Die Erhaltung der Blut-Hirn-Schranke Abdeckung ist der Schlüssel für die Homöostase des zentralen Nervensystems. Dieses Protokoll beschreibt in vitro- Techniken, um die fundamentalen und pathologischen Prozesse abzugrenzen, die die Blut-Hirn-Schrankenabdeckung modulieren.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
In-Vitro- Assays zur Beurteilung der Blut-Hirn-Schranke Mesh-artigen Gefäßbildung und -störung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Blut-Hirn-Schranke (BBB) Abdeckung spielt eine zentrale Rolle in der Homöostase des zentralen Nervensystems (ZNS). Die BBB wird dynamisch durch Astrozyten, Perizyten und Hirn-Endothelzellen (BECs) gehalten. Hier stellen wir Methoden zur Beurteilung der BBB-Berichterstattung über einzelne Kulturen von verewalisierten menschlichen BECs, einzelne Kulturen von primären Maus-BECs und ein humanisiertes Triple-Kulturmodell (BECs, Astrozyten und Perizyten) der BBB vor. Um die Anwendbarkeit der Assays auf Krankheitszustände hervorzuheben, beschreiben wir die Wirkung von oligomeren Amyloid-β (oAβ), was ein wichtiger Faktor für die Alzheimer-Krankheit (AD) -Progression bei der BBB-Abdeckung ist. Weiterhin nutzen wir den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), um das Arzneimittel-Screening-Potential der Techniken zu beleuchten. Unsere Ergebnisse zeigen, dass einzelne und dreifach kultivierte BECs unter basalen Bedingungen meshwork-ähnliche Strukturen bilden und dass oAβ diese Zell-Mesh-Formation stört und die vorgeformten Mesh-Strukturen degeneriert,Aber EGF blockiert diese Störung. So sind die beschriebenen Techniken für die Sezierung von fundamentalen und krankheitsrelevanten Prozessen wichtig, die die BBB-Abdeckung modulieren.
Einleitung
Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) von zerebralen Kapillaren ist die grösste Schnittstelle von Blut-zu-Gehirn-Kontakt und spielt eine zentrale Rolle in der Homöostase des Zentralnervensystems (ZNS) 1 , 2 . Die dynamischen Prozesse am BBB verhindern die Aufnahme von unerwünschten Molekülen aus dem Blut, entfernen Abfallprodukte aus dem ZNS, liefern dem NZS wesentliche Nährstoffe und Signalmoleküle und modulieren die Neuroinflammation 1 , 2 , 3 , 4 , 5
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Alle Experimente folgen der University of Illinois, Chicago Institutional Animal Care und Use Committee Protokolle.
1. Allgemeine Vorbereitung
HINWEIS: Die mikrovaskuläre Endothelzelllinie des Gehirns (hCMEC / D3) ist eine weitgehend charakterisierte immortalisierte menschliche BEC-Linie 14 , 15 , 16 , 18 , 19 . Kultur die hCMEC / D3-Zellen auf Gewebekulturkolben, die mit Kollagen beschichtet sind Typ I (Kalbshaut, 1:20 Verdünnung von 0,1% iger Lösung....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
In einzelnen Kulturen bilden sowohl die hCMEC / D3-Zellen ( Fig. 3A ) als auch die primären Maus-BECs ( Fig. 3B ) in der Wanne Mesh-ähnliche Strukturen. Die Strukturen zeichnen sich durch ein Netz von miteinander verbundenen Knoten aus ( Abbildung 3 ). In allen beschriebenen Paradigmen ( Abbildung 1 ) sind die maschenartigen Strukturen nach 24 h in den Kontrollgruppen ä.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Die beschriebenen Methoden können genutzt werden, um mehrere grundlegende biologische Fragen um die zerebrovaskuläre Abdeckung zu adressieren 24 . Insbesondere können sie identifizieren, welche Rezeptoren und Signalwege eine Rolle bei der Angiogenese, der Gefäßabdeckung im Krebsgewebe und den peripheren Endothelzellen spielen, die für das Gehirn relevant sind. Beispiele umfassen angiogene Wachstumsfaktor-Rezeptoren, Stickstoffmonoxid, Mitogen-aktivierte Proteinkinase-Signalisierung und Calcium-Si.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Leon Tai wird von der University of Illinois Chicago Start-up-Fonds finanziert.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| hCMEC/D3-Zellen | Milipore | SCC066 | |
| EBM-2 Basalmedien | Lonza | CC-3156 | |
| Kollagen Typ 1 | ThermoFisher | A1064401 | |
| HBSS, Calcium, Magnesium, kein Phenolrot | ThermoFisher | 14025092 | |
| HBSS, kein Calcium, kein Magnesium, kein Phenolrot | ThermoFisher | 14175095 | |
| Trypsin-EDTA (0,25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Endkonzentrationen der SingleQuot Wachstumsfaktor-Ergänzungsmittel für EBM2-Medien | Lonza | CC-4147 | |
| 5% FBS | Lonza CC-4147 | ||
| 10% Ascorbinsäure | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Gentamycinsulfat | Lonza | CC-4147 | |
| 25% Hydrocortison | Lonza | CC-4147 | |
| 1/4 Volumen der zugeführten Wachstumsfaktoren: Fibroblasten-Wachstumsfaktor, epidermaler Wachstumsfaktor, insulinähnlicher Wachstumsfaktor, vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor | Lonza | CC-4147 | |
| Puromycinhydrochlorid | VWR | 80503-312 | |
| MEM-HEPES | Thermo Scientific | 12360-038 | |
| Papainzell-Dissoziationssystem (Papain und DNase1) | Worthington Biochemisches | LK003150 | |
| Menschliche Perizyten | Sciencell | 1200 | |
| Perizyten Basalmedien | Sciencell | 1201 | |
| Perizyten Wachstumsergänzung | Sciencell | 1252 | |
| Menschliche Astrozyten | Sciencell | 1800 | |
| Astrozyten Medien | Sciencell | 1801 | |
| Astrozyten Wachstumsergänzungsmittel | Sciencell | 1852 | |
| Basalmembran (Matrigel Wachstumsfaktor reduziert) | Corning | 356231 | |
| Angiogenesis m-Platten (96-Well) | ibidi | 89646 | |
| Human Epidermal Growth Factor | Shenendoah Biotechnology | 100-26 | |
| CellTracker grün | ThermoFisher | C7025 | |
| CellTracker | orange ThermoFisher | C34551 | |
| CellTracker blau | ThermoFisher | C2110 | |
| Poly-l-Lysin | Sciencell | 0403 | |
| 10% neutral gepuffertes Formalin | Sigma-Aldrich | HT5012-60ML | |
| C57BL Mäuse | Jackson Laboratory | na | |
| PCR Röhrchenstreifen | GeneMate | T-3014-2 | |
| Zeiss stereo discover v.8 Präpariermikroskop | Zeiss | na |
Referenzen
- Abbott, N. J. Blood-brain barrier structure and function and the challenges for CNS drug delivery. J Inherit Metab Dis. 36 (3), 437-449 (2013).
- Engelhardt, B., Liebner, S. Novel insights into the development and maintenance of the blood-brain bar....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
