Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Aufzeichnung von rhythmischen neuronalen Netzwerk-Theta und Gamma-Oszillationen aus einer isolierten ganzen Hippocampus-Präparation. Wir beschreiben die experimentellen Schritte von der Extraktion des Hippocampus bis hin zu Details der Feld-, Einheits- und Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen sowie der optogenetischen Stimulation des Theta-Rhythmus.
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren für die Vorbereitung und Aufzeichnung aus dem isolierten ganzen Hippocampus, von WT und transgenen Mäusen, zusammen mit den jüngsten Verbesserungen in Methoden und Anwendungen für das Studium der Theta-Oszillationen. Es wird eine einfache Charakterisierung des isolierten Hippocampuspräparates vorgestellt, wobei die Beziehung zwischen internen hippocampalen Theta-Oszillatoren zusammen mit der Aktivität von Pyramidenzellen und GABAergischen Interneuronen der Cornu-Ammoni-1 (CA1) und Subiculum (SUB) -Flächen untersucht wird. Insgesamt zeigen wir, dass der isolierte Hippocampus in der Lage ist, intrinsische Theta-Oszillationen in vitro zu erzeugen, und die innerhalb des Hippocampus erzeugte Rhythmizität kann durch optogenetische Stimulation von parvalbumin-positiven (PV) Interneuronen präzise manipuliert werden. Die in vitro isolierte Hippocampuspräparation bietet eine einmalige Gelegenheit, simultane Feld- und intrazelluläre Patch-Clamp-Aufnahmen von visuell identifiziertem neu zu verwendenRons, um die Mechanismen zu verstehen, die der Theta-Rhythmus-Generation zugrunde liegen.
Einleitung
Hippocampale Theta-Oszillationen (4 - 12 Hz) gehören zu den vorherrschenden Formen der rhythmischen Aktivität im Säugetiergehirn und werden geglaubt, um Schlüsselrollen in kognitiven Funktionen wie die Verarbeitung von räumlich-zeitlichen Informationen und die Bildung episodischer Erinnerungen 1 , 2 , 3 zu spielen . Während mehrere In-vivo- Studien, die das Verhältnis von theta-modulierten Ort-Zellen mit räumlichen Navigations- und Läsionsstudien hervorheben, sowie klinische Evidenz unterstützen die Ansicht, dass hippocampale Theta-Oszillationen in die Gedächtnisbil....
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Protokoll
Alle Verfahren wurden nach den Protokollen und Richtlinien durchgeführt, die vom McGill University Animal Care Committee und dem Canadian Council on Animal Care genehmigt wurden.
1. Akuter Hippocampus In-Vitro- Präparation
HINWEIS: Die Isolierung der intakten Hippocampuspräparation beinhaltet drei Hauptschritte: (1) Vorbereitung von Lösungen und Geräten, (2) Dissektion des Hippocampus und (3) Einrichten des schnellen Perfusionsratensystems, das für die Erzeugung von intrinsischen Theta-Schwingungen erforderlich ist. In diesem Protokoll ist die rechtzeitige Durchführung von Prozeduren - von der Sektion b....
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Ergebnisse
Dieser Abschnitt veranschaulicht Beispiele für Ergebnisse, die durch das Studium der Theta-Oszillationen in der Maus isolierten Hippocampus-Präparation in vitro erhalten werden können . Das Sektionsverfahren zum Extrahieren des isolierten Hippocampus ist in Fig. 1 dargestellt . Mit dieser Vorbereitung können intrinsische Theta-Oszillationen bei der Platzierung von Mehrfachfeld-Elektroden untersucht werden, wobei die Gesamtaktivität und die syn.......
