Tuning in der Hippocampal Theta Band In vitro: Methoden für die Aufnahme aus dem isolierten Nagetier Septohippocampal Circuit

Hippocampale Theta-Oszillationen (4 - 12 Hz) gehören zu den vorherrschenden Formen der rhythmischen Aktivität im Säugetiergehirn und werden geglaubt, um Schlüsselrollen in kognitiven Funktionen wie die Verarbeitung von räumlich-zeitlichen Informationen und die Bildung episodischer Erinnerungen ^{1 , 2 , 3 zu spielen} . Während mehrere In-vivo- Studien, die das Verhältnis von theta-modulierten Ort-Zellen mit räumlichen Navigations- und Läsionsstudien hervorheben, sowie klinische Evidenz unterstützen die Ansicht, dass hippocampale Theta-Oszillationen in die Gedächtnisbildung ^{4 , 5 , 6} involviert sind, Mit der Erzeugung von hippocampalen Theta-Oszillationen sind noch nicht vollständig verstanden In frühen In-vivo- Untersuchungen wurde vorgeschlagen, dass die Theta-Aktivität hauptsächlich von extrinsischen Oszillatoren, insbesondere rhythmischen Inputs, abhingVon afferenten Hirnstrukturen wie dem Septum und dem entorhinalen Kortex ^{7 , 8 , 9 , 10} . Eine Rolle für intrinsische Faktoren - interne Konnektivität von hippocampalen neuronalen Netzwerken zusammen mit den Eigenschaften von Hippocampusneuronen - wurde auch auf der Basis von in vitro Beobachtungen ^{11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18} postuliert. Abgesehen von einigen Landmarkstudien ^{19 , 20 , 21} sind jedoch Schwierigkeiten bei der Entwicklung von Ansätzen, die physiologisch realistische Populationsaktivitäten in einer einfachen In-vitro- Schichtvorbereitung replizieren könntenS hat seit langem eine detailliertere experimentelle Untersuchung der intrinsischen Fähigkeiten des Hippocampus und der verwandten Gebiete zur Selbst-Erzeugung von Theta-Schwingungen verzögert.

Ein wichtiger Nachteil der Standard- In-vitro- Dünnschicht-Versuchsanpassung ist, dass die 3D-zelluläre und synaptische Organisation von Hirnstrukturen in der Regel kompromittiert wird. Dies bedeutet, dass viele Formen von konzertierten Netzwerkaktivitäten, die auf räumlich verteilten Zellanordnungen basieren, von lokalisierten Gruppen (≤1 mm Radius) bis hin zu Populationen von Neuronen, die sich über ein oder mehrere Gehirnbereiche (> 1 mm) erstrecken, nicht unterstützt werden können. Angesichts dieser Überlegungen war eine andere Art von Ansatz erforderlich, um zu untersuchen, wie Theta-Oszillationen im Hippocampus entstehen und sich auf verwandte kortikale und subkortikale Ausgangsstrukturen ausbreiten.

In den letzten Jahren wurde die anfängliche Entwicklung der "kompletten septo-hippocampalen" Präparation zur bidirektionalen Intera untersuchtCtions der beiden Strukturen ²² und die anschließende Evolution der "isolierten Hippocampus" -Präparation haben ergeben, dass intrinsische Theta-Oszillationen spontan im Hippocampus ohne externe rhythmische Input ^{23 auftreten} . Der Wert dieser Ansätze liegt in der ersten Einsicht, dass die gesamte funktionale Struktur dieser Regionen bewahrt werden musste, um als ein Theta-Rhythmus-Generator in vitro zu funktionieren ²² .

Alle Verfahren wurden nach den Protokollen und Richtlinien durchgeführt, die vom McGill University Animal Care Committee und dem Canadian Council on Animal Care genehmigt wurden.

1. Akuter Hippocampus In-Vitro- Präparation

HINWEIS: Die Isolierung der intakten Hippocampuspräparation beinhaltet drei Hauptschritte: (1) Vorbereitung von Lösungen und Geräten, (2) Dissektion des Hippocampus und (3) Einrichten des schnellen Perfusionsratensystems, das für die Erzeugung von intrinsischen Theta-Schwingungen erforderlich ist. In diesem Protokoll ist die rechtzeitige Durchführung von Prozeduren - von der Sektion bis zur Aufnahme - besonders wichtig, weil der isolierte Hippocampus eine so dichte, aber zarte Vorbereitung darstellt, dass die Aufrechterhaltung der funktionalen Konnektivität der Struktur in vitro große Sorgfalt erfordert. Die Vorbereitung von Vorteilen sorgt dafür, dass eine ausreichende Perfusion so früh wie möglich verfügbar ist, um die Zelle zu minimierenSüße und pflegen physiologische Funktion.

