Methodenartikel

Analyse der Gap-Junction-abhängigen Übertragung von miRNA mit 3D-FRAP-Mikroskopie

DOI:

10.3791/55870

⸱

19. Juni 2017

 ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), 2Department of Cardiac Surgery, University of Rostock, 3Department of Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty, University of Rostock

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier beschreiben wir die Anwendung der dreidimensionalen Fluoreszenz-Wiedergewinnung nach Photobleichung (3D-FRAP) für die Analyse des spaltübergangsabhängigen Shuttles von miRNA. Im Gegensatz zu allgemein angewandten Methoden ermöglicht 3D-FRAP die Quantifizierung der interzellulären Übertragung von kleinen RNAs in Echtzeit mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kleine Antisense-RNAs, wie miRNA und siRNA, spielen eine wichtige Rolle in der zellulären Physiologie und Pathologie und können darüber hinaus als therapeutische Mittel bei der Behandlung mehrerer Krankheiten eingesetzt werden. Die Entwicklung neuer, innovativer Strategien für die miRNA / siRNA-Therapie basiert auf einer umfassenden Kenntnis der zugrunde liegenden Mechanismen. Jüngste Daten deuten darauf hin, dass kleine RNAs zwischen den Zellen in einer spaltübergangsabhängigen Weise ausgetauscht werden, wodurch die Genregulationseffekte in der Empfängerzelle induziert werden. Molekulare biologische Techniken und Durchflusszytometrie werden häufig verwendet, um den interzellulären Austausch von miRNA zu untersuchen. Allerdings bieten diese Methoden keine hohe zeitliche Auflösung, was notwendig ist, wenn man den lückenübergreifenden Fluss von Molekülen studiert. Um die Wirkung von miRNA / siRNA als interzelluläre Signalmoleküle zu untersuchen, sind daher neue Werkzeuge erforderlich, die die Analyse dieser kleinen RNAs auf zellulärer Ebene ermöglichen. Das vorliegende Protokoll beschreibt die apPlication der dreidimensionalen Fluoreszenz-Wiedergewinnung nach Photobleichung (3D-FRAP) -Mikroskopie zur Aufklärung des spaltübergangsabhängigen Austauschs von miRNA-Molekülen zwischen Herzzellen. Wichtig ist, dass dieser unkomplizierte und nicht invasive Live-Zell-Imaging-Ansatz die Visualisierung und Quantifizierung des Lücken-Junction-Shuttles von fluoreszenzmarkierten kleinen RNAs in Echtzeit mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung ermöglicht. Die von 3D-FRAP erhaltenen Daten bestätigen einen neuartigen Weg der interzellulären Genregulation, bei dem kleine RNAs als Signalmoleküle innerhalb des interzellulären Netzwerks wirken.

Einleitung

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Kleine nicht-kodierende RNAs sind wichtige Akteure in der zellulären Genregulation. Diese Moleküle bestehen aus 20-25 Nukleotiden, die an eine spezifische Ziel-mRNA binden, was zu einer Blockade der Translation oder zum mRNA-Abbau 1 , 2 führt . Der Genregulationsprozess, der von kleinen RNAs wie miRNA und siRNA durchgeführt wird, ist ein hochkonservierter Mechanismus, der in vielen verschiedenen Arten gefunden wurde 3 . Insbesondere sind miRNA-Moleküle von entscheidender Bedeutung für eine Vielzahl von physiologischen Prozessen, einschließlich Proliferation, Differenzierung und Regeneration 4 , 5 . Darüber hinaus wird die Dysregulation der miRNA-Expression vielen pathologischen Störungen zugeschrieben. Entsprechend haben sich miRNAs als Biomarker für die Diagnose und als therapeutische Mittel für die Gentherapie 6 , 7 als geeignet erwiesen .

Gap-Junctions (GJs) sind spezialisierte Proteinstrukturen in der Plasmamembran von zwei benachbarten Zellen, die den diffusionalen Austausch von Molekülen mit einem Molekulargewicht von bis zu 1 kD ermöglichen. Sie haben sich als wichtig für die Gewebeentwicklung, Differenzierung, Zelltod und pathologische Störungen wie Krebs oder Herz-Kreislauf-Erkrankungen erwiesen 8 , 9 , 10 . Es wurden mehrere Moleküle beschrieben, die in der Lage sind, GJ-Kanäle zu kreuzen, einschließlich Ionen, Metaboliten und Nukleotiden. Interessanterweise wurden auch GJs einen Weg für die interzelluläre Bewegung kleiner RNAs 11 , 12 gefunden . So können miRNAs nicht nur innerhalb der Zelle wirken, in der sie produziert werden, sondern auch innerhalb der Empfängerzellen. Dies unterstreicht die Rolle von miRNAs im interzellulären Signaltransduktionssystem. Gleichzeitig zeigen die DatenDiese lückenübergreifende interzelluläre Kommunikation ist eng mit der miRNA-Funktion verknüpft. Aufgrund des signifikanten Einflusses von miRNA und GJs auf die Gewebshomöostase, Pathologie und Diagnose wird ein umfassendes Verständnis der Funktion von GJs und der damit verbundenen interzellulären Dynamik von miRNA dazu beitragen, die Mechanismen von miRNA-basierten Krankheiten zu klären und neue Strategien zu entwickeln MiRNA-Therapien

