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Methodenartikel

Influenza-A-Virus-Studien in einem Mausmodell der Infektion

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DOI:

10.3791/55898

⸱

7. September 2017

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester School of Medicine and Dentistry

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Influenza A-Viren (IAVs) sind wichtige Humanpathogene Atemwege. Die Pathogenität von IAVs verstehen und neuartigen Impfstoff präklinischen Erprobung durchführen, sind Tiermodelle imitiert menschliche Physiologie erforderlich. Hier beschreiben wir Techniken zur Bewertung IAV Pathogenese, humorale Reaktionen und Wirksamkeit des Impfstoffes mit einem Maus-Modell der Infektion.

Zusammenfassung

Influenza-Viren verursachen mehr als 500.000 Todesfälle weltweit1 und eine jährliche Gebühr von 12 Milliarden US-Dollar in den Vereinigten Staaten allein in Anbetracht direkte medizinische und Krankenhausaufenthalt Kosten und Arbeit Absentismus2zugeordnet sind. Tiermodelle sind entscheidend für Influenza A Virus (IAV) Studien zur Bewertung virale Pathogenese, Wirt-Pathogen Interaktionen, Immunreaktionen und nähert sich die Wirksamkeit der laufenden bzw. neuartige Impfstoff sowie antivirale Medikamente. Mäuse sind vorteilhaft kleine Tiermodell, weil ihr Immunsystem evolutionär ähnelt, findet man bei Menschen, es gibt Sie von kommerziellen Anbietern als genetisch identische Themen, gibt es mehrere Stämme, die ausgenutzt werden können, um zu bewerten die genetische Grundlage von Infektionen, und sie sind relativ preiswert und leicht zu manipulieren. Um die IAV-Infektion beim Menschen über die Atemwege zu rekapitulieren, werden Mäuse zuerst vor der intranasale Inokulation mit infektiösen IAVs unter richtigen Biosafety Containment betäubt. Nach Infektion wird die Pathogenese der IAVs bestimmt, indem Sie täglich die Morbidität (Körper-Gewicht-Verlust) und Sterblichkeit (überleben). Darüber hinaus kann virale Pathogenese auch ausgewertet werden, durch die Replikation des Virus in die obere (Nasenschleimhaut) oder der unteren Atemwege (Lunge), von infizierten Mäusen Bewertung. Humorale Reaktionen bei der IAV-Infektion durch nicht-invasive Blutungen und sekundäre Antikörpernachweis schnell auswertbar Assays abzielen, das Vorhandensein von insgesamt oder neutralisierenden Antikörpern. Hier beschreiben wir die gängige Methoden, Mäuse intranasal zu infizieren (i.n) mit IAV und Pathogenese, humorale Immunantwort und Schutz Wirksamkeit zu bewerten.

Einleitung

IAVs sind behüllte Viren in der Orthomyxoviridae Familie3eingestuft. Sie enthalten acht einsträngige RNA-Moleküle mit negativer Polarität3. Beim Menschen verursachen IAVs saisonal Epidemien und gelegentliche Pandemien wichtige Konsequenz, wenn neuartige Viren in der menschlichen Bevölkerung4eingeführt werden. Darüber hinaus werden saisonale IAVs hoch und schnell von Mensch zu Mensch produziert eine erhöhte wirtschaftliche Verluste weltweit jedes Jahr2,5übertragen. IAV Symptome sind Husten, verstopfte Nase, Fieber, Unwohlsein, Kopfschmerzen, Magersucht und Muskelschmerzen, aber das Virus kann auch eine schwere Krankheit bei immungeschwächten Patienten6produzieren. In der Tat, rechnet die World Health Organisation (WHO) vor, dass saisonale Influenza-Viren 300.000-500.000 Todesfälle weltweit pro Jahr1 verursachen. Es gibt nur zwei Arten von Medikamenten, die derzeit von der Food and Drug Administration (FDA) für Influenza-Prophylaxe und Therapie beim Menschen zugelassen: Neuraminidasehemmer (NA) (z.B. Oseltamivir) und Blocker des Ionenkanals M2 (z.B. Amantadin); die Entstehung von resistenten Viren-Varianten ist jedoch eine zunehmende Besorgnis. Impfung, bleibt daher die beste medizinische Möglichkeit, Menschen gegen IAVs Infektionen zu schützen. Bisher wurden drei Arten von Influenza Impfstoffe zugelassen von der FDA für den menschlichen Gebrauch zur Verfügung: rekombinante virale Hämagglutinin (HA) Protein Impfstoffe, inaktivierten Influenza-Impfstoffe (IIV) und live-gedämpft Influenza-Impfstoffe (LAIV)5, 7. die drei Impfstoffe sind entworfen, um gegen das virale HA-Protein, das große Ziel von neutralisierenden Antikörpern gegen IAVs adaptive Immunantwort zu induzieren.

Eine validierte Mausmodell IAV Infektion in Vivo zu studieren

Tiermodelle wurden verwendet, um, unter anderem IAV Pathogenese8,9,10,11, virale Faktoren zu untersuchen, die zu Krankheit12 und/oder viralen Übertragung13 beitragen ,14, und testen Sie die Wirksamkeit der neuen Impfstoffe oder antivirale Medikamente9,10,15. Mäuse (Mus Musculus) sind die am häufigsten verwendeten Tiermodell für IAV Forschung aus mehreren Gründen: 1) das Immunsystem ist evolutionär ähnlich präsentieren, beim Menschen; (2) low-cost, einschließlich Tier Kauf, Gehäuse und Reproduktion; (3) kleine Größe zu bearbeiten und zu speichern; (4) minimal Host Variabilität, homogene Antworten und Ergebnisse zu erhalten; (5) eine große Kenntnis der Mäuse Biologie, einschließlich Genomsequenz; (6) viele verfügbare Molekularbiologie bzw. Immunologie Reagenzien; (7) zur Verfügung Knock-out Mäuse (KO), den Beitrag eines bestimmten Host-Proteins auf virale Infektion zu studieren; und 8) mehrere Maus-Stämmen, die ausgenutzt werden können, um die genetischen Grundlagen von Infektionen zu bewerten.

