Hier zeigen wir einen neuartigen Ansatz zur Verwendung von hochauflösenden spectral-Domain optische Kohärenztomographie (HR-SD-OCT) Lieferung der Gen-Therapie-Agenten in den subretinalen Raum zu unterstützen, beurteilen seine areal Abdeckung und Photorezeptor Vitalität zu charakterisieren.
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Methodenartikel
Höchste Auflösung Maus optische Kohärenztomographie, intraokulare Injektion in die retinale Gentherapie Forschung unterstützen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
HR-SD-OCT wird genutzt, um das Fortschreiten der Degeneration der Photorezeptoren in live Mausmodellen überwachen, bewerten die Lieferung von Therapeutika in den subretinalen Raum und Toxizität und Wirksamkeit in Vivozu bewerten. HR-SD-OCT in der Nähe von Infrarot-Licht (800-880 nm) verwendet und hat Optik speziell für die einzigartige Optik des Auges Maus mit Sub-µm-2 axiale Auflösung ausgelegt. Transgenen Mausmodellen der äußeren Netzhaut (Photorezeptoren) Degeneration und Steuerelemente wurden abgebildet, um das Fortschreiten der Erkrankung zu bewerten. Gezogenem Glas Mikronadeln wurden verwendet, um Sub retinalen Injektionen von Adeno-assoziierte Virus (AAV) oder Nanopartikeln (NP) über einen Trans-skleralen und Trans-choroidale Ansatz liefern. Sorgfältige Positionierung der Nadel in den subretinalen Raum bedurfte es vor einem kalibrierten Druck Injektion, die Flüssigkeit in den Sub-Netzhaut-Raum liefert. Real-Time subretinalen Chirurgie wurde auf unserer Netzhaut imaging-System (RIS) durchgeführt. HR-SD-OCT demonstriert schrittweise einheitliche Netzhautdegeneration durch Ausdruck einer toxischen mutierten menschlichen mutierten Rhodopsin (P347S) (RHOP347S) Transgene Mäuse. HR-SD-OCT ermöglicht konsequente Quantifizierung der Netzhaut Schichten. Nukleare Außenschicht (ONL) Dicke und Photorezeptor äußere Segment Länge (OSL) Messungen korrelieren mit Photorezeptor Vitalität, Degeneration oder Rettung. Die RIS-Delivery-System ermöglicht Echtzeit-Visualisierung von subretinalen Injektionen bei Neugeborenen (~ P10-14) oder erwachsener Mäuse und HR-SD-OCT sofort Karten areal Umfang und entscheidet über den Erfolg der Lieferung. HR-SD-OCT ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das den Erfolg der subretinalen Chirurgie bei Mäusen, zusätzlich zur Vitalität der Photorezeptoren in VivoMessung auswerten können. HR-SD-OCT kann auch verwendet werden, um einheitliche Tier Kohorten um das Ausmaß der Degeneration der Netzhaut, Toxizität und therapeutische Rettung in präklinischen Forschung Gentherapiestudien bewerten zu identifizieren.
Einleitung
Forscher entwickeln Gentherapien für eine Vielzahl von Netzhaut und Netzhaut degenerativen Erkrankungen mit der Hoffnung der Übersetzung neuen Therapeutika in Behandlungen für menschliche Krankheit1,2,,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. Zeitbereich oder spectral-Domain optische Kohärenztomographie (SD....
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Protokoll
Tier-Protokolle wurden überprüft und genehmigt durch die institutionelle Animal Care und Nutzung Ausschüsse des VA WNY HCS und der University at Buffalo-SUNY. Tiere wurden nach den Vorgaben des Vereins for Research in Vision und Ophthalmology (ARVO) und der Deklaration von Helsinki eingesetzt.
(1) Maus-Modellen
- Identifizieren Sie Maus-Modellen einschließlich Kontrollen ausgewertet werden.
Hinweis: Bildgebung erfolgte für eine C57BL/6(J), hC1/hC1 / / mWT/mWT, ein teilweise vermenschlichten Netzhautdegeneration Mausmodell homozygot für menschlichen mutierten RHOP347S hC1 Allele auf dem Wildtyp....
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Ergebnisse
Bewertung der Anwesenheit, Rate und Einheitlichkeit der äußeren Netzhautdegeneration Modell
Messungen der ONL waren ELM, definieren die Grenzen der ONL mit dem Bremssattel-Werkzeug in der Gerätesoftware zur Verfügung gestellt von der OPL aufgezeichnet. Ziel war es, das Fortschreiten der äußeren Netzhautdegeneration in einem Mausmodell teilweise vermenschlichten AdRP zuordnen. Vergleichbare Bilder aus einer Kontrolle C57BL/6(J) Maus und ein hC1/hC1 / / mWT/mWT-Maus-Mode.......
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Diskussion
HR-SD-OCT bietet eine einfache Methode zur Charakterisierung von potenziellen Tiermodellen der Krankheit beim Menschen zu bestimmen, ihre Nützlichkeit bei der Prüfung möglicher Therapeutika. Die Fähigkeit, schnell und zuverlässig eine potenzielle Tiermodell für menschliche Krankheiten zu charakterisieren ist entscheidend für den Prozess der therapeutischen Arzneimittelforschung (z.B.gen-Ersatz-Therapie, Ribozyme oder ShRNA Knockdown Gentherapie, kombinierte Gentherapie). HR-SD-OCT bietet eine einfache, schnelle .......