Abhängig von der Ausdehnung der Lücken-Junction-Kopplung kann die Übertragung von miRNA-Molekülen zwischen den Zellen ein sehr schneller Prozess sein. Daher ist eine Methodik erforderlich, die die Visualisierung und Quantifizierung der schnellen interzellulären Bewegung dieser regulatorischen Signalmoleküle ermöglicht. Häufig wurden Strömungszytometrie und molekularbiologische Techniken angewendet, um das Shuttling von kleinen RNAs 11 , 12 , 13 , 14 zu demonstrieren. Im Gegensatz zu FRAP microsKopie, diese Ansätze fehlen eine hohe zeitliche Auflösung, die bei der Analyse des Austauschs von miRNA über GJs obligatorisch ist. Darüber hinaus ist die FRAP-Mikroskopie weniger invasiv und stellt daher eine leistungsstarke und neuartige Live-Zell-Bildgebung dar, um den GJ-abhängigen Austausch von Molekülen in mehreren Zelltypen 15 , 16 , 17 zu bewerten.

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, das die Anwendung von 3D-FRAP beschreibt, um miRNA-Shuttling zwischen Kardiomyozyten zu beurteilen. Zu diesem Zweck wurden Kardiomyozyten mit fluoreszenzmarkierter miRNA transfiziert. Eine mit dieser miRNA markierte Zelle wurde photobleicht und der spaltübergreifende miRNA-Rückfluss aus benachbarten Zellen wurde zeitabhängig aufgezeichnet. Die hochzeitige Auflösung von FRAP-Experimenten bietet die Möglichkeit, kinetische Untersuchungen zur genauen Auswertung der interzellulären Übertragung von miRNA und siRNA zwischen lebenden Zellen durchzuführen. MehrWenn kleine RNAs über verschiedene Mechanismen mit sehr unterschiedlicher Kinetik ausgetauscht werden können, kann die FRAP-Mikroskopie helfen, zu klären, inwieweit GJs an den jeweiligen Shuttling-Prozessen beteiligt sind 18 . Darüber hinaus kann 3D-FRAP verwendet werden, um physiologische und pathologische Veränderungen in der GJ-Permeabilität und deren Auswirkungen auf den kleinen RNA-Transfer zu untersuchen 15 , 19 .

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Protokoll

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Alle Schritte in diesem Protokoll mit neonatalen Mäusen wurden nach den ethischen Richtlinien für die Tierpflege der Rostock University Medical Center durchgeführt.

1. Vorbereitung der Zellkultur-Gerichte und des Mittels für die Kardiomyozyten-Kultur

  1. Eine Zellkulturplatte mit 0,1% Gelatine in PBS beschichten und bei 37 ° C für 4 h oder bei 4 ° C über Nacht inkubieren. Entfernen Sie die Gelatine und lassen Sie sie unter steriler laminarer Luftströmung trocknen.
  2. Bereiten Sie Zellkulturmedium aus 50 ml DMEM, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin (P / S) vor. Vorwärmen auf 37 ° C.

