Musterung bioaktive Proteine oder Peptide auf Hydrogel mit Photochemie für biologische Anwendungen

Summary

Bei dieser Methode verwenden wir Photopolymerisation und klicken Sie auf Chemie Techniken zum Erstellen von Protein oder Peptid Mustern auf der Oberfläche von Polyethylenglykol (PEG) Hydrogele, Bereitstellung immobilisiert bioaktiven Signale für die Erforschung der zellulären Reaktionen in-vitro- .

Abstract

Es gibt viele biologische Reize, die Zelldifferenzierung Verhalten und Stammzellforschung beeinflussen können. Allgemeine Zelle Kultur Ansätze setzen auf lösliche Faktoren innerhalb des Mediums zu Zelle Regelverhalten. Jedoch können nicht lösliche Zusätze imitieren bestimmte Signal-Motive, wie Matrix-gebundenen Wachstumsfaktoren, Zell-Zell-Signalisierung und räumliche biochemische Cues, die gemeinsamen Einflüsse auf die Zellen sind. Des weiteren Biophysikalische Eigenschaften der Matrix wie Substrat Steifigkeit, eine wichtige Rolle an das Schicksal der Zelle, die mit konventionellen Zelle Kultivierung Praktiken nicht leicht manipuliert werden. Bei dieser Methode beschreiben wir ein einfache Protokoll um gemusterte bioaktive Proteine auf synthetische Polyethylenglykol (PEG) Hydrogele mit Photochemie. Diese Plattform ermöglicht die unabhängige Kontrolle der Substrat-Steifigkeit und räumliche biochemische Cues. Diese Hydrogele erreichen eine große Auswahl an physiologisch relevanten Steifigkeitswerte. Darüber hinaus können die Oberflächen der diese Hydrogele Photopatterned mit bioaktiven Peptiden oder Proteine über Thiol-ene klicken Sie Chemie Reaktionen. Diese Methoden wurden optimiert, um die Proteinfunktion nach Oberfläche Immobilisierung zu behalten. Dies ist ein vielseitiges Protokoll, die Protein oder Peptid von Interesse für eine Vielzahl von Mustern erstellen angewendet werden kann. Schließlich können Zellen ausgesät auf die Oberflächen der diese bioaktiven Hydrogele im Laufe der Zeit überwacht werden, da sie auf räumlich bestimmte Signale zu reagieren.

Introduction

Es gibt viele Reize, die Zelle Verhalten beeinflussen. Im Allgemeinen setzen typische Zelle Kultivierung Techniken auf lösliche Faktoren, die zelluläre Reaktionen hervorrufen; Es gibt jedoch Einschränkungen dieses Ansatzes. Diese Methoden sind nicht in der Lage, alle Signalisierung Motive häufig korrekt anzuzeigen in-vivo. Diese Signalisierung Mechanismen umfassen abgesonderten Wachstumsfaktoren, Zell-Zell-Signalisierung und räumlich-spezifische biochemische Signale. Darüber hinaus Substrat Steifigkeit kann eine wichtige Rolle im Verhalten und Stammzellforschung Zelldifferenzierung und ist nicht leicht zu manipulieren mit gemeinsamen Zelle Kultivierung Praktiken^1,2. Biomaterial Ansätze bieten eine neue Plattform, um diese Signalisierung Mechanismen erforschen anzufangen. Vor allem sind Hydrogele ausgezeichnete Kandidaten für tuning Substrat Steifigkeit^3,4, Immobilisierung Proteine und Peptide^5,6, und erstellen räumlich bestimmten Mustern^{7, 8}.

Hydrogele sind allgemein als Gerüste in Gewebetechnik aufgrund ihrer biophysikalischen und biochemischen Gemeinsamkeiten mit der extrazellulären Matrix (ECM)^9,10verwendet. Natürliche Polymere sind gemeinsame Entscheidungen für Gerüste, wie sie biokompatibel sind und werden in vielen Geweben des Körpers gefunden. Die Beschränkung der Verwendung von natürlichen Polymeren als Substrate ist, dass sie leicht zu manipulieren chemische Moieties für Biokonjugaten fehlt. Auf der anderen Seite sind synthetische Hydrogele als solche wie PEG, hervorragende Plattformen für gezielte Chemikalien^11,12. Darüber hinaus PEG Hydrogele keine zelluläre Reaktion hervorrufen und dienen daher als inerte Backbones für bioaktive Scaffolds erstellen.