1. Sucrose-basierte künstliche zerebrale Wirbelsäulenflüssigkeit (aCSF) -Lösung
   1. Vorbereitung 1X-Saccharose-Lösung für die Sezierung und Nachdissektion Inkubation verwendet werden. Kombinieren Sie alle in Tabelle 1 aufgeführten Komponenten mit Ausnahme von CaCl ₂ in 1 l entionisiertem Wasser und lagern bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen.
2. Standard-aCSF-Lösung
   1. Vorbereitung der Standard-aCSF für die Hochdurchsatz-Perfusion des isolierten Hippocampus während der elektrophysiologischen Aufnahmen. Um den konzentrierten (5X) Stamm aCSF zu erhalten, löst man alle in Tabelle 2 aufgeführten Komponenten, außer CaCl ₂ , in 2 l entionisiertem Wasser auf und lag bei 4 ° C auf.
3. Vorbereitung der Ausrüstung
   1. Vor Beginn der Sektion den Bankbereich mit einer eisgefüllten Plastikschale (30 x 20 x 5 cm), mit Carbogen verbundenen Schlauchleitungen und ThrEe Glas Petrischalen (10 x 2 cm) (siehe Abbildung 1 ).
   2. Füge 300 ml Saccharose-Lösung (1X-Stamm) zu einem 500 ml-Becher hinzu, blase es mit Carbogen (95% O ₂ , 5% CO ₂ ) und füge Ca ²⁺ [1,2 mM] hinzu.
   3. 25 ml dieser Saccharoselösung auf eine Glas-Petrischale geben und bei Raumtemperatur ablassen. Legen Sie den Rest in einen 4 ° C Gefrierschrank für 10 - 15 min.
   4. Blase die eiskalte Saccharose-Lösung mit Carbogen während der Dissektion.
   5. Füllen Sie eine zweite Petrischale (kalte Haltekammer) mit Saccharose-Lösung (4 ° C) und auf Eis aufbewahren.
   6. Füge 30 ml eiskalte Sucrose-Lösung zu einem 50 ml-Becher hinzu.

2. Ganze Hippocampus-Dissektion

HINWEIS: Die Methode zur Sezierung des isolierten Hippocampus ist im Wesentlichen identisch mit der, die ursprünglich ²² entwickelt und beschrieben wurde, aber mit zusätzlichen Details und Änderungen bezüglich der peRfusionsrate und Aufzeichnungstechniken