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Offenlegungen
Geschäftliche Beziehungen: MCB: keine; JMS: keiner. Das Retinal imaging System (RIS)23 in dieser Studie verwendeten ist ein neuartiges Gerät umfangreiche Verwendung keiner Gruppe Lieferung Gentherapiestudien in Mäuse, Nagetiere oder kleine Tiere durchführen wollen. Während die Autoren keine Konflikte in Bezug auf dieses Gerät zu diesem Zeitpunkt zu deklarieren haben, der University at Buffalo - SUNY und der Veterans Administration haben Rechte am geistigen Eigentum und kann versuchen, dieses Instrument in Zukunft zu vermarkten.
Danksagungen
Dieses Material basiert auf der Arbeit unterstützt, unter anderem durch das Department of Veterans Affairs (VA), Veterans Health Administration, Office of Research und Development (biomedizinische Forschung im Labor und Entwicklung) (VA Verdienst Grant 1I01BX000669). JMS ist, teilweise als Arzt-Mitarbeiterin, Augenheilkunde, VA WNY angestellt; MCB wird teilweise von VA WNY beschäftigt. Die Studie wurde an durchgeführt und teilweise von der Veterans Administration Western New York Healthcare System (Buffalo, NY) unterstützt. Inhalt repräsentieren nicht die Ansichten des Department of Veterans Affairs oder Regierung der Vereinigten Staaten. Auch unterstützt, im großen T....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| C57BL6 (J) | Jackson Laboratories | 664 | |
| N129R-N | /A | N/A | |
| 2HRho 1T/1T | N/A | N/A | |
| Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT) | Bioptigen | 90-R2200-U1-120. | |
| Retinal Imaging System (RIS) | Hauseigenes | N/A | |
| Stemi 2000C Mikroskop | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| P-97 Flammender/Brauner Mikropipettenabzieher | Sutter Instrument Co | p-97 | |
| MMN-33 Mikromanipulator | Narishige USA | MMN-33 | |
| PLI-100 Mikroinjektor | Harvard Apparatus | 64-1736 | |
| Mikropipettenhalter (rotierend) | Hauseigener | N/A | |
| Mikropipetten-Aufbewahrungsbehälter | World Precision Instruments Inc. | E210 | |
| Kapillarrohre aus Borosilikatglas 1,5-1,8 x 100 mm, | Harvard Apparatur | 30-0053 | |
| 2,2,2-Tribromethanol | SIGMA Aldrich | T48402-25G | |
| Tert-Amylalkohol | SIGMA Aldrich | 240486-100ML | |
| Atropinsulfat Ophthalmische Lösung, USP 1% | Akorn Inc. | NDC 17478-215-05 | |
| Goniovisc | BioVision Limited | NDC 17238-610-15 | |
| Cyclopentolathydrochlorid Ophthalmische Lösung, USP 2% | Akorn Inc. | NDC 17478-097-10 | |
| Gentamicinsulfat-Salbe USP, 0,1% | Perigo | NDC 45802-046-35 | |
| Systane Ultra | Alcon Laboratories, Inc. | 9006619-1013 | |
| Tetracainhydrochlorid | Bausch und Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| Ophthalmische Lösung, USP 0,5% | Bausch und Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| DPBS | Gibco Life Technologies | 14190-136 | |
| Viruspräparate | ViGene /UNC | N/A | |
| Gold Nanostäbchen | NANOPARTz | D12M-850-1.75 | |
| Fluoresceinsulfat AK-FLUOR 25% | Akorn Inc. | NDC 17478-250-20 | |
| Deckgläser | Fisher Scientific | 12-548-A | |
| Pinzette | Milton | 18-825 | |
| Nadeln 30 | Gauge Beckton Dickenson & | W11604 | |
| Spritzen | Beckton Dickenson | ||
| Bioptigen Softwarepaket | Bioptigen | N/A | |
| Proparacainhydrochlorid Ophthalmic Solution, USP 0,5% | Akorn Inc. | NDC 17478-263-12 | |
| Windows Excel | Microsoft | N/A | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Waage | Mettler | ||
| Schere | World Precision Instruments | ||
| Ohrlocher | Nat' l band | ||
| CL 100 Lichtquelle | Welch Allyn | CL100 | |
| Stickstoffgas | Jackson Schweißzubehör | N/A | |
| Beheiztes Wasserbad | Neslab | RTE-140 | |
| Heizplatte | Im Haus | N/A | |
| Heizmatte | Cincinnatti Sub Zero | 273 | |
| Clay Maushalter | Plast.i.clay American Art Clay Co. | N/A | |
| Betadine | MedLine | NDC53329-938-06 | |
| Wattestäbchen-Applikatoren | American Health Service | Ctag | |
| EtOH 70% | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| Handschuhe Nitril | VWR | 89038-272 | |
| Diagnosys ERG Color Dome Instrument | Diagnosys Inc. | D125 | |
| Kontaktlinsen | Inhouse | N/A | |
| Diagnosys Software | Diagnosys Inc. | N/A | |
| Origin 6.1 Software | OriginLab Corp. | N/A | |
| Referenzelektroden | Ocuscience | F-Gewinde-Elektrode (DTL) 24" |
Referenzen
- Regus-Leidig, H., et al. In-vivo knockdown of Piccolino disrupts presynaptic ribbon morphology in mouse photoreceptor synapses. Front Cell Neurosci. 8 (259), 1-13 (2014).
- Jiang, L., Frederick, J. M., Baehr, W.
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Nachdrucke und Genehmigungen
