizierten zu Fuß17,18.
    1. Schalten Sie eine Videokamera.
    2. Statt einer Maus im Feld Start der Leiter und sofort starten Sie die Aufnahme.
    3. Zeichnen Sie das Video, mit Schwerpunkt auf den Maus-Gliedmaßen.
    4. Beenden Sie die Aufnahme, wenn die Maus das letzte Element der Leiter berührt. Wiederholen Sie die hin- und Herbewegung Reise vier Mal.
    5. Die video-Aufnahme zu analysieren und manuell die Anzahl der Zettel jeden Vordergliedmaße wie folgt:
      1. Spielen Sie das Video auf einem Computer mit einer langsamen Geschwindigkeit Aufzeichnung (0,1 X) und die Schritte manuell zählen.
  3. Griff-Stärke-Test.
    Hinweis: Der Griff-Stärke-Test erfolgt mit einem Griff Stärke Meter, inklusive einer Gegentakt-DMS.
    1. Befestigen Sie den Griff Stärke Apparat auf einer Acrylplatte.
    2. Legen Sie Mausklick auf die Acrylplatte und halten Sie seinen Schweif.
      1. Bewegen Sie die Hand hält das Heck, so dass die Maus erreichen und Griff der Metalldraht des Apparates.
    3. Lassen Sie mehrere Studien, bis die Maus greift ein dreieckiges Stück aus Metalldraht (2 mm Durchmesser); die Spitzenkraft wird in Gramm vom Gerät automatisch registriert.
      Hinweis: Verwenden Sie die mittlere Spitzenkraft von drei Studien für Analyse19,20,21.

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Ergebnisse

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Alle Daten sind als der Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM) ausgedrückt. Der Vergleich von Variablen zwischen den beiden Gruppen wurde durchgeführt mit einer unabhängigen oder gepaarten t-test auf SPSS-Statistik-Software. Ein p-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Die Gehirne mit Neugeborenen HI Verletzungen zeigten unterschiedliche schwere der Schäden und wurden entspreche...

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Diskussion

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In dieser Studie wir induzierte HI-Hirn-Trauma in einer neonatalen P7-10 CD-1-Maus und die Gehirn-Läsion mit relevanten kognitiven und motorischen Defizite identifiziert. Während dieses Vorgangs kritisierte Okklusion der einseitigen rechten Halsschlagader. In diesem Schritt könnte die Arterie zerrissen und werden beschädigt. Die meisten Welpen, die eine Arterie Träne erlebt starb. Umgekehrt wenn Forscher ein weiteres Blut Vene statt der einseitigen Rechts Halsschlagader ligiert, das Gehirn der Pup wurde nur leicht beschä...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

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Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse vom National Research Foundation (NRF-2014R1A2A1A11052042; 2015M3A9B4067068), das Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Republik Korea, Koreanisch Health Technology R & D Projekt (HI16C1012), Ministerium für Gesundheit & Wohlfahrt, Republik Korea und dem "Dongwha" Faculty Research Assistance Program der Yonsei University College of Medicine (6-2016-0126).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Hypoxische KammerJeung Do Bio & Plant CoExperimental Builder
PAT GerätJeung Do Bio & Plant CoExperimental Builder
Die Leitersprosse zu FußJeung Do Bio & Plant CoExperimental Builder
SDI Grip Strength SystemSan Diego Instruments Inc.
Grip-Strength MeterUgo Basile47200
Harvard Apparatur Fluovac Anästhesiesystem Harvard Apparat
AnästhesieboxAcryl Box
I-Fran Flüssigkeit (Isofluoran)Hana Pharm. Co., Ltd.Allgemeinanästhetika (Isofluran 100ml)
CD-1 MäuseOrient Co., Ltd.
Blau Nylon Mono Nicht resorbierbare Naht 5-0 50cmAilee Co., Ltd.NB 521
IBM SPSS StatistikIBMVer. 23

Referenzen

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Schlagwörter

Einseitige HalsschlagaderligaturPassives VermeidungsverhaltenLeiterlauf TestGriffkrafttestMRT BildgebungBeurteilung kortikaler VerletzungenHippocampusl sionmotorische Defizite

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