1. Hirndissektion
   1. Anästhesieren Sie die Maus (P20 - 35) unter einer Dunstabzugshaube mit einem kleinen Papiertuch, das mit 1 ml Isofluran (100%) eingeweicht wurde, das in den Käfig eingefügt wird.
   2. Die anästhesierte Maus entkapseln und den Kopf schnell in eiskalte Saccharose-Lösung eintauchen (50 ml Becher, ca. 5 s). Transfer auf ein Papiertuch.
   3. Verwenden Sie ein Skalpell, um eine mediale Hautschnitt (kaudal zu rostral) und drücken Sie die Haut auf die Seiten, um die Schädel aussetzen.
   4. Den Schädel mit einer kleinen Schere aufschneiden und einen Spatel verwenden, um das Gehirn schnell zu extrahieren und in die Petrischale mit eiskalter Saccharose zu geben. Erlaube 1-2 min für das Gehirn zu kühlen.
   5. Während das Gehirn sich erholt, fügen Sie 2 - 3 ml Saccharose-Lösung auf eine Linse papierbedeckte Petri (Dissektion) auf Eis.
2. Isolierung des Hippocampus
   1. Legen Sie das Gehirn auf die Dissektion in einer aufrechten PositioN.
   2. Entfernen Sie das Kleinhirn und den Stirnrinde mit einer Rasierklinge. Schneiden Sie das Gehirn halb in der Midsagittalebene und bringen Sie die beiden isolierten Halbkugeln in die Haltekammer zurück. Erlaube noch 1 - 2 min für die Erholung.
   3. Setzen Sie das einzelne gehobelte Gehirn aufrecht auf die Dissektion.
   4. Drehen Sie die Schale, bis midsagittale Strukturen dem Betrachter zugewandt sind und der eingebettete Umriß des Septumkomplexes als eine dünne birnenförmige Gewebeschicht vor dem Thalamus sichtbar ist.
   5. Halten Sie das hemi-seced Gehirn stetig mit dem Mikrospatel und legen Sie das kleine Ende des Polytetrafluorethylen (PTFE) -beschichteten Spatel sofort hinter (kaudal bis) der Septum Bereich.
   6. Setzen Sie den beschichteten Spatel unter das Septum ein und bewegen Sie die Spitze nach unten, bis die Dissektion erreicht ist. Trennen Sie die Fasern, die den Septumbereich kaudal verbinden. Wiederholen Sie den gleichen Vorgang entlang der vorderen Kante des Septums und schneiden Sie die Fasern, die mit dem vorderen Teil des Gehirns verbinden.
   7. Wenn der Spatel den inneren Teil der Kortikalis direkt über dem Hippocampus in einer aufrechten Position hält, verwenden Sie den Mikrospatel, um die thalamischen, hypothalamischen und verbleibenden Hirnstammkerne sorgfältig herunterzuziehen. Benutzen Sie den Spatel, um das abgezogene Gewebe abzuschneiden und zu entfernen.
   8. Drehen Sie die isolierte Halbkugel auf die Seite und identifizieren Sie den Umriss des Hippocampus.
   9. Setzen Sie den beschichteten Spatel in den lateralen Ventrikel, unter dem rostralen Ende des dorsalen Hippocampus.
   10. Halten Sie den Spatel waagerecht mit der midsagittalen Ebene des hemi-seced Gehirns und schieben Sie ihn durch die glatte Kontur der ventrikulären Wände, bis die Spitze kaudal austritt.
   11. Halten Sie den Spatel unter dem Hippocampus und drücken Sie ihn leicht auf die verbindenden Fasern, entlang der Innenschicht, wo sich der Hippocampus mit der darüber liegenden Kortex verbindet. Die Mikrospatel auf die Außenseite dieser Schicht auftragen und gegen den beschichteten Spatel schieben, um durch die Verbindung zu schneidenBers
   12. Um die Extraktion zu vervollständigen, drehen Sie die Dissektionsschale und stecken Sie den beschichteten Spatel unter den ventralen Hippocampus ein. Halten Sie das Innere der kortikalen Falte mit dem Spatel leicht und schneiden Sie die entorhinalen Verbindungen mit einer Schnittbewegung gegen den Mikrospatel.
       HINWEIS: Der gesamte septohippocampale Komplex kann entfernt werden, indem man den beschichteten Spatel unter den gesamten Hippocampus platziert und das übrige Hirngewebe von unten herauszieht.
   13. Sobald die Isolierung abgeschlossen ist, halten Sie den Hippocampus auf dem Teller und fügen Sie einen Tropfen eiskalte Saccharose-Lösung, um es cool zu halten. Sorgfältig abschneiden alle verbleibenden Kortex und Fasern und trennen Sie den Hippocampus aus dem Septum durch sanftes Aufbringen einer Rasierklinge durch die Fornix.
       HINWEIS: Wenn Patch-Clamp-Aufnahmen von Pyramidenzellen durchgeführt werden sollen (siehe Abschnitt 4.6 Optogenetische Kontrolle), kann der isolierte Hippocampus in einem 45 ° -Winkel transversal geschnitten werden, um die Pyramidenschicht von CA1 ("anglE-cut "Vorbereitung), ohne die lokalen Netzwerkschaltungen im verbleibenden Teil des Hippocampus zu beeinträchtigen.
   14. Übertragen Sie das Präparat auf Raumtemperatur-Saccharose-Lösung und lassen Sie es für 15 - 30 min zurück, bevor Sie auf die Aufnahmekammer übertragen.

3. Richten Sie die schnelle Perfusion für die Aufnahme der isolierten Hippocampus

1. Stellen Sie das Schwerkraft-gefütterte Perfusionssystem ein, um einen kontinuierlichen Hochgeschwindigkeitszufluss von sauerstoffhaltigem aCSF bei 20 - 25 mL / min zu ermöglichen.
   1. Vor dem Beginn des Experiments mindestens 15 Minuten lang ein Mischbad (~ 30 ° C) vorbereiten. Schalten Sie das In-line-Heizsystem (30 ° C) ein.
   2. Verwenden Sie Aquarium-Bubbler und Schlauchleitungen, die mit einem Carbogen-Tank verbunden sind, um aCSF während des gesamten Experiments zu sauerstoffzugeben, und fügen Sie CaCl ₂ [2 mM] vor dem Beginn der Perfusion hinzu.
   3. Stoppen Sie den aCSF-Fluß und übertragen Sie den Hippocampus mit der breitenEnde einer Glaspipette. Lassen Sie die Saccharose gesättigte Zubereitung sinken und sich an der Unterseite niederlassen.
   4. Legen Sie die Vorbereitung in die Mitte der Aufzeichnungskammer (in Übereinstimmung mit der Einlass-Auslass-Achse) mit der glatten Oberfläche von CA1 und SUB oben. Stabilisieren Sie den Hippocampus mit kleinen Gewichten an den septalen und zeitlichen Extremitäten und starten Sie den aCSF-Fluss neu.