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Diskussion
Während elektrophysiologische Aufnahmen von akuten Hippocampusscheiben eine Standard- In-vitro- Technik darstellen, unterscheiden sich die hier vorgestellten Methoden erheblich vom klassischen Ansatz. Anders als die dünnen Scheibenpräparate, bei denen spezifische Zellschichten an der Oberfläche sichtbar sind und direkt untersucht werden können, sind die intakten Hippocampuspräparate eher in in vivo- Konfigurationen verwandt, bei denen Elektroden in gezielte Hirnregionen abgesenkt werden, währe.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keine konkurrierenden kommerziellen oder finanziellen Interessen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von den kanadischen Instituten für Gesundheitsforschung und Naturwissenschaften unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Reagenzien | |||
| Natriumchlorid | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Saccharose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Natriumbicarbonat | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NaH2PO4 - Natriumphosphat monobasisch | Sigma Aldrich | S8282 | |
| Magnesiumsulfat | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Kaliumchlorid | Sigma Aldrich | P3911 | |
| D-(+)-Glukose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Calciumchloriddihydrat | Sigma Aldrich | C5080 | |
| Natriumascorbat | Sigma Aldrich | A7631-25G | |
| Name | Company | Katalognummer | Kommentare |
| Ausrüstung | |||
| Standard Präparierschere | Fisher Scientific | 08-951-25 | Hirnextraktion |
| Skalpellgriff #4, 14 cm | WPI | 500237 | Hirnextraktion |
| Filter Pinzette, flache Backen, gerade (11 cm) | WPI | 500456 | Hirnextraktion |
| Paragon Edelstahl Skalpellklingen #20 | Ultident | 02-90010-20 | Hirnextraktion |
| Fine Point Curved Dissektionschere | Thermo Fisher Scientific | 711999 | Hirnextraktion |
| Teflon (PTFE) -beschichteter dünner Spatel | VWR | 82027-534 | Hippocampus-Präparat |
| Hayman Style Mikroskopspatel | Fisher Scientific | 21-401-25A | Hippocampus-Präparat |
| Laborlöffel | Fisher Scientific | 14-375-20 | Hippocampus-Präparat |
| Borosilikatglas Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | Hippocampus-Präparat |
| Droper | Fisher Scientific | Hippocampus-Präparat | |
| Rasierklingen Einschneidig | VWR | 55411-055 | Hippocampus-Vorbereitung |
| Linsenpapier (4 x 6") | VWR | 52846-001 | Hippocampus-Vorbereitung |
| Petrischalen aus Glas (100 x 20 mm) | VWR | 25354-080 | Hippocampus-Vorbereitung |
| Kunststoffschale für Eis; Größe 30 x 20 x 5 cm | |||
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | Perfusionssystem |
| Aquarium Ausströmersteine zum Sprudeln | |||
| Tygon E-3603 Schlauch (ID 1/16 OD 1/8) | Fisherbrand | 14-171-129 | Perfusionssystem |
| Elektrische Pfanne | Schwarz & Decker | n.a.Perfusionssystem | |
| 95% O2/5% CO2 Gasgemisch (Carbogen) | Vitalaire | SG466204A | Perfusionssystem |
| Glasflaschen/-kolben (4 x 1 L) | |||
| Untergetauchte Aufnahmekammer | Sonderanfertigung (FM) | n.a.Kommerzielle | Alternative kann verwendet werden |
| Glaspipetten (1,5/0,84 OD/ID (mm)) WPI | 1B150F-4 | Elektrophysiologie | |
| Brummwanze 50/60 Hz Lärmbeseitiger | Quest Scientific | Q-Humbug | Elektrophysiologie |
| Multiclamp 700B Patch-Clamp Verstärker | Molekulare Geräte | MULTICLAMP | Elektrophysiologie |
| Multiclamp 700B Commander Programm Molekulare | Geräte | MULTICLAMP | Elektrophysiologie |
| Digital/Analog-Wandler | Molekulare Geräte | DDI440 | Elektrophysiologie |
| PCLAMP10 | Molekulare Geräte | PCLAMP10 | Elektrophysiologie |
| Schwingungsisolationstabelle | Newport | n.a.Elektrophysiologie | |
| Mikromanipulatoren (manuell betätigt) | Siskiyou | MX130 | Elektrophysiologie (LFP) |
| Mikromanipulatoren (automatisiert) | Siskiyou | MC1000e | Elektrophysiologie (Patch) |
| Audiomonitor | A-M Systems | 3300 | Elektrophysiologie |
| Mikropipette/Patch-Pipettenabzieher | Sutter | P-97 | Elektrophysiologie |
| Speziell angefertigtes aufrechtes Fluoreszenzmikroskop | Siskiyou | n.a.Imaging | |
| Analoge Videokamera | COHU | 4912-2000/0000 | Imaging |
| Digitaler Framegrabber mit Imaging-Software | EPIX, Inc | PIXCI-SV7 | Bildgebung |
| Olympus 2.5X Objektiv | Olympus | MPLFLN | Bildgebung |
| Olympus 40X Wasser-Immersionsobjektiv | Olympus | UIS2 LUMPLFLN | Imaging |
| Maßgeschneidertes Leuchtdiodensystem (LED) | kundenspezifische | n.a.optogenetische | Stimulation (Amhilon et al., 2015) |
| Name | Company< | strong>Katalognummer | <>Kommentare |
| Tiere | |||
| PV::Cre (KI) Mäuse | Jackson Laboratory | Lagernummer 008069 | Zulassen Cre-gerichtete Genexpression in PV-Interneuronen |
| Konstitutiv-bedingte Ai9-Mäuse (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI)) | Jackson Laboratory | Aktiennummer 007905 | Exprimieren Sie TdTomato nach Cre-vermittelter Rekombination |
| Ai32-Mäuse (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP | Jackson Laboratory | stock Anzahl 012569 | Exprimieren Sie das verbesserte Kanalrhodopsin-2/EYFP-Fusionsprotein nach Exposition gegenüber Cre Rekombinase |
| PVChY-Mäuse | Inhouse-Zucht | n.a. | Nachkommen aus der Kreuzung der PV-Cre-Linie mit Ai32-Mäusen (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP |
Referenzen
- Buzsaki, G. Theta rhythm of navigation: link between path integration and landmark navigation, episodic and semantic memory. Hippocampus. 15 (7), 827-840 (2005).
- Sanders, H., Renno-Costa, C., Idiart, M., Lisman, J.
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Nachdrucke und Genehmigungen
