Summary
الحفاظ على تغطية حاجز الدم في الدماغ هو المفتاح لتوازن الجهاز العصبي المركزي. يصف هذا البروتوكول في تقنيات المختبر لترسيم العمليات الأساسية والمرضية التي تعدل تغطية حاجز الدم في الدماغ.
Abstract
تلعب حاجز الدم في الدماغ (بب) دورا محوريا في توازن الجهاز العصبي المركزي (نس). يتم الحفاظ على حيوي بب بواسطة الخلايا النجمية، بيريسيتس والخلايا البطانية في الدماغ (بيكس). هنا، نحن بالتفصيل أساليب لتقييم تغطية بب باستخدام الثقافات واحدة من بيكس الإنسان الخالد، والثقافات واحدة من بيك الأساسي الماوس، ونموذج الثقافة الثلاثي أنسنة (بيكس، النجمية و بيريسيتس) من بب. لتسليط الضوء على تطبيق المقايسات لحالات المرض، ونحن تصف تأثير أميلويد أوليغوميريك β (oAβ)، الذي هو مساهم مهم في مرض الزهايمر (أد) التقدم، على تغطية بب. وعلاوة على ذلك، فإننا نستخدم عامل نمو البشرة (إغف) لإلقاء الضوء على إمكانية فحص المخدرات من التقنيات. نتائجنا تبين أن واحدة وثلاثية بيكس مثقف تشكل هياكل تشبه شبكة في ظل الظروف القاعدية، وأن oAβ يعطل هذه التشكيل خلية تشكيل ويتحول الهياكل شبكة بريفورمد،ولكن إغف يمنع هذا الاضطراب. وبالتالي، فإن التقنيات الموصوفة مهمة لتشريح العمليات الأساسية والمرض ذات الصلة التي تعدل تغطية بب.
Introduction
الحاجز الدموي الدماغي (بب) من الشعيرات الدموية الدماغية هو أكبر واجهة من الدم إلى الدماغ الاتصال ويلعب دورا رئيسيا في التوازن من الجهاز العصبي المركزي (نس) 1 ، 2 . العمليات الحيوية في بب منع امتصاص الجزيئات غير المرغوب فيها من الدم، وإزالة النفايات من الجهاز العصبي المركزي، وتوفير المواد الغذائية الأساسية وجزيئات الإشارة إلى الجهاز العصبي المركزي، وتعديل نيوروينفلاماشيون 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 . تلف بب هو السائد خلال الشيخوخة والعديد من الاضطرابات العصبية بما في ذلك مرض الزهايمر (أد)، والتصلب المتعدد والسكتة الدماغية 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 ،أس = "كريف"> 6. لذلك، قد تلعب خلل بب دورا رئيسيا في الاضطرابات العصبية، بما في ذلك كهدف علاجي.
الحفاظ على تغطية السفينة مهم لوظائف التماثل من بب. ومع ذلك، في الجسم الحي وفي المختبر تضارب البيانات على ما إذا كانت العمليات التي تنطوي على الاضطرابات العصبية تسبب أعلى أو أقل تغطية بب 6 ، 7 ، 8 ، 9 ، 10 ، 11 ، 12 ، 13 ، وخاصة في م. لذلك، هناك مبرر قوي لتطوير نماذج في المختبر باستخدام أنواع الخلايا ذات الصلة لتقييم وفهم شامل لديناميات تغطية بب. وتتكون الشعيرات الدموية الدماغي من الخلايا النجمية، بيريسيتس والخلايا البطانية الدماغ (بيكس)
هنا، يتم تفصيل أساليبنا السابقة 17 لتقييم تغطية بيك والهياكل الشبيهة بالشبكات باستخدام ثقافات واحدة من بيكس الإنسان الخالدة، والثقافات واحدة من بيك الأساسي الماوس، وثلاثة ثقافة إنسانيةنموذج (بيكس، أستروسيتس و بيريسيتس) من بب. وكان الهدف هو إظهار الأثر الضار لل OAβ، الذي يعتبر مساهما هاما في تقدم أد، على تغطية بيك. تأثير وقائي من عامل نمو البشرة (إغف) يسلط الضوء على إمكانات هذه التقنية كأداة الفحص العلاجي. هذه التقنية لديها العديد من التطبيقات واسعة للبحوث الأساسية والتطبيقية بما في ذلك: 1) تحديد دور مسارات محددة على الأوعية الدموية وتغطية السفينة، 2) تقييم آثار المرض والشيخوخة ذات الصلة العوامل على الأوعية الدموية وتغطية السفينة، و 3) تحديد الدوائية أهداف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع التجارب تتبع جامعة إلينوي، شيكاغو المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام بروتوكولات اللجنة.
1. الإعداد العام
ملاحظة: الدماغ خط الأوعية الدموية الدقيقة الخلايا البطانية (هميك / D3) هو وصفت على نطاق واسع خط بيك الإنسان خلد 14 ، 15 ، 16 ، 18 ، 19 . ثقافة الخلايا هميك / D3 على قوارير زراعة الأنسجة المغلفة مع الكولاجين النوع الأول (جلد العجل، 1:20 التخفيف من محلول 0.1٪ في حل الملح المتوازن هانك (هبس) التي تحتوي على كا 2 + و مغ 2+ ) في النمو البطاني القاعدية المتوسطة القاعدية (إب-2) التي تحتوي على 2-5٪ مصل بقري جنيني (فبس) و 10٪ حامض الاسكوربيك و 10٪ كبريتات جنتاميسين و 25٪ هيدروكورتيزون و 1/4 من الحجم الكلي لعامل النمو المضافات المكملة لكل 500 مل من الوسائط [ الأوعية الدموية البطانة غروعامل نمو البشرة (إغف)، وعامل النمو الشبيه بالانسولين 1 (إيغف-1)، وعامل النمو الليفي الأساسي البشري (بفغف)، انظر جدول المواد ].
