Identifizierung und Charakterisierung von metastasierendem Faktoren durch Gentransfer in die neuartige RIP-Tag; RIP-tva Mausmodell

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein Protokoll, um eine neuartige somatische Gentherapie-Transfer-System unter Verwendung RIP-Tag zu demonstrieren; RIP-tva Maus-Modell für die Funktion von Genen in Metastasen zu untersuchen. Die Vogelgrippe Retroviren liefern wir Intracardiacally um Gentransfer in Pre-maligne, nicht-invasive Läsionen des Pankreas β-Zellen bei Erwachsenen Mäusen zu gewährleisten.

Zusammenfassung

Metastasiertem Krebs entfallen 90 % der Todesfälle bei Patienten mit soliden Tumoren. Es ist dringend notwendig, die Treiber von Krebsmetastasen besser zu verstehen und neue therapeutische Targets zu identifizieren. Um molekularen Ereignisse zu untersuchen, die das Fortschreiten von primären Krebs, Metastasen zu fahren, haben wir eine Bitransgenic-Maus-Modell, RIP-Tag entwickelt; RIP-tva. In diesem Mausmodell treibt die Ratte Insulin Promotor (RIP) Ausdruck der SV40 T-Antigen (Tag) und der Rezeptor für Untergruppe ein Virus der Vogelgrippe noch (tva) in pankreatische β-Zellen. Die Mäuse entwickeln neuroendokrine Tumoren der Bauchspeicheldrüse mit 100 % Penetranz durch klar definierte Stadien, die ähnlich wie menschliche Tumorgenese mit Stufen einschließlich Hyperplasie, Adenom, Angiogenese und invasives Karzinom. Weil RIP-Tag; RIP-tva Mäuse entwickeln keine Metastasen, genetische Veränderung, die Metastasierung fördern leicht identifizierbar. Somatische Gentransfer in tva exprimierenden, wuchernden pankreatische β prämaligne Läsionen durch intrakardiale Injektion von Vogelgrippe Retroviren beherbergen die gewünschte genetische Veränderung erreicht wird. Ein Titer von > 1 x 10⁸ infektiösen Einheiten pro ml als angemessen für in-Vivo -Infektion angesehen. Darüber hinaus können Vogelgrippe Retroviren infizieren Zelllinien aus Tumoren in RIP-Tag; RIP-tva Mäuse mit hohem Wirkungsgrad. Die Zell-Linien können auch verwendet werden, metastasierendem Faktoren charakterisieren. Hier zeigen wir wie Sie nutzen dieses Mausmodell und Zell-Linien, um die Funktionen von Kandidatengenen im Tumor Metastasen zu beurteilen.

Einleitung

Die meisten Krebsarten entstehen durch somatische Mutationen ¹. Konventionelle gentechnisch veränderter Mausmodelle (GEMM) haben bedeutende Einblicke in den Beitrag von bestimmten genetischen Veränderungen, die auf Tumorgenese ²zur Verfügung gestellt. Sie haben jedoch mehrere Einschränkungen. Der größte Nachteil dieser Modelle ist, dass sie nicht die sporadische Natur der Tumorbildung im Menschen replizieren, in dem nur einige Zellen innerhalb eines Gewebes genetische Veränderungen erwerben. Die Mutationen in transgenen und Knockout-Mäuse sind auch Keimbahn mit auf die Entwicklung auswirken. Darüber hinaus ist erzeugen d....

Protokoll

Ethik Erklärung: Experimente an Tieren wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften, die vom Institute for Animal Care und Nutzung Ausschuss der Weill Cornell Medizin.

1. Auswahl der Vogelgrippe retroviralen Vektoren (RCASBP A-based oder RCANBP(A)-based)

• Vektoren von Rous Sarkom-Virus ¹¹ abgeleitet wurde. Vogelgrippe retrovirale Vektoren können cDNAs liefern (≤ 2,5 kb), kurze Haarnadel RNAs (ShRNAs), Micro-RNAs (MiRNAs) und andere forensisches RNAs. Die im Handel erhältlichen Vektoren in Materialien aufgeführt sind und ander....

Ergebnisse

Die in Vivo und in Vitro Infektionsrate von RIP-Tag; RIP-tva Tumorzellen durch RCASBP-basierte Viren sind ~ 20 % ~ 80 % bzw. ²⁰. Im RIP-Tag; RIP-tva Mausmodell, etwa 4 % der 400 Pankreas Inseln in jedem Mausklick entwickeln sich natürlich in Tumoren ²⁰; Daher ist die ausreichende Menge an Tumorzellen in jeder Maus für histologische und phänotypische Analyse der möglichen Wirkung der Gene, die durch die Vir.......

Diskussion

In dieser Studie haben wir eine mächtige Maus-Modell, RIP-Tag beschrieben; RIP-tva, , somatische Gentherapie Lieferung über Vogelgrippe Retroviren zur Identifizierung und Charakterisierung von metastasierendem Faktoren zu erreichen. Obwohl RIP-Tag; RIP-tva Mäuse entwickeln neuroendokrine Tumoren der Bauchspeicheldrüse, metastasierendem Faktoren identifiziert in diesem Mausmodell können auch Metastasen von anderen Krebsarten fördern.

Unser Ansatz hat den Vorteil der Einführung.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
RCASBP-Y DV-Plasmid	Addgene	11478
RCAS-RNAi-Plasmid	Addgene	15182
DMEM	Corning	10-013-CV
fötales Rinderserum	Atlanta Biologicals	25-005-CI
L-Glutamin, 100x	Corning	25-005-CI
Penicillin-Streptomycin-Lösung, 100x	Corning	30-002-CI
PBS-/-, 1x	Corning	21-040-CV
Superfect	Qiagen	301305
Polyallomer Zentrifugenröhrchen	Beckman Coulter	326823
0,45 mm Nalgene Spritzenvorsatzfilter mit PES-Membran	Thermo Scientific	194-2545
Insulinspritzen	BD
Synaptophysin	Vector Laboratories	VP-S284
VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Kaninchen IgG)	Vector Laboratories	PK-6101
AmpliTaq DNA-Polymerase mit Puffer II	Life Technologies	N8080153
MyTaq DNA-Polymerase	Bioline	BIO-21106