Es gibt verschiedene Mausstämme derzeit für IAV in Vivozu studieren. Alter, Immunstatus, Geschlecht, genetische Hintergrund und Maus Belastung sowie Routen der Infektion, Dosis und Virenstämme Einfluss auf den Ausgang der IAV-Infektion bei Mäusen. Die am häufigsten verwendeten Mausstämme IAV Forschung verwendeten sind C57BL/6, BALB/C und, in jüngerer DBA.2 Mäuse, da sie anfälliger für IAV Krankheit als die beiden ehemaligen Stämme16,17,18, sind 19 , 20. wichtiger ist, die Immunantwort auch können abweichen, je nach der Maus Belastung18,19,20. Daher ist es sehr wichtig, um alle verfügbaren Informationen über die Maus und die IAV Sorte wählen Sie die beste Option für das Experiment durchgeführt werden zu erholen.

Obwohl die Maus eine gute Tiermodell Infektionsrisiko für in Vivo Studien mit IAV ist, haben sie mehrere Einschränkungen, die in der experimentellen Gestaltung berücksichtigt werden müssen. Zum Beispiel ist eine große Einschränkung der Verwendung von Mäusen für in Vivo Studien, dass IAVs nicht unter Mäuse übertragen. So, für die Übertragung Studien, akzeptiert Tiermodelle (z.B.Frettchen oder Meerschweinchen) sind gebrauchte16,17,21. Darüber hinaus gibt es einige Unterschiede zwischen den Manifestationen der IAV bei Mäusen und Menschen. Im Gegensatz zum Menschen entwickeln Mäuse nicht Fieber bei IAV Infektion; im Gegensatz dazu präsentieren sie mit Hypothermie16,17. Bei Mäusen konzentriert sich IAV Replikation in den unteren Atemwegen (Lunge) anstatt der oberen Atemwege. So korreliert Virulenz der IAV in Mäusen nicht immer in Menschen gesehen. Insgesamt, weil die Vorteile der begrenzten Nachteile überwiegen, stellt Maus erste Tiermodell verwendet, um virale Pathogenese der Grippe, Immunogenität und Schutzwirkung im Impfstoff und antivirale Studien bewerten. Darüber hinaus wäre es nicht vertretbar, Studien mit IAV mit großen Tiermodellen ohne vorherigen Nachweis in einer kleinen Tiermodell der IAV-Infektion. In dieser Handschrift die, wir beschreiben, wie Mäuse intranasal infiziert (i.n.) mit IAV, wie der Schweregrad und Fortschritten der viralen Infektion und zur Durchführung der Experimente erforderlich, um die humorale Immunantwort und Schutz Wirksamkeit bewertet.

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Protokoll

alle tierischen Protokolle, die hier beschrieben wurden durch die institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) und der institutionellen Biosafety Committee (IBC) an der University of Rochester School of Medicine and Dentistry zugelassen und erfüllt mit den Empfehlungen in der Anleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Research Council 22. Die Einrichtungen und Programme der Vivarium und Division des Tieres Labormedizin der Schule von Medizin und Zahnmedizin sind von AAALAC International akkreditiert und Staatsrecht, Bundesgesetz und National Institute of Health (NIH) Richtlinie einhalten. Ähnliche Anforderungen an jede Institution zur Einhaltung der tierischen Protokolle in diesem Manuskript beschrieben angewandt werden.

1. Verwendung von kleinen Wirbeltieren

Hinweis: die richtigen persönlichen Schutz (PSA) ist erforderlich für die Arbeit mit Mäusen. Mindestanforderungen sind Einweg-Overalls, Überschuhe, Kopf Haube, Maske und Handschuhe.

  1. Gemäß dem Protokoll von IACUC legen Sie maximal 5 Mäusen pro Käfig. Nach IACUC-Protokolls, um sicherzustellen, dass das Tier tot ist Mäuse mit zwei Methoden der Sterbehilfe (die zweite ist eine physikalische Methode) einschläfern.
    Hinweis: In den Experimenten, in denen IAV Morbidität und Mortalität ausgewertet, Mäuse, die 20 % ihres ursprünglichen Körpergewichts verloren galten als die experimentelle Endpunkt erreicht haben, und mit CO 2 und zervikale Dislokation als eingeschläfert wurden die physische sekundäre Methode. Dieser Prozentsatz des Körpergewichts kann in anderen Organen unterscheiden. In den Verfahren, wo die Mäuse Lunge und Nasenschleimhaut nach IAV Infektion gesammelt werden, Mäuse sind mit eine tödliche Dosis von 2,2,2-Tribromoethanol (FSME) eingeschläfert und durch Schneiden die hepatische Ader als physische sekundäre Methode. Weibliche 6 bis 8 Wochen alten C57BL/6 Mäusen waren gekauft und gepflegt in der Tierpflege-Anlage an der University of Rochester School of Medicine and Dentistry unter bestimmten Bedingungen Pathogen-freies.

2. Biologische Sicherheit

Hinweis: In diesem Bericht sind die IAVs verwendet, um Mäuse zu infizieren die gemeinsame Maus angepasst Laborstamm A/Puerto Rico/8/34 H1N1 Influenza (PR8 WT) 22 , 23 und eine Temperatur empfindliche LAIV Variante, PR8 LAIV 8. Führen Sie alle Verfahren, die IAV Infektionen (in Vitro oder in Vivo), Zellkulturen und biologische Proben in einem biologischen Sicherheitsschrank unter Biosafety Niveau (BSL)-2 Bedingungen. Andere BSL-Anzüge oder Containment-Bedingungen zu nutzen, wenn hoch virulente IAV-Sorten verwendet werden.