ملاحظة: يشار إلى المتوسطة إب-2 مع فبس وعوامل النمو باسم "إيب-2 كاملة". ويشار إلى إب-2 دون فبس والمكملات الغذائية باسم "إب-2 القاعدية". في التقاء الكامل، والخلايا هميك / D3 هي ~ 1 × 10 5 خلايا / سم 2 .
- مرور الخلايا هميك / D3 بنسبة 1: 5 قبل احتضان لأول مرة مع هبس لمدة 3 دقائق دون كا 2 + و مغ 2+ تليها مفرزة مع 5 مل التربسين / إدتا (0.25٪) لمدة 5 دقائق. تحييد التربسين باستخدام إب-2 كاملة (1: 1 تحييد)، وأجهزة الطرد المركزي في 290 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل طاف. ريسوسبيند الكرية في إب-2 كاملة وإعادة لوحة في نسبة 1: 5.
- ثقافة بيريسيتس الإنسان الأساسية والنجمية وفقا لبروتوكول المورد [ جدول المواد ]. الثقافيهه بيريسيتس في المتوسطة القاعدية بريسيت مع فبس وتكملة نمو بيريسيت.
- ثقافة الخلايا النجمية البشرية في المتوسطة النجمية التي تحتوي على عوامل نمو الخلايا النجمية. ثقافة كل من بيريسيتس و النجمية في قوارير زراعة الأنسجة المغلفة مع 3 مل من بولي L- يسين (بل) لالتزام الخلايا والاستفادة من الخلايا بين الممرات 2 و 5.
- الموت ببطء 7 الفئران وإزالة ينبع الدماغ و سيريبيلا مع ملقط. فصل السحايا عن طريق المتداول بعناية العقول على الشاش. يفرز أنسجة المخ المتبقية في طبق بتري في الحد الأدنى الأساسية المتوسطة (ميم) مع هيبيس (5 مل في الدماغ) مع شفرة الحلاقة العقيمة. عزل بيكس الماوس الأساسي من الفئران C57BL / 6J منذ شهرين من العمر وفقا للبروتوكول المشار إليه 20 .
- نقل أنسجة المخ المفروم إلى أنبوب مخروطي 15 مل. أجهزة الطرد المركزي في 290 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف واحتضان الأنسجة في غشاء (833.33 ميكرولتر لكل الدماغ) والدناز (41.7 ميكرولتر في الدماغ)الحل، في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، لهضم الأنسجة.
- تساوق التجانس بالتتابع من خلال 19 و 21 الإبر قياس، وخلط في نسبة 1: 1 مع 22٪ البقري مصل الزلال (بسا) الحل، وأجهزة الطرد المركزي في 1360 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- ريسوسبيند الناتجة بيليه في 1 مل إب-2 كاملة وأجهزة الطرد المركزي في 290 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. ريسوسبيند مرة أخرى في 1 مل إب-2 كاملة وصفيحة الخلايا (1 مل / جيدا) على 6 لوحات جيدا المغلفة مع الكولاجين (~ 1 الدماغ لكل بئر).
- استبدال وسائل الإعلام 24 ساعة في وقت لاحق مع إب-2 كاملة تحتوي على 4 ميكروغرام / مل هيدروكلوريد البوروميسين. استبدال مع إب-2 كاملة بعد 2 أيام. يتم استزراع بيك الأولية كما لخلايا هميك / D3 وتكون في التقاء الكامل في 1 × 10 5 خلايا / سم 2 .
- إعداد 100 ميكرومتر من oAβ، 24 ساعة قبل الفحص.
ملاحظة: يعتبر OA the شكل المرض ذات الصلة من A. ل oAβ، استخدام الاستعدادات التي تتميز جيدا وصفها دالغرn إت آل. 21- - ذوبان الجليد الغشاء القاعدي حل المخزون بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية وقسامة في شرائط أنبوب العقيمة ير (8 أنابيب) في 140 ميكرولتر الغشاء القاعدي لكل أنبوب. إعادة تجميد كل قطاع ومخزن في -20 درجة مئوية. ذوبان الجليد شريط واحد لكل لوحة 96 جيدا في 4 درجات مئوية، 24 ساعة قبل الفحص. قبل تبريد نصائح ماصة لتجنب التصلب.
ملاحظة: يجب أن تتم جميع التعامل مع مصفوفة الغشاء القاعدي على الجليد لتجنب التصلب السريع. كما يتم استخدام 10 ميكرولتر لكل بئر من غشاء الطابق السفلي في يوم الفحص، كل قطاع يكفي لواحد 96 لوحة جيدا. - احتضان بيكس متموجة بشكل كامل في إب-2 القاعدي، 24 ساعة قبل الفحص.