Klicken Sie zum Erstellen von bioaktiven Hydrogele Photopolymerisation und Thiol-ene auf Chemie Reaktionen eingesetzt werden. Diese Lichtreaktionen erfordern einen Photoinitiator und eine UV-Lichtquelle. Bei der Einführung von Photoinitiatoren mit UV-Licht brechen Anleihen zu bilden Radikale. Radikale Thesen sind notwendig für die Initiierung der Reaktions aber Protein Bioaktivität^12,13negativ beeinflussen können. Daher ist es entscheidend, Photoinitiator und UV Belichtungszeiten Protein Bioaktivität weiterhin zu optimieren.

Bei dieser Methode werden Hydrogele durch Acrylat-Acrylat Kette Wachstum Photopolymerisation synthetisiert. PEG-Diacrylate (PEGDA) Monomeren reagieren miteinander und bilden verzweigte Polymere Netzwerke verantwortlich für die Struktur der Hydrogel. Die Konzentration der PEGDA Monomere in der Gel-Vorläufer-Lösung steuert die Substrat-Steifigkeit. Aufgrund der geringen Porengröße von Hydrogel, ECM Proteine wie Fibronektin innerhalb der Hydrogel zum Zwecke der Zellhaftung leicht eingebaut werden können. Zu guter Letzt kann diese Hydrogele Oberfläche gemustert mit bioaktiven Peptide oder Proteine über Thiol-ene klicken Sie Chemie Reaktionen. Hier reagiert nicht umgesetzte kostenlose Acrylaten innerhalb des Systems der Hydrogel mit kostenlose Thiole befindet sich auf dem Protein oder Peptid bei UV-Licht ausgesetzt. Nachdem die Proteine oder Peptide auf der Hydrogel-Oberfläche immobilisiert sind, kann das Hydrogel bei 4 ° C für mehrere Wochen gespeichert werden ohne Bioaktivität. Dies bietet Bequemlichkeit, flexible experimentelle Planung und die Möglichkeit für eine Zusammenarbeit zwischen Labors. Insgesamt ermöglicht diese Plattform für biomechanische und räumliche biochemische Kontrolle, unabhängig voneinander, für die Gelegenheit, zelluläre Verhalten beeinflussen.