2. Isolierung von neonatalen Kardiomyozyten

  1. Opfer neonatale Mäuse (1-2 Tage alt) durch Enthauptung mit steriler Schere und öffne die Brust am Sternum. Entfernen Sie das Herz mit Pinzette, während Sie den Thorax zusammen drücken und das Herz in eine 24-Well-Platte mit eiskaltem HBSS überführen(Ohne Ca 2+ und Mg 2+ ).
  2. Entfernen Sie nicht-kardiales Gewebe und größere Gefäße mit steriler Pinzette. Übertragen Sie gereinigte Herzen in ein 1,5 mL Röhrchen mit eiskaltem HBSS. Verwenden Sie für die enzymatische Verdauung maximal 5 Herzen pro Röhrchen.
  3. Hacken Sie die Herzen mit einer kleinen Schere in <0,5 bis 1 mm³ Stücke.
  4. Waschen Sie die gehackten Herzen mit HBSS zweimal durch Aspiration / Zugabe von HBSS mit einer 1-ml-Mikroliter-Pipette. Entfernen Sie die HBSS vollständig, bevor Sie die Enzyme hinzufügen.
  5. Für die enzymatische Verdauung von Neugeborenenherzen verwenden Sie ein handelsübliches Kit und folgen dem Herstellerprotokoll (siehe Tabelle der Materialien ). Schütteln Sie das Röhrchen, das die gehackten Herzen enthält, alle 5 min, während es mit Enzymen bei 37 ° C für 35 min inkubiert.
  6. Samen suspendierte Zellen auf nicht-beschichteten Zellkulturschalen, die Zellkulturmedium für 1,5-2 h enthalten, um die Adhäsion der Nicht-Kardiomyozytenfraktion zu ermöglichen. Wiederholen Sie diesen Schritt, wenn eine hohe ReinheitVon Kardiomyozyten benötigt wird. Falls gewünscht, wird die Nicht-Kardiomyozytenfraktion weiter kultiviert.
    HINWEIS: Für eine Zellsuspension von 15 Herzen kann der Vorplattierungsschritt auf 75 cm² Zellkulturkolben durchgeführt werden. Normalerweise werden ~ 5 x 10 5 Zellen aus einem neonatalen Herzen gewonnen.
  7. Den Überstand in einem 15 ml konischen Röhrchen sammeln und 10 min bei 300 x g zentrifugieren. Resuspendieren der Zellen in 1 ml Zellkulturmedium.
  8. Zählen Sie die Zellen mit einem Neubauer Kammer-Hämocytometer, oder verwenden Sie eine gleichwertige Methode.
  9. Platten-isolierte Kardiomyozyten auf 6-Well-Platten mit einer Dichte von 3 x 10 5 Zellen / cm². Inkubieren der Zellen über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2 .
    HINWEIS: Optional können auch Zellen an dieser Stelle transfiziert werden. Jedoch wurde eine erhöhte Lebensfähigkeit beobachtet, wenn die Zellen für einen Tag kultiviert wurden, bevor sie einer Elektroporation unterworfen wurden.

3. Transfektion mit fluoreszenzmarkierter miRNA

  1. Vor-Warmzellkulturmedium (siehe Schritt 1.2) bis 37 ° C in einem Wasserbad oder einem gleichwertigen Gerät.
  2. Bereiten Sie eine 20 μM Stammlösung der fluoreszierenden miRNA in RNase-freiem sterilem Wasser vor.
  3. Elektroporationspuffer, der 90 mM Na 2 HPO 4 , 90 mM NaH 2 PO 4 , 5 mM KCl, 10 mM MgCl 2 und 10 mM Natriumsuccinat enthält, zubereiten und den pH-Wert auf 7,2 einstellen; Elektroporationspuffer kann bei -20 ° C für mehrere Monate gelagert werden.
  4. Die Zellen aus der Kulturschale mit 0,05% Trypsin für 5 min abtrennen. Inaktivieren Sie das Trypsin durch Zugabe von Zellkulturmedium.
  5. Zählen Sie die Zellen mit einem Neubauer Kammer-Hämocytometer, oder verwenden Sie eine gleichwertige Methode. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 xg für 10 min.
  6. Resuspendieren der Zellen in Elektroporationspuffer, um eine Konzentration von 4 · 10 & sup5; Zellen pro 100 & mgr; l zu erhalten.
  7. Mischen Sie 100 μl Zellsuspension mit fluoreszierender miRNA (Endkonzentration: 0,25 μM) in einem Röhrchen undDie Mischung in eine Elektroporationsküvette geben.
    1. Empirisch bestimmen die entsprechende Menge an miRNA, je nach Zelltyp.
  8. Führen Sie die Elektroporation mit einem Elektroporation Gerät (siehe Tabelle der Materialien ), mit dem "G-009" -Programm .
  9. Fügen Sie 500 μl vorgewärmtes Zellkulturmedium hinzu und übertragen Sie die gesamte Zellsuspension (4 x 10 5 Zellen) in eine Vertiefung eines 4-Well-Glasbodenkammer-Objektträgers. Kultur die Zellen für 1 Tag bei 37 ° C in einer 5% CO 2 -Atmosphäre.
    HINWEIS: Für die FRAP-Analyse ist eine Zelldichte von ~ 80% optimal. Die Transfektion der markierten miRNA sollte ausschließlich unter Verwendung von Elektroporation durchgeführt werden. Da die homogene Verteilung der markierten miRNA-Moleküle für die FRAP-Messung vorteilhaft ist, wird eine Reagenz-basierte Transfektion nicht empfohlen.