ملاحظة: الأساس المنطقي هو: إب-2 كاملة يحتوي على العوامل المستكملة و فبس بهدف تعزيز نمو الخلايا الأمثل. ومع ذلك، فإن المسارات الجزيئية نفسها التي تعزز نمو الخلايا هي أيضا مهمة لتغطية الخلايا البطانية الدماغ والديناميات، سواء في وجود و أبسنس من الإجهاد. لذلك نحن مصل و تكملة تجويع بيكس للحد من تأثير مربكة من تفعيل المتبقية من مسارات الإشارات الخلوية. من المذكرة، وخلايا لفترة وجيزة (5 دقائق) تتعرض ل فبس خلال تحييد الخلايا تريبسينيزد قبل الفحص. على النقيض من بيك، و بيريسيتس والنجمية ليست المصل جوعا، وذلك بسبب متطلبات عوامل مختلفة للنمو وعدم الاستقرار النسبي من هذه الأنواع من الخلايا ردا على المجاعة في الدم (مختبر تاي، ملاحظات غير منشورة).
ملاحظة: يتم استخدام إب-2 القاعدية خلال الفحص لتشكيل شبكة واحدة وثلاثية ثقافة وتشويهات الفوضى. هذا أمر بالغ الأهمية لمنع تشويش الخلط أو العلاج تعتمد الإشارات.
2. تشبه تشبه الفحوصات وتشكيل
- المقايسات ثقافة بيك واحد:
ملاحظة: وترد ثلاثة نماذج مختلفة للثقافات واحدة من بيك في الشكل 1A - في يوم الفحص، ماصة مصفوفة الغشاء القاعدي في 10 ميكرولتر / جيدا في الجزء السفلي من لوحات 96 جيدا وتسمح لضبط لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- تعليق المجففة بالتجميد خلية خضراء تتبع صبغ (انظر جدول المواد ) في 10 ميكرولتر دمسو لتوليد حل الأسهم 10 ملم، وتمييع إلى 10 ميكرومتر (1: 1000) في إب-2 القاعدية. إزالة وسائل الإعلام من قارورة متموجة بالكامل واستبدالها مع إب-2 القاعدية التي تحتوي على خضراء تتبع صبغ (5 مل ل 75 سم 2 قارورة). التحميل المسبق بيك مع الخلية الخضراء تتبع صبغ، 20 دقيقة قبل بدء الفحص.
- احتضان الخلايا لمدة 20-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، وإزالة المتوسطة مع خلية تتبع صبغ، وفصل الخلايا كما هو موضح في الخطوة 1.1. تحييد وسائل الإعلام مع إب-2 تحتوي على 10٪ فبس وأجهزة الطرد المركزي في 240 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. ريسوسبيند بيليه في 1 مل من إب-2 القاعدية.
- لوحة بيكس في لوحة 96 جيدا في 10000 الخلايا / حسنا في إب-2 القاعدية (0 ساعة نقطة في جميع النماذج).
ملاحظة: اعتمادا على النموذج يجري استخدامها، يتم إضافة العلاجات، والإجهاد، أو الضوابط السيارة في نقاط زمنية محددة. في جميع النماذج، يتم حصاد المتوسط لتحليل لاحق (على سبيل المثال تحليل إليسا) والخلايا ثابتة في 24 ساعة مع بارافورمالدهيد 4٪ الطازجة في مصل الفوسفات مخزنة (بس). كنهج بديل لتحديد مصطلح آثار oAβ على تشكيل شبكة، يمكن تعديل البروتوكول إلى ما قبل احتضان قوارير ثقافة الخلايا متموجة مع oAβ، ومن ثم تنفيذ نماذج تشكيل شبكة (+/- oAβ).
ملاحظة: الحجم النهائي في كل بئر لجميع النماذج هو 70 ميكرولتر. جميع العلاجات (oAβ، إغف، وما إلى ذلك ) تضاف إلى الآبار الخاصة بهم في التخفيف 1:20 أي 3.5 ميكرولتر لكل معاملة. ل باراديجم 1، يتم إضافة الخلايا في حل تعليق خلية في 63 ميكرولتر / ثالذراع. على الفور oAβ، والعلاجات المطلوبة، ويضاف الضوابط في 3.5 ميكرولتر / جيدا لكل منهما، وإعطاء ما مجموعه 70 ميكرولتر. ل باراديجم 2، يتم إضافة 63 ميكرولتر من تعليق الخلية و 3.5 ميكرولتر من العلاج (على سبيل المثال 100 نانوغرام / مل إغف) عند 0 ساعة نقطة الوقت. بعد 4 ح الحضانة، يتم إضافة 3.5 ميكرولتر من الأسهم OA ((على سبيل المثال ل 100 نانومتر التركيز OA final النهائي، 3.5 ميكرولتر من 2 ميكرومتر الأسهم OA)). ل باراديجم 3، يتم إضافة 63 ميكرولتر من تعليق خلية عند نقطة 0 ساعة و 4 ساعة، oAβ ويتم إضافة العلاجات المطلوبة في 3.5 ميكرولتر / جيدا كل، مما مجموعه ما مجموعه 70 ميكرولتر. هذه المجلدات يمكن تعديلها وفقا للمعالجات. على سبيل المثال، إذا كان مطلوبا فقط علاج واحد، ويمكن تعديل حجم تعليق الخلية إلى 66.5 ميكرولتر (الحفاظ على 10،000 خلية / بئر) وحجم العلاج يمكن أن تبقى في 3.5 ميكرولتر.