  1. Reinigen die Biosicherheit Schrank mit Chlor Dioxid Desinfektionsmittel vor und nach der Durchführung der experimentellen Verfahren beschrieben in dieser Handschrift. Sterilisieren Sie alle Dissektion Material (Schere, Skalpell und seziert Zange) und die Dounce-Homogenisator, vor und nach ihrer Verwendung, die richtige IBC Empfehlungen. Sämtliches Material, während die Verfahren unter entsprechenden IBC und IACUC Richtlinien produziert entsorgen.

3. Intranasale Infektion

  1. Ort der weiblichen 6 bis 8 Wochen alten C57BL/6 Mäusen unter bestimmten Pathogen-freies Bedingungen. Organisieren und Beschriften der Maus Käfige mit dem Virus und der verwendeten Dosis. Identifizieren Sie die Mäuse in jedem Käfig mit einem Ohr Punch oder mit einem anderen zugelassenen Verfahren wie Gemälde von den Schwänzen. Legen Sie ein Maximum von 5 Mäusen pro Käfig.
  2. Bereiten die Verdünnung der IAV (fluoreszierende bilden Einheiten (FFU) / Maus) unter aseptischen Bedingungen in einem Gesamtvolumen von 30 µL/Maus in sterilen 1 x Phosphat-Puffer Kochsalzlösung (PBS). Pflegen Sie das Virus Inokulum auf Eis. Berechnen Sie die Menge der IAV in der viralen Verdünnung mit der Formel hinzufügen: ((X FFU per Mausklick/30 µL) x Endvolumen) / stock virale Titer.
  3. Wiegen die Mäuse mit einer Skala und nehmen das Gewicht jeder Maus (Tag 0). Halten Sie die Maus in eine Rückenlage durch Abholung durch das Genick zwischen Zeigefinger und Daumen. Halten Sie die Rute gegen die Hand mit dem kleinen Finger.
  4. Betäuben die Maus intraperitoneal (i.p.) mit 240-250 mg/kg der FSME durch die Nadel in der kaudalen 2/3 von der rechten Seite des Bauches. Halten Sie kurz vor dem Zurückziehen der Nadelöhrs. Die Maus in den Käfig zurück und warten Sie 5 Minuten
  5. Gelten sterile ophthalmologischen Salbe für die Augen, um Trockenheit zu verhindern, während die Maus betäubt ist. Überprüfen Sie, ob die Maus durch Mangel an Pedal Rückzug Reflex (d. h. Zehe Prise) betäubt ist. Wenn Mäuse nicht vollständig betäubt sind, werden sie das Virus Husten.
  6. Wenn die Maus vollständig betäubt ist, platzieren Sie den Mauszeiger im dorsalen liegen. Setzte die Pipettieren Spitze mit 30 µL des Inokulums Virus in das Nasenloch und langsam aber ständig Auswerfen die Lösung. Achten Sie darauf, dass die Maus ist die Vorbereitung durch die Beobachtung des Inokulums verschwinden fallen einatmen.
  7. Prüfen, ob die Maus atmet wie FSME kann die Temperatur und Atmung Rate drücken. Das Tier in den Käfig, indem es in dorsal liegen zurück. Die Mäuse auf Anzeichen von Atemnot zu überwachen und wenn beobachtet, helfen der Maus zu atmen durch halten Tier vertikal und induzieren Auswirkungen Atmung 24 angetrieben. Überwachen die Maus, bis es Bewusstsein (30-45 min gewinnt nach es wurde betäubt).