Protocol

1. Vorbereitung der Materialien für Hydrogel Synthese

1. Prepare Stammlösungen PEGDA, Lithium Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinate (LAP) und Fibronektin unter sterilen Bedingungen und auf der Grundlage Berechnungen (Tabelle 1A).
   1. Abwiegen und Verbindungen in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) auflösen. In der Regel pflegen Sie PEGDA Lösungskonzentrationen zwischen 50 und 200 mg/mL (5-20 % Gewicht/Volumen) arbeiten. Pipette PEGDA Lösung durch einen 0,22-µm-Spritze-Filter für die Sterilisation.
      Hinweis: Halten Sie die PEGDA-Lösungen abgedeckt mit einer Folie einwickeln, um sie vor Licht zu schützen. Bereiten Sie eine frische Lösung (empfohlen) für jedes Experiment PEGDA.
   2. Stellen Fibronektin Protein Pulver basierend auf den Hersteller ' s Empfehlung. Pflegen der Fibronektin-Stammlösung 1 mg/ml, aliquoten es in 60 bis 100 µL Aliquots und bei-20 ° C bis zur Verwendung aufbewahren. Auftauen der Aliquote bei 4 ° C für mehrere Stunden oder über Nacht vor dem Gebrauch. Wenn Protein Lager nicht bereits unter sterilen Bedingungen bereitgestellt wird, verwenden Sie einen 0,22 µm Spritze Filter für die Sterilisation.
      Hinweis: Fibronektin dient zur Befestigung der Zelle. Anderen ECM-Proteine können ersetzt werden.
   3. Runde für die Stammlösung Abwiegen und in PBS auflösen; eine typische Konzentration Lager ist 25 mg/mL. Gibt es irgendwelche Probleme mit Auflösung beschallen. Übergeben Sie die Lösung durch einen 0,22 µm-Filter für die Sterilisation. Decken Sie die Runde mit einer Folie umwickeln und halten Sie es bei 4 ° C für bis zu mehreren Monaten.
      Hinweis: Runde ist der Photoinitiator verwendet für die Photochemie.
2. Hydrogel Bildung steriler Glasformen Folie vorbereiten.
   1. Autoklaven ein Polyester-Merkblatt; man braucht man für jede Gel-Form. Genießen Sie zwei Glasplatten und drei Abstandhalter aus Kunststoff (0,5 mm dick) für jede Gel-Form in 70 % igem Ethanol für mindestens 2 h, aber in der Regel über Nacht einwirken lassen. Fünf Binder Clips für jede Gel-Form in 70 % igem Ethanol für 10 min vor der Verwendung einweichen.
   2. Legen Sie die Glas-Objektträger, Abstandshalter und Binder Clips auf ein kleines autoklaviert Blatt in der Zelle Kultur Haube an der Luft trocken für mehrere Stunden können.
   3. Vorbereiten Hydrogel Formen indem man Abstandhalter aus Kunststoff, um den Rand des einen Objektträger. Legen Sie die zweite Glas-Folie an der Spitze. Sichern Sie die Abstandshalter dicht neben einander mit Bindemittel-Clips, zwei auf jeder Längsseite und an der Spitze.
      Hinweis: Wenn dies nicht korrekt zusammengesetzt ist, die Gel-Lösung wird austreten.
   4. Oberfläche-Sterilisieren der Schimmel mit Zellkultur Gegenlichtblende UV-Licht für 30 min vor dem Gebrauch. Auf halbem Weg durch Umkehren der Schimmel, beide Oberflächen verfügbar zu machen.

2. Proteine mit einer freien Thiol ändern

1. bereiten Stammlösungen mit Berechnungen aus der Tabelle zur Umwandlung von Amin in Thiol auf Proteine (Tabelle 1A).
   1. Die Reaktion-Puffer zu machen anpassen der PBS auf pH 8 und 5 mM EDTA hinzufügen. Pipette Reaktion Puffer in einen 0,22 µm Spritze Filter für die Sterilisation.
      Anmerkung: EDTA ist wichtig, da es verhindert, dass Thiole Disulfid-Bindungen bilden. Thiol-Gruppen bleiben in ihrer reduzierten Form für die Reaktion auf auftreten.
   2. Wiegen, 2-Iminothiolane (Traut ' s Reagens) und lösen Sie es in Reaktion Puffer für eine Stammlösung Konzentration von 2 mg/mL (14 mM). Übergeben Sie die Lösung durch einen 0,22-µm-Spritze-Filter für die Sterilisation. Speichern der Stammlösung bei 4 ° C für bis zu mehreren Monaten.
      Hinweis: 2-Iminothiolane ist das Molekül, das reagiert mit Lösungsmittel ausgesetzt freie Amine auf Proteine und wandelt sie in kostenlose Thiole.
   3. Rekonstruieren das Protein in Reaktion Puffer bei einer Konzentration von 0,1 bis 1 mg/mL. Es sei denn, zuvor sterilen pipette diese Lösung durch einen 0,22-µm-Spritze-Filter für die Sterilisation.
      Hinweis: Dieses Protein ist das biochemische Signal, das auf die Hydrogel-Oberfläche gemustert werden. Auch Proteinkonzentrationen variieren können, höhere Konzentrationen sind ideal für stärkere Proteinmuster.
2. Das Protein mit 2-Iminothiolane reagieren, indem Sie sowohl Stammlösungen vermischen; verwenden Sie Tabelle 1 b, um das korrekte Volumenverhältnis zu berechnen. In der Regel einem Molverhältnis von 8:1-2-Iminothiolane Protein verwenden.
   Hinweis: Für größere Proteine oder mehr verdünnen Sie Konzentration zu, verwenden Sie ein höheres molares Verhältnis von 2-Iminothiolane. Den Hersteller ' s Protokoll ¹⁵.
3. Die Reaktion für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Verwenden Sie eine Entsalzung Spin Mikro-Spalte Thiolated Protein-Produkt aus der verbleibenden Reaktionspartner, nach dem Hersteller entfernen ' s Protokoll ¹⁶.
   Hinweis: Die Ausgrenzung von dieses Harz beträgt 5 KDa.
4. Einsatz Ellman ' s Assay quantitativ messen die Anzahl der kostenlosen Thiole pro Protein. Folgen Sie den Hersteller ' s-Protokoll für den Assay ¹⁷.