ملاحظة: بالإضافة إلى المقايسات ثقافة واحدة من بيك، لدينا تطوير(نموذج 1B ) لتحديد استجابة بيكس، بيريسيتس، والنجمية داخل الشبكات سابقة التشكيل إلى الضغوطات ذات الصلة (على سبيل المثال oAβ). يتم مطلي بيك في وجود العلاجات المطلوبة في 0 ساعة. في 4 ساعات، يتم إضافة بيريسيتس بلطف إلى لوحة. في 7 ساعة، تضاف النجمية إلى لوحة، تليها إضافة إجهاد في 11 ساعة. ثم يتم احتضان الخلايا حتى 24 ساعة نقطة الوقت.
ملاحظة: لفحوصات ثقافة الثلاثي، فمن المهم النظر في توقيت لضمان جميع الخلايا متكدسة في نفس الوقت. وينبغي استزراع الخلايا النجمية البشرية و بيريسيتس 1 أسبوع قبل الفحص، في حين أن الخلايا هميك / D3 تحتاج إلى أن تكون مطلية أو ممر 4-5 أيام قبل تاريخ الفحص. وعلاوة على ذلك، فمن المهم استخدام مرور منخفض (2-5) الخلايا الأولية لتجنب الانجراف المظهري.
- إضافة خلية خضراء تتبع صبغ حل العمل لخلايا هميك / D3 20 دقيقة قبل بدء الفحص. لوحة هميك / خلايا D3 في 10، 000 خلية / جيدا في إب-2 القاعدية (0 ساعة نقطة الوقت). وحدات التخزين المستخدمة هي 45 ميكرولتر من تعليق الخلية و 3.5 ميكرولتر من العلاج ( أي تركيزات إغف النهائية من 50 نانوغرام / مل، 100 نانوغرام / مل، أو 1000 نانوغرام / مل من الأسهم التي هي أكثر تكرارا 20 مرة).
- بعد الحضانة 3.5 ساعة في 37 درجة مئوية، إضافة الخلية الزرقاء تتبع صبغ حل العمل (10 ميكرومتر خلية تعقب الأزرق في إب-2 القاعدية) إلى بيريسيتس الابتدائي البشري. في نقطة ح 4 ساعة (~ 30 دقيقة الحضانة مع خلية تتبع صبغ)، إضافة بلطف 2000 بيريسيتس / جيدا إلى لوحة تحتوي على هميك / D3 في حجم 6 ميكرولتر / جيدا.
- بعد 2.5 ساعة إضافية الحضانة (مجموع 6.5 ساعة من 0 ساعة نقطة الوقت)، إضافة البرتقال تتبع خلية حل صبغ العمل (10 ميكرومتر خلية تعقب البرتقال في إب-2 القاعدية) إلى الخلايا النجمية الأولية الإنسان. في نقطة الوقت 7 ساعة، إضافة بلطف 10،000 النجوم النجمية / جيدا إلى لوحة في 12 حجم ميكرولتر. ولذلك، فإن نسبة الخلوية الإجمالية للخلايا البطانية: بيريسيتس: أستروسيتس طs 5: 1: 5. وعلاوة على ذلك، فإن حجم تحقيق هذه النقطة هو 66.5 ميكرولتر.
- إضافة oAβ (3.5 ميكرولتر من الأسهم 100 ميكرومتر) 4 ساعات في وقت لاحق (مجموع 11 ساعة من 0 ساعة نقطة الوقت).
- إصلاح الخلايا 13 ساعة في وقت لاحق في بارافورمالدهيد 4٪ الطازجة في برنامج تلفزيوني.
تنبیھ: ارتدي ملابس واقیة وقفازات ونظارات أثناء التعامل مع بارافورمالدھاید.
3 - التحديد الكمي
- التقاط الصور مضان للبئر كله من لوحة 96 جيدا في 1.6X التكبير مع 2 ثانية وقت التعرض في 50٪ الطاقة القصوى باستخدام المجهر تشريح.
ملاحظة: المجاهر المكافئة يمكن استخدامها. ومع ذلك، فإنه من الأهمية بمكان لالتقاط البئر بأكمله لتحليل شامل. - للتحليل الكمي، معالجة الصور باستخدام إيماجيج الأوعية الدموية محلل المساعد 22 لتحديد عدد من الفروع، وعدد من تنسجم، وإجمالي طول الخلية (يتم قراءتها هذه القراءات تلقائيا من قبل سوفتواري) كما هو موضح أدناه. ويرد بروتوكول بصري مفصل من هذه الخطوة في الشكل 2 .
- فتح فيجي إيماجيج من خلال النقر على أيقونة البرنامج.
- انقر على الأسهم الحمراء الحمراء المزدوجة الموجودة في نهاية شريط الأدوات، ثم انقر فوق "محلل الأوعية الدموية".
- حدد المجلد مع ملفات الصور، انقر فوق "فتح".
- عندما يظهر مربع "إعدادات للتحليل"، انقر فوق "موافق".
- عند ظهور مربع "معالجة الصور"، مما يشير إلى عدد الصور المراد معالجتها، انقر فوق "موافق".
- عند ظهور مربع "نافذة تقدم الدفعة"، مما يشير إلى وقت المعالجة المقدر. خلال هذا الوقت البرنامج يحدد النواتج بما في ذلك عدد من الفروع، وعدد من تنسجم، وإجمالي طول الخلية.
ملاحظة: بمجرد أن يتم تحديد كل الصور، سيظهر ملف النتائج في مجلد الصورة الأصلي كوثيقة جدول بيانات. - تحديدملف جدول البيانات التي تحتوي على نتائج ومقارنة عدد من الفروع، تنسجم ومجموع طول الخلية بين المجموعات.