4. Elektrophysiologie im isolierten Hippocampus

1. Extrazelluläre Aufzeichnung von in vitro hippocampalen Theta-Oszillationen
   1. Für die extrazelluläre Überwachung von lokalem Feldpotential (LFP) oder Einzelgeräteaktivität aus dem in vitro isolierten Hippocampus verwenden Glas-Mikropipetten (1 - 3 MΩ), die mit aCSF gefüllt sind. Aufzeichnen von geräuscharmen AC-gekoppelten Feldpotentialsignalen mit einem Patch-Clamp-Verstärker der Verstärkung x1000, Online-Bandpassfilter 0,1 - 500 Hz und einer Abtastrate von 5-20 kHz.
      HINWEIS: Das maßgeschneiderte Mikroskop, das in diesem Protokoll verwendet wirdIst mit niedrigen (2.5X) und hochvergrößerten (40X) Objekten für die Vergrößerung des Hippocampus sowie der Infrarot-Video-Mikroskopie und Epifluoreszenz für die Einzelzell-Erkennung ausgestattet. Zu den Komponenten dieses Systems gehören das aufrechte Fluoreszenzmikroskop, Fluoreszenzfilterwürfel, eine analoge Videokamera und ein digitaler Framegrabber mit Imaging-Software, eine On-End-Custom-Perfusionskammer ( Abbildung 2A , Inset i) und hochpräzise Mikromanipulatoren für neuronale Aufnahmen und Optikfaser-Platzierung.
   2. Benutzen Sie die Kamera, die auf dem Mikroskop montiert ist und an eine Computeranzeige angeschlossen ist, um die Hippocampalvorbereitung unter geringer Vergrößerung (2.5X) zu prüfen und schnell zu überprüfen, dass es keine Hinterschneidungen oder Beschädigungen der äußeren Oberfläche gibt. Die diagonal orientierte Anordnung von Alveusfasern entlang der glatten Oberfläche von CA1 sollte sichtbar sein ( Abbildung 2A , Insert ii) beim Durchlicht durch das HippocamEiter.
   3. Verwenden Sie das Weitfeld-Objektiv mit geringer Vergrößerung, um den isolierten Hippocampus und die Platzierung von LFP-Elektroden an bestimmten Aufnahmestellen zu sehen.
      HINWEIS: Ein Layout der isolierten Hippocampuspräparation mit mehreren Elektroden, die an verschiedenen Aufzeichnungsstellen angeordnet sind, ist in 2A dargestellt .
   4. Senken Sie eine LFP-Elektrode in das Bad, bis sie die Oberfläche (Alveus) des CA1-Bereichs berührt.
      HINWEIS: Dies führt normalerweise zu einem schnellen Transienten in der AC-gekoppelten Aufzeichnung, ähnlich dem, was passiert, wenn die Elektrode mit dem Aufzeichnungsmedium in Berührung kommt. Ein Audiomonitor kann nützlich sein, um das LFP-Kanalsignal nach diesem Schritt zu hören.
      HINWEIS: Oftmals werden frühe Anzeichen von Aktivität erst nach 10 - 15 min erscheinen, daher ist es wichtig, nicht schnell in die Vorbereitung vorzugehen. Wenn nach dieser Periode die oberflächliche LFP-Elektrode noch keine Aktivität aufnimmt, noch etwas weiter durch die Stratum oriens vorrücktUnd pausieren periodisch, um zu sehen, ob irgendeine Form von Aktivität entsteht, während sie sich der Hauptzellschicht nähert. Wenn nach weiteren 5 - 10 min nichts erkannt wird, ziehen Sie die Elektrode vorsichtig zurück und legen Sie sie an anderer Stelle entlang derselben Region.
   5. Führen Sie die LFP-Elektrode durch die Pyramidenschicht vor. Beachten Sie, dass die extrazelluläre Spiking-Aktivität anfänglich zunimmt, wenn ein einzelner Entladung von einzelnen Neuronen (meist pyramidenförmige und hemmende Korbzellen) nachgewiesen wird. Senken Sie die Elektrode weiter und beachten Sie, dass das Spiking wieder zu verblassen beginnt, während die Spitze in das Radiatum übergeht. Beachten Sie, dass eine deutlich sichtbare Netzschwingung im Theta-Frequenzbereich (4 - 12 Hz) sichtbar wird und eine maximale Amplitude erreicht (~ 100 - 300 μV), da der Aufzeichnungsort durch das Radiatum abgesenkt wird.
2. Theta-Oszillationen über eine einzige Region