4. Charakterisierung der viralen Pathogenese ( Abbildung 1)

  1. Bewertung der Morbidität und Mortalität ( Abbildung 1 und Abbildung 2)
    1. I.n. 3-4 Gruppen von weiblichen 6 bis 8 Wochen alten C57BL/6 Mäusen zu infizieren (mindestens 5 Mäusen pro Gruppe, n = 5) mit 10-divisibel Dosen (10, 10 2, 10 3 und 10 4 FFU/Maus) von PR8 WT wie beschrieben in Abschnitt 3.
    2. Monitor und wiegen die Mäuse mit einer Skala in den nächsten 14 Tagen in etwa zur gleichen Zeit, Gewicht Variationen durch Nahrungsaufnahme zu minimieren. Mäuse, die 20 % ihres ursprünglichen Körpergewichts verlieren, wie in Abschnitt 1 beschrieben einschläfern.
    3. Nach 14 Tagen einschläfern die Mäuse, die Virusinfektion zu überleben, wie in Abschnitt 1 beschrieben.
    4. Berechnen die virale 50 % Maus letale Dosis (MLD 50) basierend auf den Überlebensdaten unter Verwendung der Methode von Reed und Münch 25. Berechnen Sie zunächst, den Anteil Abstand (PD):
      figure-protocol-1
      1. als Nächstes berechnen die MLD 50 nach folgender Formel:
        figure-protocol-2
  2. Bewertung der viralen Titer in Lunge und Nasenschleimhaut ( Abbildung 1 und Abbildung 2. )
    1. Erholung der Lungen und Nasenschleimhaut
      1. infizieren i.n. weibliche 6 bis 8 Wochen alten C57BL/6 Mäusen (n = 6) mit der viralen Dosis, 10 / 4 FFU PR8 WT zu testen, wie beschrieben in Abschnitt 3.
      2. Sammeln Sie die Maus-Lunge und Nasenschleimhaut Tage 2 (n = 3) und 4 (n = 3).
        1. Einschläfern die Mäuse mit einer tödlichen Dosis (i.p.) FSME (500 mg/kg). Legen Sie das Tier in dorsal liegen und desinfizieren Sie das Fell über den Brustkorb mit 70 % Ethanol zu. Schneiden Sie die Haut mit einem Skalpell aus dem Brustbein auf der Basis des Bauches. Kürzen 1 cm von der Basis des Schnittes, die seitlichen Teile der Mäuse mit der Schere.
        2. Schneiden mit der Schere zu bluten die Maus als sekundäre Euthanasie-Methode die Lebervene. Legen Sie das Tier in eine Bauchlage und warten Sie 2 Minuten, damit das Blut abfließen. Dieser Schritt ist wichtig, Blut in der Lunge reduzieren.
        3. Entfernen Sie die Haut von der gesamte obere Teil der Maus (inkl. Kopf) an der Basis des Bauches, wo der erste Schnitt mit Hilfe von Pinzetten und Scheren sezieren gemacht wurde. Den Kopf mit der Schere ausschneiden und in eine sterile Petrischale trocken.
        4. Die Übergänge zwischen den Oberkiefer und Unterkiefer mit der Schere ausschneiden und entsorgen Sie den Unterkiefer. Mit der Schere zwei Schnitte an den Enden der Jochbein-Bögen und entfernen Sie sie. Entfernen Sie die Augen mit Hilfe der sezierenden Zange.
        5. Des Schädels mit der sezierenden Zange halten und das Schädeldach entlang die sagittale Naht mit einem Skalpell schneiden. Heben Sie die beiden Hälften des Schädels mit dem Gehirn, die Nasenschleimhaut zu sehen. Die nasale Schleimhäute sind umgeben von den vorderen Knochen des Schädels, einschließlich der Nasal, Oberkiefer, Jochbein, Palatin und Siebbein Knochen.
        6. Mit dem Skalpell, schneiden Sie den Teil des Schädels mit dem Gehirn und verwerfen. Legen Sie den anderen Teil des Schädels mit der Nasenschleimhaut in ein steriles Röhrchen. Das Rohr auf dem Eis (4 ° C) zu speichern, wenn die Proben sind am selben Tag bearbeitet, oder auf Trockeneis zu schnell einfrieren, wenn die Proben später bearbeitet werden.
        7. Zur Vermeidung von Kontamination der Proben reinigen und desinfizieren der Resektionsinstrumente zwischen jedem Gewebe erholt und jedes Tier Dissektion mit Chlor Dioxid Desinfektionsmittel.
        8. Der Lunge sammeln, legen Sie das Tier in dorsal liegen und der Pleura mit der Schere ausschneiden. Öffnen Sie den Brustkorb durch Schneiden die Rippen 1 cm an beiden Seiten des Brustbeins. Die Kürzungen von der Basis des Brustkorbes, der obere Teil mit der Schere machen.
        9. Stellen einen Querschnitt mit der Schere zwischen den zwei Einschnitten in den oberen Teil des Brustkorbs und entfernen Sie die Brustplatte. Die Lungen mit der Zange halten, am Ende der Luftröhre (kurz vor der Lunge) mit der Schere ausschneiden und der Lunge in ein steriles Röhrchen. Das Rohr auf dem Eis (4 ° C) zu speichern, wenn die Proben sind am selben Tag bearbeitet, oder auf Trockeneis zu schnell einfrieren, wenn die Proben später bearbeitet werden.
          Hinweis: Die Gewebeproben zu homogenisieren, am selben Tag, den sie gesammelt werden, und speichern bei-80 ° C, virale Titer später zu analysieren. Es ist wichtig, dass die Proben nicht unterziehen wiederholte Frost-Tau-Zyklen vor Virus-Titer bestimmt werden. Alternativ die Gewebeproben bei-80 ° C lagern, bis sie verarbeitet werden.
    2. Homogenisierung der Lungen und Nasenschleimhaut