ملاحظة: في مقايسة الثقافة الثلاثي يتم استخدام إيماجيج أيضا لتحليل التغطية بيراسيت / النجمية وعدد. يتم عتبة الصور من قبل المجرب أعمى و "تحليل الجسيمات" وظيفة تستخدم لتوليد قراءات. ويمكن أيضا خلايا ثابتة وأنابيب تشبه الهياكل تكون إمونوستيند ل Aβ 17 أو علامات أخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في الثقافات واحدة، على حد سواء خلايا هميك / D3 ( الشكل 3A ) و بيس الأساسي الماوس ( الشكل 3B ) شكل هياكل تشبه شبكة في جميع أنحاء البئر. وتتميز الهياكل بشبكة من العقد المترابطة ( الشكل 3 ). في جميع النماذج وصفها ( الشكل 1 )، هياكل تشبه شبكة متشابهة بعد 24 ساعة في مجموعات السيطرة، وتشكيل ~ 20 هياكل تشبه شبكة مع طول الخلوي الكلي ~ 10000 بكسل.
لتسليط الضوء على قابلية تطبيق أساليب الإجهاد ذات الصلة بالمرض، تمت إضافة oA to إلى هميك / D3 و بيك الأساسي الماوس في نموذجين. في انقطاع تشكيل شبكة شبكية (النموذج 1)، oAβ والخلايا مطلي في نفس الوقت. في تعطيل شبكة مشبكة (النموذج 2)، oAβ هو إضافةإد 4 ساعة بعد طلاء الخلايا (انظر الشكل 1A ). oAβ في 100 نانومتر يؤدي إلى تعطيل تشبه تشكيل شبكة وتشوه من شبكة بريفورمد ( الشكل 3A ، 3B ). على سبيل المثال، باستخدام الخلايا هميك / D3 في كلا النموذجين، والتقدير الكمي من إجمالي التغطية خلية / طول هو 16-20٪ أقل مع 100 نانومتر 17A. وعلاوة على ذلك، يتم تقليل عدد من تنسجم بنسبة 40٪ مع 100 نانومتر OAβ في كلا النموذجين 17 . وبالتالي، فإن مرض الإجهاد ذات الصلة يؤدي إلى تأثير ضار مماثل على الإنسان والفئران بيك التغطية.
وهناك ميزة رئيسية لنظام زراعة الخلايا هو القدرة على تحديد العوامل أو العلاجات التي تمنع الأضرار ذات الصلة بالأمراض، والتي يمكن بعد ذلك التقدم إلى اختبار في الجسم الحي . وكدليل على التجربة المبدئية، فإن تأثيرات عوامل النمو الوعائية الرئيسية على منع تشا أوا المستحثة( 17) . منع إغف الأضرار التي يسببها OA to للخلايا هميك / D3. واستنادا إلى تلك البيانات، تم اختبار إغف في نموذج الوقاية باستخدام نموذج الفأر المعدلة وراثيا الذي يلخص الجوانب الحرجة من الأمراض مثل أد. إغف العلاج منع العجز المعرفي و بب، بما في ذلك انحطاط السفينة 23 . هذه البيانات تدعم الإمكانات التنبؤية للنظام في المختبر لفي الجسم الحي النشاط. حاليا، ونحن الاستفادة من جميع النماذج الثلاثة المتقدمة للفحص: 1) تشكيل شبكة، 2) الوقاية من خلل شبكة الشبكات، و 3) علاج في وقت واحد من انقطاع الشبكة. كما هو مبين في الشكل 3 ، إغف يمكن أن تحمي ضد الأضرار التي يسببها OA in في الخلد والماوس الأساسي بيك الثقافات.
يتكون بب من بيكس، بيريسيتس و النجمية التي تساهم بشكل جماعي في سيربروفاسك الشاملتغطية أولار. لذلك، واحد التكيف من النظام في المختبر هو دمج جميع أنواع الخلايا بب الثلاثة. لدينا الثلاثي نموذج فحص الثقافة يتضمن خلايا هميك / D3، بيريسيتس الإنسان الأولية والنجمية الأساسية الإنسان، والتي تضاف بالتتابع إلى مصفوفة الغشاء القاعدي ( الشكل 1B ). في الثلاثي نموذج فحص الثقافة، والخلايا هميك / D3 تشكل نمط شبكي مماثل كما هو الحال في الثقافات واحدة، ولكن مع بيريسيتس و أستروسيتس تعلق على العقد وربط فروع ( الشكل 4 ). إضافة 100 نانومتر OAβ يؤدي إلى تعطيل شبكة (~ 10-15٪) وانخفاض في عدد بيريسيتس الاتصال بيكس 17 . في ارتباط مع البيانات المستمدة من نماذج فحص ثقافة واحدة، يتم منع الضرر الناجم عن OA by من قبل العلاج إغف. وهكذا، وثلاثة ثقافة نموذج بب مناسبة تماما للدراسات التي تركز على التأثيرات التفاعلية من الخلايا النجمية، بيريكييتس و بيك على ديناميات السفينة.