4. Anwendung der 3D-FRAP-Mikroskopie (Tag 3)

  1. Den Mikroskop-Inkubator auf 37 ° aufwärmenC und schalten das konfokale Mikroskopsystem mindestens 2 h vor der FRAP-Messung ein, um ein thermisches Gleichgewicht zu schaffen und die Möglichkeit der Drift zu verringern. Wenn möglich, halten Sie eine 5% CO 2 Atmosphäre.
  2. Setzen Sie den Kammerschieber in den Bühnenprobenhalter ein.
  3. Finden Sie einen Cluster von transfizierten Kardiomyozyten mit einem 1,4 NA Ölobjektiv (400fache Vergrößerung) und 561 nm Laseranregungslicht bei niedriger Laserleistung mit einem Erfassungsbereich von 570-680 nm.
    HINWEIS: Die Definition der FRAP-Einstellungen, die Bilderfassung und die Analyse erfolgte mit mikroskopisch-spezifischer Software (siehe Tabelle der Materialien ).
  4. Aktiviere die "z-Stack", "Time Series", "Bleichen" und "Regionen" im "Setup Manager".
  5. Definiere die FRAP-Parameter.
    1. Definieren Sie die Bildaufnahmeeinstellungen im Menü "Acquisition Mode", indem Sie die "Frame Size" einstellen4; Auf 512 x 512, der "Zeilenschritt" auf 1 und die "Scanzeit" auf <1 s.
    2. Im Menü "Kanäle" können Sie die Laserleistung einstellen, die Offset- und Verstärkungseinstellungen einstellen, um eine maximale Fluoreszenz von minimaler Laseranregung zu erhalten ( z. B. Laserleistung: 1-5%); Anpassen, um die Intensitätssättigung zu vermeiden. Stellen Sie die "Pinhole Size" auf 2 μm ein.
    3. Als nächstes wählen Sie im Menü "Regionen" das "ROI-Zeichenwerkzeug" und verwenden Sie den Cursor, um die Zielzelle, die Referenzzelle und den Hintergrundbereich zu markieren. Bei Bedarf wählen Sie mehrere Zielzellen für das Photobleichen.
    4. Passen Sie die Photobleaching-Einstellungen im Menü "Bleichen" an ( zB Iterationen: 9-14, Laserleistung für Photobleaching: 100%, Intervall der Bilderfassung: 60 s, Zyklen: 15). Definieren Sie den Beginn des Bleichens nach 3 ersten Scans.
    5. Im "z-Stack" -Menü definieren Sie die Grenzen für die Z-Stack-Erfassung, abhängig von der Dicke der Zellen. Stellen Sie die "Zahl oF z-Schichten "bis 12 - 15.
    6. Starten Sie das FRAP-Experiment und notieren Sie die Fluoreszenzwiederherstellung.
      HINWEIS: Da die Einstellungen eines FRAP-Experiments von dem Zelltyp, dem Fluoreszenzfarbstoff und dem Mikroskopsystem abhängen, ist es am besten, Pilotversuche durchzuführen, um die optimalen Parameter für FRAP zu bestimmen. Das Bleichen sollte ausreichen, um die anfängliche Fluoreszenzintensität um mindestens 50% zu reduzieren. Typischerweise sollte die Fluoreszenz-Erholung alle 30-60 s aufgezeichnet werden, bis die Plateau-Phase erreicht ist.

5. Datenanalyse

  1. Erstellen Sie maximale Projektionen der aufgenommenen Z-Stacks und erhalten Sie Fluoreszenzintensitätswerte der gebleichten Zielzellen, der Referenzzelle und des Hintergrunds. Mit mikroskopspezifischer Software klicken Sie auf "Bearbeiten" → "Maximale Intensitätsprojektion" → Datei auswählen → "Anwenden".
    1. Alternativ verwenden Sie ein entsprechendes Bildanalysegerät ( z. B. ImageJ).
  2. Kopiere die Fluoreszenzintensitätsdaten zu allen Zeitpunkten aus der Zielzelle, dem Hintergrund und der Referenzzelle in eine Tabellenkalkulation.
    1. Subtrahieren Sie die Hintergrundintensität und die Intensität der Referenzzelle von den Intensitätswerten der Zielzelle, um das bei der Erfassung verursachte Photobleichung zu korrigieren. Führen Sie für jeden Zeitpunkt Hintergrund- und Referenzzellenkorrekturen durch.
    2. Normalisieren Sie die korrigierten FRAP-Daten auf die anfängliche Fluoreszenzintensität vor dem Bleichen, indem Sie jeden Wert durch die anfängliche Fluoreszenz dividieren.
    3. Um FRAP-Kurven zu erhalten, setzen Sie die Grundlinie auf die Fluoreszenzintensität unmittelbar nach dem Bleichen, indem Sie von den Intensitätswerten jedes Zeitpunktes subtrahieren.