   1. Um die räumlichen Eigenschaften von spontanen Theta-Schwingungen über die CA1-Region zu testen, platziere die Spitze oFa-Referenz-LFP-Elektrode in einer medialen CA1-Stelle (medial entlang der longitudinalen septo-zeitlichen Achse) und senken sie in das Radiatum, wie zuvor beschrieben.
   2. Legen Sie eine zweite LFP-Elektrode in eine CA1-Stelle (200 - 800 μm Septal oder zeitlich aus dem ersten LFP) und beobachten Sie, dass CA1-Theta-Oszillationen über relativ große Distanzen synchronisieren können.
3. Theta-Oszillationen über Schichten
   1. Um die Eigenschaften von Theta-Oszillationen über hippocampale Schichten zu testen, hinterlässt eine Referenz-LFP-Elektrode in einer CA1-Radiatum-Stelle. Ausgehend von knapp über den Stratum oriens, senken Sie eine zweite Elektrode in die pyramidenförmige Zellschicht und durch das Radiatum. Beobachten Sie eine allmähliche Umkehrung des LFP-Signals (relative Phasenumkehr) über die Pyramidenschicht.
      HINWEIS: Für repräsentative Beispiele für diese Arten von Aktivitäten siehe Abbildung 2B . Beispiele für laminare / Tiefenprofile und Current Source Density (CSD) AnalysenIllustriert die Stelle der Phasenumkehr in isolierten Hippocampi wurden zuvor veröffentlicht ^{23 , 24 , 25} .
4. Gamma-Oszillationen und Theta-Gamma-Kopplung im intakten Hippocampus
   1. Legen Sie eine Feldelektrode am CA1 / SUB-Rand und senken Sie sie, bis sie an der Grenzfläche zwischen den pyramidenförmigen und molekularen Schichten sitzt. Auf dieser Ebene kann ein Feldpotential klar Gamma - Oszillationen mit Änderungen der Amplitude , die Phasenverriegelung auf dem lokalen Theta - Rhythmus Anzeige ²⁴ aufgezeichnet werden. Stellen Sie die Skalierung ein, um die langsame Zeitskala der Theta-Gamma-Kopplung zu beobachten. Beachten Sie, dass Gamma-Bursts in zwei verschiedenen Frequenzbändern auftreten, die durch das Bandpassfilter des laufenden LFP-Signals im langsamen (25 - 50 Hz) und schnellen Gamma (150 - 250 Hz) Bereich aufgedeckt werden können (siehe Abbildung 2C für repräsentativ gefiltert Spuren).
5. Ganzzellige Patch-Clamp-Aufzeichnung bei in vitro hippocampalen Theta-Oszillationen
   HINWEIS: In diesem Teil des Protokolls ist es das Ziel, visuell geführte Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen aus identifizierten Interneuronen in isolierten Hippocampi aus transgenen PV-TOM-Mäusen zu erhalten, die das fluoreszierende Protein tdTomato unter der Kontrolle des PV-Promotors exprimieren (für Mehr Details siehe Material und Ref. ²⁶ ).
   1. Verwenden Sie eine Fluoreszenz-Videomikroskopie mit einer niedrigen (2.5X) und einer Hochleistungsvergrößerung (40X), um tdTomato-positive Interneurone zu visualisieren, die sich in der Nähe der Oberfläche einer Hippocampuspräparation von einer PV-TOM-Maus befinden ( Abbildung 3 ). Beachten Sie, dass, während PV-TOM-Neuronen erfolgreich visualisiert und auf Patch durch den Alveus (bis zu 100 μm) gezielt werden können, auch nicht fluoreszierende Pyramidenzellen relativ leicht erreicht werden können, wenn der Hippocampus mit der Winkelschnitttechnik hergestellt wird (vgl Abschnitt 2.2.14 Anmerkung).
   2. Unter der Vergrößerungsansicht des Hippocampus legen Sie eine LFP-Elektrode in CA1 / SUB zur Überwachung der Theta-Oszillationen bei der Vorbereitung auf Patch-Clamp-Experimente.
   3. Umschalten auf 40fache Vergrößerung und Eintauchen des Objektivs über die Zielregion; Senken Sie es, bis die oberen Schichten sichtbar werden. Manipulieren Sie die Position des Mikroskops, um einen ausreichenden offenen Zugang für Patchpipettenansatz von der gegenüberliegenden Seite zu gewährleisten.
   4. Unter der Fluoreszenzmikroskopie eine fluoreszierende PV-TOM-Zelle auswählen und mit einer Patchpipette (2 - 3 MΩ), die mit einer intrazellulären Standardlösung gefüllt ist, nähern.