الشكل 1: نظرة عامة على تشكيل شبكة وتشويه المقايسات. ( A ) واحدة نماذج فحص الثقافة. النموذج 1، تشكيل شبكة. يتم إضافة الخلايا، والضواغط والعلاجات إلى لوحة في 0 ساعة نقطة الوقت. النموذج 2، منع انقطاع الشبكة. يتم مطلي الخلايا في وجود العلاجات المطلوبة، المحتضنة لمدة 4 ساعات، ويتم إضافة الإجهاد في نقطة الوقت 4 ساعة. النموذج 3، علاج في وقت واحد من انقطاع شبكة. الخلايا مطلية وسمحت بتشكيل هياكل تشبه الشبكه لمدة 4 ساعات قبل إضافة العلاجات و / أو الضغوطات في وقت واحد عند نقطة الوقت 4 h. جميع النماذج تنتهي في 24 ساعة نقطة الوقت، ويتم إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 4٪. ( B ) الثلاثي نموذج مقايسة الثقافة. بيكس (10000 خلية / بئر) هي مطلية في بريزمن العلاجات المطلوبة في 0 ساعة. في نقطة ح 4 ساعة بيريسيتس (2،000 خلية / بئر) يتم إضافتها بلطف إلى لوحة. في 7 ساعة أستروسيتس (10،000 خلية / بئر) تضاف إلى لوحة، تليها إضافة الضغوطات ذات الصلة في 11 ساعة. ثم يتم تحضين الخلايا حتى 24 ساعة نقطة الوقت وثابتة مع بارافورمالدهيد 4٪. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التحليل الكمي. يتم فتح جميع الصور على فيجي إيماجيج ودفعت معالجتها باستخدام محلل أنجيوجينيسيس 22 . يتم استخدام الكمي من الطول الكلي وعدد من تنسجم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من t شخصية له.
الشكل 3: مشاعل فواصل المقايضة: صور ممثل. وتستمد جميع الصور من التجارب التي تستخدم باراديجم 2، انقطاع شبكة. ( A ) صور الممثل للخلايا هميك / D3 مطلي ومعالجتها مع مراقبة المركبات (فك)، إغف (100 نانومتر)، أوا (100 نانومتر)، أو oAβ (100 نانومتر) + إغف (100 نانومتر). الصور في 10X التكبير، شريط مقياس = 100 ميكرون. ( B ) صور ممثل الماوس الأساسي الماوس مطلي ومعالجتها مع فك، إغف (100 نانومتر)، oAβ (100 نانومتر) أو oAβ (100 نانومتر) + إغف (100 نانومتر). الصور في 10X التكبير، الأخضر = بيس، شريط مقياس = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
المحافظة على together.within الصفحات = "1"> 
الشكل 4. فحص الثقافة الثلاثي: صور ممثل. ( A ) صور الممثل للخلايا هميك / D3، بيريسيتس الإنسان الأساسي، والنجمية البشرية الأساسية مطلي ومعالجتها مع فك، إغف (100 نانومتر)، أوا (100 نانومتر)، أو oAβ (100 نانومتر) + إغف (100 نانومتر) وفقا لنموذج وصفها في الشكل 1B . الصور في 10X التكبير والأخضر = بيكس، الأزرق = بيريسيتس، والأحمر (بسيودوكولور) = الخلايا النجمية. شريط مقياس = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الأساليب المذكورة يمكن استخدامها لمعالجة العديد من الأسئلة البيولوجية الأساسية المحيطة بالتغطية الدماغية الوعائية 24 . على وجه التحديد، فإنها يمكن أن تحدد أي المستقبلات ومسارات الإشارات تلعب دورا في الأوعية الدموية، وتغطية السفينة في أنسجة السرطان، والخلايا البطانية الطرفية ذات الصلة إلى الدماغ. ومن الأمثلة على ذلك مستقبلات عامل النمو الوعائي، وأكسيد النيتريك، وتشكيل بروتين كيناز المنشط من الميتوجين وتشوير الكالسيوم 25 ، 26 ، 27 . و هميك / D3 و بيك الأساسية قابلة للتعديل لنهج ضربة قاضية وراثية لتسهيل هذا الجهد 18 . ويمكن الحصول على البصيرة الميكانيكية من زراعة بيكس معزولة من الفئران مع ضربة قاضية كاملة أو البطانية محددة الخلية من البروتينات الرئيسية مع الأساليب المذكورة. وعلاوة على ذلك، فإن المقايسات ثقافة الثلاثي تمكين تحليل متعمق من النجمية وتأثير بيريسيته على الدماغ وظيفة الخلايا البطانية. على سبيل المثال، بيريسيتس و أستروسيتيس يمكن أن تؤثر على تشكيل شبكة تشبه شبكة من خلال إنتاج وسطاء قابل للذوبان (على سبيل المثال أنجيوبوييتين، السيتوكينات) وأيضا عن طريق الدعم الهيكلي 24 .
ويمكن تطبيق النظام النموذجي أيضا على أبحاث الأمراض. على سبيل المثال، يمكن للنظام معالجة ما إذا كانت عوامل الإجهاد المرتبطة بالشيخوخة والشيخوخة تضاف تعزيزا خارجيا لتوليد الأوعية و / أو تعطل الشبكات. يمكن أن تكون الضغوط ذات صلة باضطراب معين، على سبيل المثال oAβ، أو أكثر عمومية، مثل بيروكسيد الهيدروجين، السيتوكينات. نموذج الثقافة الثلاثي يضيف طبقة إضافية من التعقيد التي قد تحسن فهم الآليات الهامة ذات الصلة بالمرض التي تؤثر على ديناميات بب: تحديد ما إذا كانت الضغوطات ذات الصلة المرض تفعيل الخلايا النجمية و بيريسيتس لتعطيل وظيفة بيك. لكل المقايسات ثقافة واحدة وثلاثية، يمكن عزل الخلايا الأولية جيئة وذهابام نماذج الماوس التي تحاكي اضطرابات ذات أهمية لمواصلة تحديد الآثار الوظيفية.