      1. der Lunge oder der Nasenschleimhaut in einem sterilen Dounce-Homogenisator und fügen Sie 1 mL kalte Infektion Medien. Homogenisieren der Probenmaterials durch Verschieben der Stößel rauf und runter ca. 1 min. bei Raumtemperatur (RT), bis die Lunge völlig gestört sind. Setzen die homogenisierte Probe in ein steriles Röhrchen und Store bei 4 ° C. Verwendung für jede Probe eine neue Dounce-Homogenisator.
      2. Zentrifugieren Sie die Proben bei 300 X g für ca. 5-10 min bei RT. Collect der Überstand in ein neues steriles Röhrchen. Speichern Sie überstand bei 4 ° C zu, wenn virale Titration am selben Tag ausgeführt wird und verwerfen Sie das Pellet zu. Alternativ Einfrieren (-80 ° C) den Überstand von der homogenisierte Proben um virale Titer später bewerten.
    3. Virus Titration durch indirekte Immunfluoreszenz
      1. am Vortag Titration, seed 96-Well-Platten mit Madin Darby Canine Kidney (MDCK) Epithelzellen (4 x 10 4 Zellen/Na), ~ 80-90 % Zusammenfluss in Gewebekultur Medien zu erreichen. Platzieren Sie die Zellen in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO 2. Der Tag der viralen Titration, überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop eine Monolage zu bestätigen, bevor Sie beginnen die Virusinfektion.
      2. Vorbereiten 01:10 Verdünnungen des Überstands der homogenisierten Proben (Lungen- oder Nasenschleimhaut) Infektion Medien in einer 96-Well-Platte. Führen Sie die virale Titration durch Triplicates, virale Titer genau zu bestimmen.
        1. Hinzufügen 90 µL Infektion Medien zueinander der Brunnen in der 96-Well-Platte. Hinzu kommt 10 µL des Überstands der homogenisierten Proben eines Brunnen A1, A2 und A3, die virale Titer von jeder Probe in dreifacher Ausfertigung zu bewerten. Brunnen A4, A5 und A6 10 µL einer anderen Überstand der homogenisierten Proben hinzufügen. Führen Sie die gleichen Verdünnung nacheinander mit dem Rest der Proben.
        2. Nach der Zugabe der Probe überstand, Reihe A, verwenden, eine Mehrkanal-Pipettieren um zu mischen, durch Pipettieren rauf und runter. 10 µL von Reihe A, Reihe B. Change die Spitzen zwischen Verdünnungen und mischen Sie gut. Wiederholen Sie diesen Vorgang bis zum Erreichen der letzten Zeile (H).
      3. Entfernen der Gewebekultur Medium (Schritt 4.2.3.1) mit einem Vakuum-Sauger-Mehrkanal-Adapter aus den MDCK-Zellen in der 96-Well Platten und zweimal mit 100 µL/Well 1 X PBS waschen.
      4. Transfer 50 µL/Well seriell verdünnt Überstand der homogenisierten Proben auf der 96-Well-Platte mit MDCK-Zellen. Starten Sie die höhere Verdünnungen (Reihe H) auf die niedrigeren Verdünnungen (Reihe A) übertragen. In diesem Fall ist es nicht notwendig, zwischen verschiedenen Zeilen Spitzenwechsel.
      5. Setzen die 96-Well-Platten auf einer rockigen Plattform für 1 h bei RT um virale Adsorption zu ermöglichen. Entfernen Sie nach viralen Adsorption das Inokulum mit einem Vakuum-Sauger-Mehrkanal-Adapter und 100 µL/Well der Medien nach der Infektion. Inkubieren Sie infizierte Zellen für 8 h in einem 33 ° C und 37 ° C Inkubator mit 5 % CO 2. Gehen Sie um die Festsetzung, Färbung, Bildgebung und virale Titer Berechnung wie in Schritten 4.2.3.6 – 4.2.3.12.
      6. Entfernen der Gewebekultur Medium von den 96-Well-Platten mit einem Vakuum-Sauger-Mehrkanal-Adapter. Zu beheben und die Zellen mit 100 µL/Well Fixierung/Permeabilisierung Lösung für 20 min bei RT. permeabilize
        Achtung: Verwenden Sie die Fixierung/Permeabilisierung Lösung in einer Dampfhaube, um Formaldehyd-Exposition zu verhindern.
      7. Die Fixierung/Permeabilisierung Lösung mit einem Vakuum-Sauger-Mehrkanal-Adapter entfernen, mit 1 X PBS waschen und die festen Zellen mit blockiert Lösung für 1 h bei RT. Store die Zellen blockiert Lösung bei 4 ° C inkubieren oder mit dem nächsten Schritt fortfahren.
      8. Entfernen Sie die blockierende Lösung. Fügen Sie 50 µL/Well von 1 µg/mL monoklonaler Antikörper (mAb) Anti-NP HB-65 in Antikörperlösung Verdünnung verdünnt. Inkubation für 1 h bei 37 ° c verschiedene mAb oder polyclonAl (pAb) Antikörper Anti-PR8 verwendet werden kann.
      9. Unterdessen verdünnen 1: 200 Fluorescein-Herstellung (FITC)-konjugierten Anti-Maus Sekundärantikörper in Verdünnung Antikörperlösung. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 1.700 x g für ca. 5-10 min bei RT Andere mit anderen Fluorophore konjugierten Sekundärantikörper verwendet werden können.
      10. Entfernen Sie den primären Antikörper und 3 Mal mit 100 µL/Well 1 X PBS waschen. Fügen Sie 50 µL/Well der Sekundärantikörper Verdünnung und inkubieren Sie für 30-45 min bei 37 ° C. Entfernen Sie den sekundären Antikörper und 3 Mal mit 100 µL/Well 1 X PBS waschen. Verlassen die letzten Wäsche in der Platte.
      11. Beobachten die Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop zu bestimmen, die Anzahl der positiv gefärbten Zellen (grün). Berechnen Sie die virale Titer durch zählen der FFU/mL. Die virale Titer, ausgedrückt in FFU/mL von der Verdünnung mit 30-50 positiv gefärbten Zellen mit der Formel zu berechnen: ((n1 + n2 + n3) / 3) x 20 x 1/Verdünnung.