3. Hydrogel-Formation

1. erstellen, die Gel-Vorläufer-Lösung auf Werte basierend, aus Tabelle 1 berechnet. Mischen Sie PEGDA, Fibronektin und Runde Mengen. Pipette die Lösung kräftig um eine homogene Lösung zu gewährleisten, aber vermeiden Luftblasen. Die Lösung vor Licht geschützt aufzubewahren.
2. Pipette die Gel-Vorläufer-Lösung vorsichtig zwischen zwei Glasplatten der Gel-Form. Fügen Sie in der Regel ein Volumen zwischen 800 und 1.000 µL an der Form. Setzen Sie die Gel-Lösung in der Form mit UV-Licht (Wellenlänge: 365 nm, Leistung: 3 bis 4 mW/cm ²) für 1 – 2 min. Hydrogel bilden.
   Hinweis: Setzen Sie das Hydrogel mit längerer UV-Licht nicht, wie es die Oberfläche Protein Musterung Funktionen zu begrenzen.
3. Ausziehen der Bindemittel-Clips und entfernen Sie vorsichtig Glasplatte Folie indem gegenüber Druck auf den beiden seitlichen Abstandhaltern.
4. Verwenden eine entsprechend dimensionierte Biopsie-Punch, schneiden Sie die Hydrogel-Proben. Ausstanzen mehrere Hydrogele aus dem Gel Rechteck als Wiederholungen und Kontrollproben.

4. Hydrogel Steifigkeit Messungen

1. Punch, Hydrogele mit 8 mm Durchmesser Biopsie Punch für eine 8 mm parallelen Platten Rheometer. Laden Sie eine Hydrogel Probe in dem Rheometer (siehe die Tabelle der Werkstoffe).
2. Unteren parallel Plattengeometrie d. h. 8 mm im Durchmesser bis zu Kontakt mit der Oberfläche des Gels. Halten Sie einen Abstand von 0,5 mm für eine 0,5 mm dicken Hydrogel Probe.
3. Perform Zeit fegt für 5 min bei 0,1 % Dehnung, 0,1 Hz Frequenz und 37 ° c Durchschnitt der G ' Werte in jeder Zeit Sweep. Führen Sie unabhängige Hydrogele für Wiederholungen jeder Komposition.
   Hinweis: Die G ' Werte stabil sein sollte, über Zeitpunkte; Wenn sie nicht, Prozent belasten und Frequenz-Sweeps durchgeführt werden, um die geeignete auszuwählen Werte ¹⁴.

5. Protein-Musterung

1. bereiten Sie das gewünschte Muster für die Fotomaske mit Hilfe eines Computerprogramms aided Design (CAD). Drucken Sie die Fotomaske auf einer transparenten Folie, die mit einem hochauflösenden Drucker. Einweichen Sie die Fotomaske in 70 % igem Ethanol für 10 min vor der Verwendung. Die Photomaske an der Luft trocknen in einer Zelle Kultur Haube vor dem Gebrauch.
2. Fügen die Thiolated Proteinlösung Oberfläche Musterung in Schritt 2 auf der Oberfläche von Hydrogel vorbereitet. Pipette 1-2 µL/cm ² Thiolated Proteinlösung an die Oberfläche jeder Ausschnitt Gel.
   Hinweis: Es ist wichtig, die Protein-Lautstärke zu minimieren; Fügen Sie nur genug, um gleichmäßig bedecken die gesamte Oberfläche der Probe Hydrogel.
3. Stellen sorgfältig die Fotomaske auf die Oberfläche der Hydrogel. Erlauben Sie keine Luftblasen zwischen den Photomaske und der Hydrogel-Oberfläche. Sanft drücken Sie auf die Maske um alle Luftblasen zu entfernen, dass Form.
4. Aussetzen das Hydrogel in eine zweite Runde von UV-Licht (Wellenlänge: 365 nm, Leistung: 3 bis 4 mW/cm ²) für 30-60 s.
   Hinweis: Es ist wichtig, das Muster gegenüber genügend UV-Licht eine starke Muster erstellen, ohne den Verlust der Proteinfunktion.
5. Waschen die Hydrogele mit PBS entfernen nicht umgesetzte Arten und jede Hydrogel innerhalb der well-Platte. Achten Sie beim Platzieren der Gele in jeder Brunnen; Stellen Sie sicher, dass die gemusterte Oberfläche aufgedeckt ist. Waschen Sie die Gele mit PBS-Puffer bei 4 ° C; Gele sind stabil für mindestens zwei Wochen bei 4 ° c