هناك عدد من الاعتبارات الهامة لتكييف تشكيل مثل شبكة وتشويه المقايسات لأنواع الخلايا المختلفة. الأول هو كثافة البذر. لكل خط خلية جديدة، خطوة أولى حاسمة هو تحسين كثافات البذر في مصفوفة الغشاء القاعدي لكل من المقايسات ثقافة واحدة وثلاثية. تشكيل شبكة هو عدد الخلايا تعتمد، وكلا عالية جدا ومنخفضة جدا كثافة الخلايا يؤدي إلى عدم وجود تشكيل شبكة. وعلاوة على ذلك، حتى بالنسبة للطرق والخلايا الموصوفة هنا، فمن الحكمة إجراء مقارنات كثافة الخلية لحساب أي اختلافات المختبر في معالجة الخلايا قبل إجراء تجارب على نطاق أوسع. الاعتبار الثاني هو التسلسل الزمني لتشكيل شبكة. وينبغي إجراء التجارب بالطبع الوقت لتحديد عندما تشبه هياكل مثل شبكة وتشوه. عادة، شبكة قوية لويلاحظ تشكيل إيك في ~ 4 ح. الاعتبار الثالث هو اختيار المتوسطة قبل البذر وأثناء التجربة. يتم استزراع بيكس، بيريسيتس و أستروسيتس في المتوسطة التي تحتوي على فبس وعدد كبير من عوامل النمو الأمثل لنمو الخلايا. على الرغم من أنه يفضل أن المصل وعامل النمو تجويع بيك قبل 24 ساعة من التجربة، لأنواع معينة من الخلايا هذا قد لا يكون ممكنا. على سبيل المثال، قد تتطلب الخلايا الأولية مع نوكدونز مستقبلات محددة عوامل إضافية لتسهيل النمو. هذه الاعتبارات تنطبق أيضا خلال التجربة، واختيار الوسيط يعتمد على السؤال المحدد قيد التحقيق. ومع ذلك، عند التحقيق في دور الضغوط الخارجية المضافة والمعالجات المحتملة، وخاصة عوامل النمو أو المركبات ذات الصلة، واستخدام المصل عامل النمو المتوسطة الحرة خلال التجربة مثالية. وبالإضافة إلى ذلك، قد يكون من الممكن للحد من طول المجاعة في الدم من بيكس، ولكن هذا يعتمد على سيجمسار نالينغ قيد التحقيق. وهناك اعتبار رابع هو توقيت إضافة الضغوطات أو العلاجات. أما بالنسبة لاختيار العلاج المتوسط، فإن التوقيت يعتمد على السؤال العلمي. المقياس تشكيل شبكة هو أكثر مماثلة لتوليد الأوعية الدموية، في حين أن فحص شبكة انقطاع قد تكون أكثر ملاءمة لباب ناضجة. في تجربتنا، مرة واحدة أنشئت، وفحوصات تنتج بيانات متسقة بين التجارب. وغالبا ما تنجم قضايا الاتساق عن تباينات كثافة البذر بين الموظفين، والأهم من ذلك أنه إذا تغيرت مكونات الكواشف المتوسطة أو ذات الصلة دون علم.
هناك قيود ومجالات مواصلة تطوير الطرق الموصوفة. قوة هذا الإجراء هو أن تركيزات منخفضة من الإجهاد ( أي oAβ) يمكن استخدامها للحث على انقطاع الشبكة مثل نم بالمقارنة مع ميكرومتر، والتي هي أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية. ومع ذلك، قد تكون هذه القوة أيضا تقييد. في الواقع، أعلى، بلا يزال غير سامة، قد تكون هناك حاجة لترآيز OA for لأغراض فحص المخدرات لزيادة الحساسية، والتي سوف تنطبق على غيرها من الضغوطات ذات الصلة المرض. الحد من الأسلوب هو أن شبكة من الخلايا مستقرة فقط أكثر من 24 ساعة في البروتوكولات الموصوفة. في الواقع، بعد 24 ساعة، و ميشوركس الخلية تبدأ في تنكس. لذلك، نضيف oAβ بعد وقت قصير نسبيا (4 ساعات) بعد تشكيل شبكة، لتمكين مجموع الوقت حضانة oA of من 18 ساعة. ربما أقل كثافة زراعة الشتلات قد تمكن بروتوكولات العلاج أطول. وهناك قيود محتملة أخرى هي أن النظام في المختبر قد لا تحاكي شبكة مستقرة من الخلايا كما لوحظ في الجسم الحي . عزل الخلايا من الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين قد تقليد عن كثب السيناريو في الجسم الحي .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
يتم تمويل ليون تاي من جامعة إلينوي شيكاغو بدء الأموال.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| hCMEC/D3 cells | Milipore | SCC066 | |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | |
| Collagen Type 1 | ThermoFisher | A1064401 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025092 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14175095 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media | Lonza | CC-4147 | |
| 5% FBS | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Ascorbic acid | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Gentamycin sulphate | Lonza | CC-4147 | |
| 25% Hydrocortisone | Lonza | CC-4147 | |
| 1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor | Lonza | CC-4147 | |
| Puromycin hydrochloride | VWR | 80503-312 | |
| MEM-HEPES | Thermo Scientific | 12360-038 | |
| Papain cell dissociation system (papain and DNase1) | Worthington Biochemical | LK003150 | |
| Human pericytes | Sciencell | 1200 | |
| Pericyte basal media | Sciencell | 1201 | |
| Pericyte growth supplement | Sciencell | 1252 | |
| Human Astrocytes | Sciencell | 1800 | |
| Astrocyte media | Sciencell | 1801 | |
| Astrocyte growth supplement | Sciencell | 1852 | |
| Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced) | Corning | 356231 | |
| Angiogenesis m-plates (96-well) | ibidi | 89646 | |
| Human Epidermal growth factor | Shenendoah Biotechnology | 100-26 | |
| CellTracker green | ThermoFisher | C7025 | |
| CellTracker orange | ThermoFisher | C34551 | |
| CellTracker blue | ThermoFisher | C2110 | |
| Poly-l-lysine | Sciencell | 0403 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT5012-60ML | |
| C57BL mice | Jackson Laboratory | na | |
| PCR tube strips | GeneMate | T-3014-2 | |
| Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope | Zeiss | na |
References
- Abbott, N. J. Blood-brain barrier structure and function and the challenges for CNS drug delivery. J Inherit Metab Dis. 36 (3), 437-449 (2013).