5. Bewertung der humoralen Immunantwort ( Abbildung 3)

  1. infizieren i.n. 3 Gruppen von weiblichen 6 bis 8 Wochen alten C57BL/6 Mäusen (n = 5) mit den verschiedenen Dosen (10 2, 10 3 und 10 4 FFU / Maus) von PR8 LAIV und Mock-infizieren eine Gruppe (n = 5) mit 1 x sterile PBS als Negativkontrolle. I.n Maus Infektionen führen, wie in Abschnitt 3 beschrieben.
    1. Maus Blutungen durch mandibulären Punktion
      1. vierzehn Tage nach der Immunisierung, sammeln die Mäuse Blut mandibulären Blutungen mit einer 4 mm Lanzette 26, oder mit einem anderen IACUC Verfahren genehmigt.
        1. Halten die Maus durch Abholung durch das Genick zwischen Zeigefinger und Daumen. Halten Sie die Rute gegen die Hand mit dem kleinen Finger auf die Maus zu immobilisieren.
        2. Setzen Sie die Maus in Seitenlage auf die Wange zu sehen. Die Punktion an der Stelle des Retro-Orbital und mandibulären Venen mit der Halsschlagader zu machen. Sinken die Lanzette (4 mm) und das Blut in ein steriles Röhrchen zu erholen (ca. 0,2 - 0,4 mL/Maus sind wiederhergestellt). Üben Sie Druck auf die Einstichstelle mit einem sterilen Tuch für ein paar Sekunden. Platzieren Sie die Maus zurück in den Käfig.
      2. Setzen die Röhren für 1-2 h bei 37 ° C und anschließend Zentrifugieren sie 700 X g für 30 min bei RT, das Serum aus dem Blut zu trennen. Übertragen Sie die obere Schicht, die aus dem Serum mit einem pipettieren, ein neues steriles Röhrchen besteht. Entsorgen Sie das Pellet der roten Blutkörperchen (Erythrozyten). Speichern Sie das Serum bei-20 ° c
  2. Analyse der gesamten Antikörper gegen virale Proteine
    1. Vorbereitung der infizierten MDCK Zellextrakte
      1. am Vortag Infektion, Samen ein 100-Millimeter-Teller mit 4-5 x 10 6 MDCK Zellen (~ 80-90 zu erreichen % Zusammenfluss am nächsten Tag) in Gewebekultur Medien. Platzieren Sie die Zellen in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO 2. Der Tag der Virusinfektion, überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop eine Monolage zu bestätigen, bevor Sie beginnen die Virusinfektion.
      2. Bereiten eine virale Verdünnung mit einer niedrigen (0,001) Vielzahl der Infektion (MOI) des PR8 WT in Infektion Medien im gesamten letzten Band 4 mL. Berechnen Sie die Menge der PR8 WT mit der Formel ((X MOI x n ° Zellen) x Endvolumen) / stock virale Titer.
      3. Gewebe Kulturmedium aus MDCK Zellplatte Aspirieren und zweimal mit 4 mL 1 X PBS waschen. Fügen Sie das virale Inokulum (4 mL) und setzen Sie die Platte auf einer rockigen Plattform für 1 h bei RT um virale Adsorption zu ermöglichen. Entfernen Sie das virale Inokulum mit Vakuum und 8-10 mL nach der Infektion Medien mit 1 µg/mL Trypsin TPCK behandelt. Inkubieren Sie infizierte Zellen für 48-72 h in einem 33 ° C und 37 ° C Inkubator mit 5 % CO 2.
      4. Lösen die Zellen mit Hilfe einer Zelle Schaber und sammeln Sie die Zellen und Gewebe Kulturmedium mit einem Pipettieren in eine 15-mL-Tube. Zentrifugieren Sie das Rohr auf 400 X g für ca. 5-10 min bei RT Aspirat überstand und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL RIPA Puffer und setzen Sie die Mischung in eine 1,5 mL steriles Röhrchen. Inkubieren Sie für 20-30 min auf Eis
      5. Zentrifuge das Rohr auf 1.300 x g für 20-30 min bei 4 ° C. sorgfältig, wiederherstellen den überstand. Laden die Zelle extrahieren in 100 µL-Aliquots bei-20 ° c
      6. Titrieren Zellextrakte wie beschrieben durch Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) vor deren Auswertung auf das Vorhandensein von Antikörpern 9 , 10 , 11 , 27. Include Zelle extrahiert aus Mock-infizierten MDCK-Zellen (zubereitet wie oben angegeben) als Negativkontrolle.
    2. ELISA ( Abbildung 4)
      1. Polystyrol 96-Well-Platten mit der entsprechenden Verdünnung infiziert hat Zelle mit 1 X PBS-Puffer (in der Regel zwischen 1: 200 - 1:1 000 extrahieren) zu beschichten. Eine weitere Platte mit den gleichen Verdünnung von Mock-infizierten MDCK-Zellen-Extrakt als Negativkontrolle zu beschichten. Inkubation über Nacht (O/N) bei 4 ° c
      2. Den Überstand mit einem Vakuum-Sauger-Mehrkanal-Adapter zu entfernen und Waschen einmal mit 100 µL/Well 1 X PBS mit einem Mehrkanal-pipettieren. Blockieren der unspezifischen Bindung durch Zugabe von 100 µL/Well blockieren Lösung für 1 h bei RT
      3. Unterdessen machen 2-fold serielle Verdünnungen (ab Verdünnung 01:50) des Sera aus jeder Maus im Schritt 5.1 in Verdünnung Antikörperlösung in eine 96-Well-Platte infiziert.
      4. Entfernen Sie die blockierende Lösung aus Polystyrol 96-Well-Platten mit einem Vakuum-Sauger-Mehrkanal-Adapter. Fügen Sie 50 µL jeder Maus-Serum-Verdünnung in den entsprechenden Brunnen und inkubieren Sie 1 h bei 37 ° c
      5. Entfernen der Mäuse Sera mit einem Vakuum-Sauger-Mehrkanal-Adapter. Waschen Sie die Brunnen 3 Mal mit destilliertem Wasser mit einem Mehrkanal-pipettieren. Fügen Sie 50 µL/Well aus einem sekundären Anti-Maus-Antikörper konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) verdünnt 1:2,000 in Verdünnung Antikörperlösung. 1 h bei 37 ° c inkubieren
      6. Entfernen den sekundären Antikörper mit einem Vakuum-Sauger-Mehrkanal-Adapter. Waschen Sie die Brunnen 3 Mal mit destilliertem Wasser mit einem Mehrkanal-pipettieren. Bereiten Sie die Tetramethylbenzidine (TMB) Substrat-Lösung durch Mischen von 1:1 Lösung A und B. hinzufügen 100 µL/Well des Substrats und ca. 5-10 min bei RT im Dunkeln inkubieren.
      7. Stoppen die Reaktion durch Zugabe von 100 µL/Well von 0,2 N H 2 SO 4. Lesen Sie die Platten bei 450 nm auf einem ELISA-Reader Platte.
      8. Subtrahieren Sie den Wert jeder Verdünnung der MDCK Mock-infizierten 96-Well-Platte aus den Wert in der MDCK-infizierten 96-Well-Platte. Berechnen Sie die durchschnittlichen Werte für jede Verdünnung mit dem verschiedenen Sera und vertreten sie in ein Diagramm, Standardabweichungen (SD).