   5. Verwenden Sie ein Mundstück, um einen leichten positiven Druck auf die Pipette aufzubringen und den Widerstand zu überwachen, wenn die Elektrode auf die Zelle abgesenkt wird. Wenn die Spitze auf die Zielzelle trifft, nimmt der Pipettenwiderstand zu und es entsteht ein klares Grübchen, wenn ein positiver Druck auf die Membran drückt. Lassen Sie den Druck frei und prüfen Sie, ob der Stromimpuls abläuft, wenn sich ein Siegel beginnt. Sofort clAmpere zu einem hyperpolarisierten Potential (-70 mV), und sobald eine GΩ-Dichtung erreicht ist, zerreißen Sie die Zellmembran mit einer geringen Menge an Unterdruck, der durch den Pipettenhalter aufgebracht wird.
   6. Einmal in Ganzzellkonfiguration untersuchen wir die physiologischen Eigenschaften der identifizierten PV-Zelle bei spontanen Hippocampusschwingungen ( Abbildung 3B ).
   7. Beachten Sie, dass die intrazelluläre Membranpotentialerfassung aus PV-Zellen durch schnelles Spiking-Verhalten und Ausbrüche von Aktionspotentialen gekennzeichnet ist, die mit dem laufenden CA1 / SUB-Theta-Rhythmus synchronisiert sind.
   8. Umschalten auf Spannungsklemme und halten die Zelle an verschiedenen Membranpotentialen, um das Verhältnis von exzitatorischen versus hemmenden synaptischen Strömen zu charakterisieren, die durch die intrinsische rhythmische Aktivität erzeugt werden. Ein Beispiel für eine Patch-Clamp-Aufzeichnung von einer Pyramidenzelle ist in Fig. 3A zum Vergleich gezeigt.
6. Optogenetische Kontrolle im isolierten Hippocampus HINWEIS: Für die optogenetische Kontrolle der hippocampalen Netzaktivität wird hier eine zelltypspezifische Strategie mit rhythmischer Aktivierung von PV-haltigen GABAergen-Zellen angewendet, da diese Zellen bei der Synchronisation der Hauptzellpopulationen im isolierten Hippocampus ²⁵ eine wichtige Rolle spielen. Die selektive Expression des exzitatorischen Channelrhodopsin-2 (ChR2) in PV-Zellen wird durch die Kreuzung der PV-Cre-Maus-Linie mit Mäusen erreicht, die ChR2 Cremeabhängig (Ai32) exprimieren, wodurch PV-ChY-Mäuse erzeugt werden. Alternativ können virale Vektorkonstrukte ( zB AAVdj-ChETA-eYFP) in den Hippocampus von PV-Cre- oder PV-TOM-Mäusen (P15-16) injiziert werden, um die Expression des exzitatorischen Opsins in CA1 / SUB-Interneuronen zu treiben ( Abbildung 4A) ).
   HINWEIS: Diese Strategie wurde zuvor beschrieben ²⁵ .
   1. Legen Sie eine LFP-Elektrode in den CA1 / SUB-Bereich und pflücken Sie eine nahe gelegene Pyramidenzelle im isolierten HippocAmpus einer Maus, die das blau-lichtempfindliche exzitatorische Opsin-ChR2 in PV-Interneuronen ausdrückt.
   2. Legen Sie einen Lichtleitfaser-Lichtleiter (0,2 - 1 mm Durchmesser) über die Hippocampus-Vorbereitung und zentrieren Sie ihn auf den aufgezeichneten Bereich. Verwenden Sie blaues Licht (473 nm) aus einer LED-Quelle für die optogenetische Stimulation, bestehend aus Lichtimpulsen (10 - 20 ms, ausgelöst durch ein Transistor-Transistor-Logiksignal) oder Sinuswellenspannungsbefehle, die bei Theta-Frequenzen (4 - 12 Hz) ausgegeben werden.
      HINWEIS: Die benutzerdefinierte LED-basierte Lichtstimulationsanordnung wurde an anderer Stelle beschrieben ²⁵ .
   3. Umschalten auf die Stromklemme und charakterisieren die Aktivität der Pyramiden bei spontanen Theta-Schwingungen.
   4. Starten Sie das Stimulationsprotokoll und notieren Sie die Lichtreaktionen. Beachten Sie, dass Feldschwingungen und synaptische Aktivität im aufgezeichneten Neuron bei der optogenetischen Stimulation zunehmend synchronisiert werden und dass die rhythmische Stimulation von PV-Zellen zu einer robusten Kontrolle beider häufig führtUnd die Macht der Theta-Oszillationen ( Abbildung 4 ).