6. Vorbereiten der Zelle Seeding Hydrogele

1. inkubieren Sie die Gele im basalen Medium für 5-10 Minuten bei 37 ° C vor der Aussaat. Verwenden Sie für menschliche Nabelader Endothelzellen (Mediumwechsel) EGM-2 Medium ohne Wachstumsfaktoren. Minimieren Sie das Volumen des Mediums hinzu kommt jeder gut, Hydrogel schweben zu verhindern. Für einen 48-Well-Platte, ein 250 µL Volumen des Mediums nutzen.
2. Drehen Sie die Platte bei 300 X g für 3 min um sicherzustellen, dass die Hydrogele sich an der Unterseite des Brunnens befinden und nicht schweben. Tun Sie dies sofort vor der Aussaat Zelle.

7. Handy-Aussaat auf Hydrogele

1. Verwendung standard steril Säugerzelle Kultur für die Zelle Aussaat und experimentelle Verfahren. Mediumwechsel aus Gewebe Kulturflaschen mit Standardzellen Ablösung Protokolle entfernen. Das Gewebe Kulturschale mit sterilen PBS waschen und inkubieren Sie mit Trypsin für 3-5 min bei 37 ° c
2. Die trypsiniert Zellsuspension mit überschüssigen Zelle Mittel "oder" Trypsin Neutralisator Lösung zu stillen.
3. Spin-down die Zellsuspension in der Zentrifuge bei 300 X g für 5 min. sorgfältig entfernen den Überstand und halten die Zelle Pellet.
4. Aufschwemmen der Zelle Pellet in basalen EGM-2 mit keine Wachstumsfaktoren. Verwenden Sie eine Hemocytometer für die Zellzählung.
5. Fügen Sie 75.000 Zellen/cm ², jede Hydrogel Oberfläche durch Pipettieren langsam in die Mitte jeder gut um nicht zu stören, die Gele. Legen Sie die well-Platte in einer Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C. Für mehrere Tage, in regelmäßigen Abständen die Schale für Beobachtung entfernen.

8. Bewertung der Bioaktivität

1. Kultur E. Coli über Nacht in der Schwebe in LB Brühe in einer orbitalen Suspension bei 37 ° C und 200 Umdrehungen pro Minute. Spin-down der E. Coli-Kultur, Dekantieren und rekonstruieren die Zelle Pellet in minimalem Volumen von PBS. Das Lysozym Abwiegen und auf 1 mg/mL der Stammlösung rekonstruieren.
2. Pipette eine kleine Menge (25 µL) von Lysozym-Stammlösung in Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie unterschiedlicher Runde Photoinitiator (0-12 mM hinzu) und setzen Sie die Proben auf 1 min von UV-Licht aus. In einer separaten Gruppe Lysozym Lösung die gleiche Menge an LAP (2 mM) hinzu und setzen Sie Proben zu unterschiedlichen UV-Licht-Zeiten (0-4 min.). Wiederholungen für jede Behandlung gehören.
3. Add gleichen Volumen konzentrierte E. Coli-Lösung für jede Lysozym-Probe für eine endgültige Lysozym Protein-Konzentration von 0,5 mg/mL. Die gemischten Lösungen für 4 h bei Raumtemperatur inkubieren.
   Hinweis: Dadurch Zeit für funktionale Lysozym zur lyse der Bakterienzellwand und Proteine in der Lösung lassen.
4. Verwenden Sie unbehandelt Lysozym mit E. Coli für eine Positivkontrolle inkubiert; halten dies für eine 100 % bioaktiven Messung. Lysozym-Lösung inkubiert mit PBS allein als Negativkontrolle.
5. Spin-down der Proben zur Beseitigung Zellenrückstand und des Überstands. Führen Sie einen Bradford-Assay zur Quantifizierung der totale Konzentration des Proteins innerhalb der Überstand zur Messung der bakteriellen lysate.
6. Führen eine Bradford-Test nach Hersteller ' s Protokoll ¹⁸. Berechnen Sie die Falte ändern in Proteinkonzentration im Vergleich zu der negativen Kontrolle.