  3. Analyse von neutralisierenden Antikörpern
    1. Hämagglutination Inhibition (HAI) Assay ( Abbildung 5)
      1. vor der Durchführung der HAI Assay, behandeln die Maus Sera mit Rezeptor zerstören Enzym (RDE), alle nicht-spezifische Inhibitoren vorhanden im Serum zu beseitigen. 4 Bände von RDE arbeiten Verdünnung 1 Volumen von Maus-Serum hinzufügen (Serum Verdünnung beträgt nun 1:5). O/N (12 - inkubieren 18 h) in einem 37 ° C Wasserbad.
      2. Heizen die Serumproben bei 56 ° C für 30 min, das RDE zu inaktivieren.
      3. Bestimmen die Hämagglutination Aktivität (HAU) von PR8 WT von standard HA Assay 28. Sobald die virale HAU feststeht, virale Lager 8 HAU pro 50 µL in 1 X PBS verdünnen.
      4. Bereiten 2-fold Verdünnungsreihen (12 Verdünnungen) RDE behandelt Sera in eine 96-Well-V-Boden-Platte. Verwenden Sie eine Zeile für jede Serumprobe (z.B. A1, A12).
        1. Hinzufügen 25 µL 1 x PBS von A1, A12 Wells. Testen Sie jede der Serumproben in einer Zeile. 25 µL 1 X PBS in der ersten Spalte (A1) 25 µL der RDE-behandelten Sera (1:5) hinzufügen. Die erste Serum-Verdünnung ist 01:10.
        2. Nach der ersten Spalte alle RDE behandelt Seren hinzugefügt werden (z.B. A1, B1, C1), verwenden Sie eine Mehrkanal-Pipettieren der Sera und 1 X PBS mischen durch Pipettieren rauf und runter. 25 µL des verdünnten Sera aus der ersten Spalte in der zweiten Spalte (z.B. von A1 bis A2) zu übertragen. Ändern Sie die Spitzen zwischen Verdünnungen und mix.
        3. Wiederholen Sie die Schritte 5.3.1.4.2. bis zum Erreichen der letzten Spalte (z.B. A12, B12, C12). Entsorgen Sie die 25 µL aus der letzten Spalte, die Lautstärke in alle Wells (25 µL) konsistent zu halten. Umfassen eine Reihe von Brunnen mit nur 25 µL 1 X PBS ohne jede Sera als Negativkontrolle.
      5. Hinzufügen 25 µL der IAV verdünnt, um 8 HAU/50 µL zu jedem der Brunnen mit Sera in 96-Well-V-Boden-Platte; das Endvolumen in jedem ist gut 50 µL, mit 4 HAU des Virus. Mischen Sie den Inhalt durch wiederholte pipettieren. 1 h bei RT inkubieren
      6. Fügen Sie 50 µL 0,5 % Türkei Erythrozyten zu jedem der Brunnen. Mischen Sie den Inhalt durch wiederholte pipettieren. Inkubieren Sie die Platte für 30-45 min auf Eis. Der HAI Assay visuell zu lesen, wenn der Erythrozyten in die Kontroll-Vertiefungen (1 X PBS) einen roten Niederschlag (d. h. Pellet) an der Unterseite der Brunnen bilden.
        Hinweis: Erythrozyten von anderen Tierarten wie z. B. Hühner, Meerschweinchen oder Pferd kann auch verwendet werden.
      7. Berechnung der HAI-Titer durch die Identifizierung der letztes auch in denen der Erythrozyten bilden eine rote Kugel und Hämagglutination tritt nicht auf,.
        Hinweis: Der Kehrwert von dieser Verdünnung ist die HAI-Titer. Der Kehrwert ist multipliziert mit einem Faktor von 20 für die 01:20 korrigieren Verdünnung des Serums in der ersten Reihe.
    2. Virus Microneutralization Assay (VNA) ( Abbildung 6)
      1. am Vortag VNA, bereiten MDCK-Zellen in eine 96-Well-Platte, Zusammenfluss von 80-90 % am nächsten Tag zu erreichen, wie in Schritt 5.2.1.1 beschrieben. Bereiten Sie eine Verdünnung von PR8 WT Infektion Medien bis 200 FFU/25 µL haben.
      2. Inaktivierung der Maus Sera bei 56 ° C für 1 h 2-fold Verdünnungsreihen (12 Verdünnung) pro Maus Sera in dreifacher Ausfertigung mit einer 96-Well-Platte machen.
        1. Hinzufügen 40 µL Serum auf 160 µL Infektion Medien in die erste Vertiefung der ersten Zeile (z.B. A1) (Serum Verdünnung 1:5). Mischen von pipettieren. Die weiteren Bohrungen 100 µL der Infektion Medien hinzufügen (A2 bis H12).
        2. Transfer 100 µL aus der ersten Zeile der zweiten Zeile, 1:2 Verdünnungen (z.B. von A1 bis A2) zu machen. Ändern Sie Tipps zwischen Verdünnungen und Mischung von pipettieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang bis zur letzten Reihe (z.B. A12). Entsorgen Sie 100 µL aus der letzten Reihe, die Lautstärke in alle Wells (100 µL) konsistent zu halten.
      3. Hinzufügen 100 µL der IAV Verdünnung in alle Vertiefungen. 1 h bei RT inkubieren Unterdessen das Gewebe Kulturmedium aus den MDCK-Zellen in der 96-Well-Platte mit einem Vakuum-Sauger-Mehrkanal-Adapter zu entfernen und waschen zweimal mit 100 µL/Well 1 X PBS.
      4. In jedem 96-Well-Platte MDCK-Zellen, lassen Sie zwei Zeilen für die Steuerelemente. Eine Zeile ist die negativ-Kontrolle (Zellen ohne Virus und Sera), und die zweite Zeile ist die positive Kontrolle der Infektion (Zellen mit Viren in der Abwesenheit von Sera oder Seren von Mock-infizierten Mäusen).
      5. Transfer 50 µL/Well von Virus-Antikörper-Platte an den 96-Well-Platten von MDCK-Zellen. Setzen Sie die Platten auf einer rockigen Plattform für 1 h bei RT virale Adsorption ermöglichen.
      6. Das Virus-Antikörper-Inokulum mit einem Vakuum-Sauger-Mehrkanal-Adapter zu entfernen und hinzufügen 100 µL/Well nach der Infektion Medien mit 1 µg/mL TPCK behandelt Trypsin.
      7. ~ 3-4 Tage in einem 33 ° C und 37 ° C Inkubator mit 5 % CO 2 Zellen inkubieren, bis zytopathischer Effekt (CPE) in der Positivkontrolle (infizierte Zellen in Abwesenheit von Sera oder mit Kontrollserum) beobachtet wird.
      8. Entfernen der Gewebekultur-Medium mit einem Vakuum-Sauger-Mehrkanal-Adapter und 100 µL/Well von 0,1 % Kristallviolett. Inkubieren Sie für 1 h bei RT. Entfernen Sie die Kristallviolett-Lösung mit einem Vakuum-Sauger-Mehrkanal-Adapter. Die Brunnen 3 Mal mit destilliertem Wasser zu waschen. Trocknen Sie die Platten bei RT
      9. Berechnen die VNA-Titer durch die Ermittlung der höchsten Verdünnung, die eine konfluierende Cell Monolayer MDCK Zellen beibehält.
        Hinweis: Der Kehrwert dieser entsprechende Verdünnung ist der neutralisierende Antikörpertiter. Der Kehrwert ist multipliziert mit einem Faktor von 10 zu korrigieren, die 01:10 Verdünnung des Sera in die erste Vertiefung der Zeile.