- Engelhardt, B., Liebner, S. Novel insights into the development and maintenance of the blood-brain barrier. Cell Tissue Res. 355 (3), 687-699 (2014).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
- Zlokovic, B. V. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders. Nat Rev Neurosci. 12 (12), 723-738 (2011).
- Pardridge, W. Targeted delivery of protein and gene medicines through the blood-brain barrier. Clin Pharmacol Ther. 97 (4), 347-361 (2014).
- Tai, L. M., et al. The role of APOE in cerebrovascular dysfunction. Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).
- Biron, K. E., Dickstein, D. L., Gopaul, R., Jefferies, W. A. Amyloid triggers extensive cerebral angiogenesis causing blood brain barrier permeability and hypervascularity in Alzheimer's disease. PLoS One. 6 (8), e23789 (2011).
- Cameron, D. J., et al. Alzheimer's-related peptide amyloid-beta plays a conserved role in angiogenesis. PLoS One. 7 (7), e39598 (2012).
- Boscolo, E., et al. Beta amyloid angiogenic activity in vitro and in vivo. Int J Mol Med. 19 (4), 581-587 (2007).
- Paris, D., et al. Impaired angiogenesis in a transgenic mouse model of cerebral amyloidosis. Neurosci Lett. 366 (1), 80-85 (2004).
- Kitaguchi, H., Ihara, M., Saiki, H., Takahashi, R., Tomimoto, H. Capillary beds are decreased in Alzheimer's disease, but not in Binswanger's disease. Neurosci Lett. 417 (2), 128-131 (2007).
- Jantaratnotai, N., Ryu, J. K., Schwab, C., McGeer, P. L., McLarnon, J. G. Comparison of Vascular Perturbations in an Abeta-Injected Animal Model and in AD Brain. Int J Alzheimers Dis. 2011, 918280 (2011).
- Donnini, S., et al. Abeta peptides accelerate the senescence of endothelial cells in vitro and in vivo, impairing angiogenesis. FASEB J. 24 (7), 2385-2395 (2010).
- Tai, L. M., Holloway, K. A., Male, D. K., Loughlin, A. J., Romero, I. A. Amyloid-beta-induced occludin down-regulation and increased permeability in human brain endothelial cells is mediated by MAPK activation. J Cell Mol Med. 14 (5), 1101-1112 (2010).
- Tai, L. M., Loughlin, A. J., Male, D. K., Romero, I. A. P-glycoprotein and breast cancer resistance protein restrict apical-to-basolateral permeability of human brain endothelium to amyloid-beta. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1079-1083 (2009).
- Tai, L. M., et al. Polarized P-glycoprotein expression by the immortalised human brain endothelial cell line, hCMEC/D3, restricts apical-to-basolateral permeability to rhodamine 123. Brain Res. 1292, 14-24 (2009).
- Koster, K. P., Thomas, R., Morris, A. W., Tai, L. M. Epidermal growth factor prevents oligomeric amyloid-beta induced angiogenesis deficits in vitro. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1865-1871 (2016).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. Isolation and culture of primary mouse brain endothelial cells. Methods Mol Biol. 1135, 345-356 (2014).
- Dahlgren, K. N., et al. Oligomeric and fibrillar species of amyloid-beta peptides differentially affect neuronal viability. J Biol Chem. 277 (35), 32046-32053 (2002).
- Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer. ImageJ News. , (2012).
- Thomas, R., et al. Epidermal growth factor prevents APOE4 and amyloid-beta-induced cognitive and cerebrovascular deficits in female mice. Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 111 (2016).
- Tai, L. M., et al. The role of APOE in cerebrovascular dysfunction. Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).
- Ambrose, C. T. Neuroangiogenesis: a vascular basis for Alzheimer's disease and cognitive decline during aging. J Alzheimers Dis. 32 (3), 773-788 (2012).
- Ambrose, C. T. A therapeutic approach for senile dementias: neuroangiogenesis. J Alzheimers Dis. 43 (1), 1-17 (2015).
- Ambrose, C. T. The Role of Capillaries in the Lesser Ailments of Old Age and in Alzheimer's Disease and Vascular Dementia: The Potential of Pro-Therapeutic Angiogenesis. J Alzheimers Dis. 54 (1), 31-43 (2016).