Dieser Abschnitt veranschaulicht Beispiele für Ergebnisse, die durch das Studium der Theta-Oszillationen in der Maus isolierten Hippocampus-Präparation in vitro erhalten werden können . Das Sektionsverfahren zum Extrahieren des isolierten Hippocampus ist in Fig. 1 dargestellt . Mit dieser Vorbereitung können intrinsische Theta-Oszillationen bei der Platzierung von Mehrfachfeld-Elektroden untersucht werden, wobei die Gesamtaktivität und die synchronisierten synaptischen Eingaben auf neuronale Populationen in verschiedenen Regionen und Schichten des isolierten Hippocampus aufgezeichnet werden ( Abbildung 2 ). Repräsentative Ergebnisse aus simultaner Ganzzell-Patch-Clamp und extrazellulären Aufnahmen werden vorgestellt, um die Zünd- und synaptischen Eigenschaften spezifischer Zelltypen bei spontanen hippocampalen Theta-Oszillationen ( Abbildung 3 ) sowie bei der optogenetischen Manipulation rhythmischer Aktivität zu charakterisieren (G "> Abbildung 4).

Abbildung 1: Dissektionsverfahren für die isolierte intakte Hippocampus-Präparation.
( A ) Allgemeine Ansicht des Sektionsaufbaus. Rechts oben: carbogenierter eiskalter Saccharose-Lösungskolben (1); Unten links: eisgefüllte Plastikschale (2) hält die mit Linsenpapier bedeckte Dissektionsschale (3); Die kalte Haltekammer mit Saccharose-Lösung (4); Und eine Reihe von chirurgischen Werkzeugen (5). ( B ) Blick auf das Gehirn der Maus vor der Hemmung auf dem Sektionsgericht ( C ) Rückgewinnung des gehemmten Gehirns in der kalten Haltekammer und der vergrößerten Ansicht (Insert) der linken Hirnhalbkugel, bevor das kleine Ende des beschichteten Spatels unter das Septum eingeführt wird. ( D ) Beschichteter Spatel unter dem isolierten Hippocampus, entlang der CA1 / SUB-Region, mit dem verbleibenden GehirnGewebe wird von unten herausgezogen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2: Konfiguration des Setups zur Aufzeichnung in vitro Theta-Oszillationen aus der intakten Hippocampalen Vorbereitung in der untergetauchten Aufnahmekammer.
( A ) Der isolierte Hippocampus wird mit einem Layout von Hippocampusbereichen und mehreren Elektroden gezeigt, die in vier verschiedenen Aufnahmestellen angeordnet sind, die septotemporal verteilt sind (mit weißen Sternchen bezeichnet). In der Ansicht der oben gezeigten Aufzeichnungskammerplattform (Einfügung i) sind der Einlaß und der Auslaß für den schnellen Perfusionsfluß durch die Zahlen (1, 2) angegeben. In dem vergrößerten Bild des unten gezeigten Hippocampus (Insert ii) wird eine einzelne Elektrode in der Mitte platziertSepetotemporalische CA1 und Fasern des Alveus sind leicht sichtbar und laufen diagonal zum Subiculum. S: Septum, T: zeitlich, f / fx: Fimbria-Fornix. ( B ) Schematische Darstellung der Organisation von CA1-Schichten mit repräsentativen LFP-Spuren, die gleichzeitig aus Stratum oriens (grau) und Stratum radiatum (schwarz) aufgezeichnet wurden. Beachten Sie die invertierte Phase der Signale zwischen den beiden Schichten. Alv: Stratum alveus, PR: Stratum pyramidale, SR: Stratum radiatum. SLM: Stratum Lacunosum Moleculare. ( C ) Beispiel LFP-Spur mit spontaner Theta-Oszillation aus dem CA1 / SUB-Bereich (Sektor 20 Sek.) Und 2 Sek. Expandierte Segmente (unten) aus ungefiltertem Signal; Bandpassfilter für Theta-Frequenzen (0,5 - 12 Hz); Langsame Gamma (25 - 55 Hz); Und schnelle Gamma (125 - 250 Hz). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3: Zelltyp spezifische Aktivität der Pyramidenzelle und PV-Interneuron bei spontanen Theta-Oszillationen in der intakten Hippocampalen Präparation aus einer PV-TOM-Maus.
( A ) Synaptische Aktivität, die von einer Pyramidenzelle während der Theta-Oszillationen aufgezeichnet wurde. Gegenwärtige Klemmspuren (linkes Feld) zeigen spontane, aber nicht rhythmische Zündungen im Ruhezustand und hemmende postsynaptische Potentiale (iPSPs), die nicht eindeutig mit der langsam auftauchenden LFP-Oszillation synchronisiert wurden. Spannungsklemmenaufnahmen (rechts) zeigen, dass die entsprechenden hemmenden postsynaptischen Ströme (iPSCs) ihr Umkehrpotential um -70 mV haben. ( B ) Synaptische Aktivität, die von einem schnell spitzenden fluoreszierenden PV-Interneuron während der Theta-Oszillationen aufgezeichnet wurde. In der Stromklemme (links) wurde diese Zelle spontan in Ruhe gefeuert und wurde stark von rhythmischen exzitatorischen po getriebenStsynaptische Potentiale (ePSPs), die mit der stabilen LFP-Oszillation phasenverschlossen waren. Bei spannungsklemmenaufnahmen (rechts) betrug das exzitatorische postsynaptische stromumkehrpotential etwa 0 mV. Schematische Zeichnungen zeigen oben den Versuchsaufbau zusammen mit der Platzierung von Patch- und Feldelektroden im CA1 / SUB und High (40X) Vergrößerungsbildern der aufgezeichneten Pyramidenzelle und fluoreszierenden PV-Interneuron. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4: Lokale Feldpotential- und Simultan-Patch-Clamp-Aufnahmen von einzelnen CA1 / SUB-Pyramiden- und PV-Neuronen bei spontanen und optogenetisch angetriebenen Theta-Oszillationen im isolierten Hippocampus.
( A B ) Charakterisierung eines pyramidenförmigen Neurons, das typische Regular-Spiking (RS) -Eigenschaften (oben) und eine hohe Vergrößerung (40X) der aufgezeichneten Zelle (unten) zeigt. ( C ) Probenstrom-Klammer-Aufzeichnung der gleichen Zelle bei depolarisiertem Membranpotential (schwarz) zusammen mit dem LFP-Signal (grau) und zeigt synchronisierte rhythmische IPSPs während der spontanen Oszillation (links) und während der TFT-Frequenz (6 Hz) Lichtstimulation ( Recht). Das Muster der Lichtstimulation (blaue Schattierung) ist oben auf den Spannungsspuren abgebildet. ( D ) Spektrogramm und Leistungsspektren der LFP-Wellenform vor, während und nach einer 6-Hz-Lichtsimulation (Baseline, Stim, Post). ( E ) Hellvergrößerte Hellfeld- und Fluoreszenzbilder des IsolatsHippocampale Präparation, die die in der CA1 / SUB-Region lokalisierte EYFP-Fluoreszenz (in Grün) zeigt. ( F ) Aktuelle Schritte Charakterisierung zeigt Fast-Spiking (FS) Verhalten eines aufgezeichneten PV-TOM Interneuron (40X Fluoreszenz Bild unten). ( G ) Membranpotentialaufzeichnung mit großen EPSPs und rhythmischem Zünden der aufgenommenen PV-Zelle, synchronisiert mit dem LFP-Signal bei spontaner Feldoszillation (links) und bei Lichtstimulation (rechts) bei 3 Hz. ( H ) Feld Ausgelöstes Mittel (FTA) von PV-Zellenspitzen über das CA1 / SUB LFP-Signal. Die Entladung der PV-Zelle über mehrere Versuche (zentriert auf die LFP-Peaks) wurde in ein FTA von Spikes umgewandelt, die während der spontanen Oszillation (Baseline) und während der Lichtstimulation (stim) aufgezeichnet wurden. Mittlere und untere Graphen zeigen die Rasterplots von Spikes und Spike Wahrscheinlichkeit Histogramme (durchschnittliche Wahrscheinlichkeit ist in rot gezeigt). Die obersten Graphen zeigen Plots des durchschnittlichen LFP-Signals, das während der LigHt Stimulation parallel mit hoch synchronisierte Zündung der PV-Zelle Phase-verriegelt mit dem Peak der LFP-Oszillation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