Results

Das Protokoll zum Erstellen von bioaktiver Mustern auf der Oberfläche der PEG Hydrogele ist in Abbildung 1dargestellt. Eine Tabellenkalkulation wurde entwickelt, um das Volumen und die Konzentration für jedes Stammlösung (Tabelle 1A) zu berechnen. Proteine auf der Oberfläche der Hydrogel immobilisiert werden mit 2-Iminothiolane (Abbildung 1B) geändert. Diese Reaktion erfolgt mit Hilfe der Volumin...

Discussion

Dieses Protokoll stellt eine Methode zum Erstellen von bioaktiven Proteinmuster für biologische Anwendungen. Es gibt einige Änderungen, die Anpassung dieses Protokoll für verschiedene Experimente gemacht werden können. Erstens variieren die Zelle Anschaltebedingungen für verschiedene Zelltypen. Wenn Arme Zelle Anhaftung an die Gele zunächst beobachtet wird, ist es ratsam, Erhöhung der Konzentration des ECM-Proteins innerhalb der Vorläufer-Lösung. Anderen ECM-Proteine können anstelle von Fibronektin, darunter verschiedene...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PEG-Diacrylat (PEGDA)	Laysan Bio	ACRL-PEG-ACRL-3400	Kann auch synthetisiert oder über andere Anbieter gekauft werden. Es können unterschiedliche Molekulargewichte verwendet werden.
Lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat (LAP)			Im Labor synthetisiert
Fibronektin	Corning	356008	Andere Zellanhaftungsproteine können verwendet werden, wie z. B. Laminin, Matrigel
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Sigma	D8537-500ML
Photomask	FineLine Imaging	n/a	Benutzerdefinierte Drucke auf transparenten Folien mit hochauflösender DPI.
Bindemittelklammern	Verschiedene Anbieter
Kompakte UV-Lichtquelle (365 nm)	UVP	UVP-21	Andere UV-Lichtquellen können verwendet werden, eine Kalibrierung der Leistung ist erforderlich.
2-Iminothiolan (Pierce Traut' s Reagenz)	Thermo Sci.	26101
Ellman' s Reagenz: DTNB; 5,5-Dithio-bis(2-nitrobenzoesäure)	Thermo Sci.	22582
Humane Nabelvenendothelzellen (HUVECs)	Lonza		Passagenummer zwischen 6- 10
EGM-2 Medien	Lonza	CC31-56, CC-3162	EGM-2 ohne Wachstumsfaktoren wurde in Experimenten verwendet. Vollständiges EGM-2-Medium wurde für die Zellerhaltung verwendet
0,25 % Trypsin EDTA	Life Tech	25200-056
Trypsin-Neutralisator	Life Tech	R-002-100
Zentrifuge	Verschiedene Venders Hämozytometer
	Hausser Sci. Bright-line
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)	Sigma Aldrich	E6758
0.22&Mikro; m filter	Cell Treat	229743
1mL Spritze
Glas Mikroskop Objektträger	Fisher Sci.	12-550C
Kunststoff Abstandshalter	Verschiedene Verkäufer		0,5 mm Dicke
70% Ethanol	BICCA	2546.70-1
Bio-Shield	Bio-Shield	19-150-0010
Bradford Reagenz	BIO-RAD
Entsalzungsharz - Sephadex G-25	GE Healthcare	95016-754
Microspin Säulen	Thermo Sci.
AR-G2 Rehometer	TA Instruments