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Ergebnisse

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Hier präsentieren wir die 3D-FRAP-Mikroskopie als nicht-invasive Technik, um die lückenübergreifende Shuttling von fluoreszierenden miRNA innerhalb neonataler Kardiomyozyten zu untersuchen. Die isolierten Kardiomyozyten zeigten das typische, gestreifte & agr; -Aktininmuster und enthielten große Plaques von Cx43 entlang der Zellzellgrenzen ( 1A , weiße Pfeilspitzen), was den hohen interzellulären Fluss von Molekülen ermöglichte. Die Reinheit der isolierte...

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Diskussion

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MiRNAs sind Schlüsselakteure in der zellulären Physiologie und wurden als Signalmoleküle bezeichnet, indem sie unter anderem - GJs als Weg für den interzellulären Austausch 11 , 12 , 22 - verwendet wurden . Das aktuelle Protokoll stellt eine in vitro- Live-Zell-Bildgebung dar, um dieses GJ-abhängige Shuttling unter Verwendung fluoreszierender miRNAs innerhalb von Zellclustern zu charakterisieren.

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde vom Bundesministerium für Bildung und Forschung Deutschland (FKZ 0312138A und FKZ 316159), dem Staat Mecklenburg-Vorpommern mit EU-Strukturfonds (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 und ESF / IVBM-B35-0010 / 12), die DFG (DA1296-1) und die Deutsche Herzstiftung (F / 01/12). Darüber hinaus wird RD durch das FORUN-Programm des Rostock University Medical Centers (889001), der DAMP Foundation und des BMBF (VIP + 00240) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
NMRI-Mäuse für NeugeboreneCharles River
GelatinSigma AldrichG70410,1% ige Lösung in PBS, sterilisiert
PBSPan BiotechP04-53500
Dulbecco & akut; s modifiziertes MediumPan BiotechP04-03550
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122100 U/ml, 100µ g/mL
Fötales RinderserumPan BiotechP30-3306
Zellkultur-KunststoffTPP
Primäres Kardiomyozyten-IsolationskitThermo Fisher Scientific88281
HBSSThermo Fisher Scientific88281im primären Kardiomyozyten-Isolationskit enthalten
TrypanblauThermo Fisher Scientific15250061
miRIDIAN Dy547 markierte microRNA MimicDharmaconCP-004500-01-05löst sich in RNAse freiem Wasser, Stammlösung 20µ M
Natriumphosphat einbasischSigmaS3139
Natriumphosphat zweibasischCarl RothT877.2
KaliumchloridSigmaP9333
MagnesiumchloridServa28305.01
NatriumsuccinatCarl Roth3195.1
0,05% Trypsin/EDTA-LösungMerckL2153
4-Well-Objektträger mit GlasbodenkammerIBIDI80827beschichtet mit 0,1%iger Gelatinelösung
Amaxa Nucleofector IILonzaProgramm G-009 wurde für die Elektroporation verwendet 
LSM 780 ELYRA PS.1 SystemZeiss
Excel SoftwareMicrosoft
α-Actinin AntikörperAbcamab9465Verdünnung 1:200
Connexin43 AntikörperSanta Cruzsc-9059Verdünnung 1:200
Ziege Anti-Maus Alexa 594 AntikörperThermo Fisher ScientificA-11005Verdünnung 1:300
Anti-Kaninchen Alexa 488 AntikörperThermo Fisher ScientificA-11034Verdünnung 1:300
Connexin43 siRNAThermo Fisher ScientificAM16708 ID158724Endkonzentration 250 nM
Nah-IR Lebende/tote Zellen FärbekitThermo Fisher ScientificL10119
CellTrace Calcein Rot-OrangeThermo ScientificC34851
DAPI KernfärbungThermo ScientificD1306

Referenzen

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Gap Junction TransfermiRNA Austausch3D FRAP MikroskopieFluoreszenzerholungKardiomyozytenkulturElektroporationsverfahrenConnexin43 ExpressionLive Cell ImagingFluoreszenz RNA TrackingPhotobleaching Analyse

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