SUCROSE LÖSUNG (1X) FÜR GETRENNTE HIPPOCAMPUS
(Lagerlösung)
Verbindung	MW	Final Conc. (MM)	Betrag für 1 l (g)
Saccharose	342.3	252	86,26 g
NaHCO 3	84.01	24	2,020 g
Glucose	180,2	10
KCl	74,55	3	0,223 g
MgSO 4	120.4	2	0,244 g
NaH 2 PO 4	120	1,25	0,150 g
CaCI2 .2H2O [1 M] Lager	147	1.2	120 & mgr; l / 0,1 l *
* Addieren Sie 360 ​​μl CaCl 2 [1 M] für 0,3 l oxygenierte Saccharose-Lösung
		PH = 7,4 bei sauerstoffreichem, Osm 310 - 320

Tabelle 1.

STANDARD ACSF LÖSUNG (5X) FÜR PERFUSION
(Lagerlösung)
Verbindung	MW	Final Conc. (MM)	Betrag für 2 L 5X
NaCl	58.44	126	73,6
NaHCO 3	84.01	24	20.2
Glucose	180,2	10	18
KCl	74,55	♦ 4.5	3.355
MgSO 4	120.4	2	2.41
NaH 2 PO 4	120	1,25	1.5
Ascorbat	176.1	0,4	0.705
CaCI2 .2H2O [1 M] Lager	147	2	2 mL / l *
* 2 ml CaCl 2 [1 M] für 1 l aCSF (1x) sauerstoffhaltige Lösung zugeben
		PH = 7,4 bei sauerstoffreichem, Osm 310 - 320
♦ Für diese aCSF-Lösung wird ein leicht erhöhtes [K + ] o verwendet (verglichen mit normalem aCSF 2,5 mM KCl), um die Erregbarkeit von hippocampalen Netzwerken zu erhöhen und das Entstehen von Theta-Oszillationen zu erleichtern.

Tabelle 2.

Die Autoren erklären keine konkurrierenden kommerziellen oder finanziellen Interessen.