6. Bewertung der Schutz Wirksamkeit Impfstoffe ( Abbildung 3)

  1. impfen i.n. eine Gruppe von weiblichen 6 bis 8 Wochen alten C57BL/6 Mäusen (n = 11) mit der PR8 LAIV Dosis zu testen (FFU/Maus) und eine andere Gruppe von Mäusen Mock zu impfen (n = 11) mit 1 x sterile PBS. Führen Sie die Maus i.n. Impfungen wie zuvor beschrieben in Abschnitt 3.
  2. Vierzehn Tage nach der Impfung, bluten die Mäuse und die Sera zu sammeln, wie in Abschnitt 3 beschrieben. Analysieren Sie die Anwesenheit von Total und neutralisierenden Antikörpern gegen PR8 WT, wie beschrieben in Abschnitt 5.1.1.
  3. 15 Tage nach der Impfung, Messung und Aufzeichnung der Maus des Körpergewichts (Tag 0). Fordern Sie Mäuse i.n. mit eine tödliche Dosis von PR8 WT (homologe Challenge) wie oben beschrieben in Abschnitt 3.
  4. Messen, das Körpergewicht und das Überleben (n = 5 / Gruppe) innerhalb von 14 Tagen nach der Herausforderung, die Morbidität und Mortalität von PR8 WT Herausforderung bei geimpften Mäusen (Abschnitt 4.1) produziert bewerten.
  5. Maus-Lunge und Nasenschleimhaut zu erholen (n = 3/Tag) an Tag 2 und Tag 4 Post-challenge mit PR8 WT homogenisieren und die Lungen zu analysieren und Nasenschleimhaut wie in Abschnitt 4.2 beschrieben, bewertet die virale Replikation PR8 WT bei geimpften Mäusen.

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Ergebnisse

Charakterisierung der viralen Pathogenese bei Mäusen

Die Pathogenese der IAV bezieht sich auf die Morbidität und Mortalität durch die Infektion verursacht. Diese beiden Parameter können leicht bei Mäusen ausgewertet werden: IAV Morbidität Körper Gewichtsverlust bei infizierten Mäusen zugeordnet ist und der Prozentsatz des Überlebens zeigen die Sterblichkeitsrate (Abbildung 1). Das Körpergewicht und das...

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Diskussion

Die Maus-Modell der IAV ist für in Vivo Studien der IAV Pathogenese, Immunogenität und Schutz Wirksamkeit verbreitet. Die geringe Größe von Mäusen macht sie leicht zu bearbeiten und speichern im Vergleich zu anderen Tiermodellen wie Frettchen oder Meerschweinchen. Darüber hinaus erlauben die Leichtigkeit in Bezug auf Tier Kosten, Gehäuse und Reproduktion ihre Verwendung in präklinischen Impfung-Tests in denen großen Anzahl von Tieren erforderlich sind. Vor allem, da Mäuse verwendet wurden mehrere Forschung Diszi...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Forschung auf Influenza-Virus im LM-S Labor wird teilweise von The New York Influenza Center of Excellence (GEMON), ein Mitglied des NIAID Centers of Excellence für Influenza-Forschung und Überwachung (CEIRS) finanziert. Wir danken für ihre Unterstützung bei der Korrektur des Manuskripts Wendy Bates.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) EpithelzellenATCCCCL-34
Sechs bis acht Wochen alte weibliche C57BL/6 MäuseNational Cancer Institute (NCI)01XBE
Turckey Red blod cellsBiolink IncStore at 4 ° C
Dulbecco' s modifizierter Eagle" s medium (DMEM)Corning Cellgro15-013-CVBei 4 > lagern; C
Fötales Rinderserum (FBS)Seradigm1500-050Bei -20 ° lagern; C
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamin (PSG) 100xCorning30-009-CIBei -20 ° C
Penicillin/Streptomycin (PS) 100xCorning30-00-CIBei -20 ° C
Bovin Albumin solution (BA)Sigma-AldrichA7409Bei 4 > lagern; C
Bovin Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA9647Lagern bei 4 ° C
Mit Tosylsulfonylphenylalanylchlormethylketon (TPCK) behandeltes TrypsinSigma-AldrichT8802Bei -20 ° lagern; C
Neutral Buffered Formalin 10%EMD65346-85Bei RT
aufbewahren Triton X-100J.T.BakerX198-07Bei RT
Monoklonaler Antikörper anti-NP Influenza A-Virus HB-65ATTCH16-L10-4R5Bei -20 ° lagern; C
Polyklonale Kaninchen-Anti-Maus-Immunglobuline/FITCDakoF0261Bei 4 ° lagern; C
ECL Anti-Maus-IgG, Meerrettich-Peroxidase-gebundener GanzantikörperGE HealthcareLNA931V/AGBei 4 > C
TMB SubstratsatzBioLegend421101Lagern bei 4 > C
Vmax Kinetic Plate ReaderMolecular Devices
Dounce Tissue GrindersThomas Scientific7722-7
Rezeptor zerstörendes Enzym, RDE (II)Denka Seiken Co.370013Bei -20 & Grad lagern; C
Crystal VioletFisher ScienctificC581-100Store at RT
96-Well-ZellkulturplatteGreiner Bio-one655-180
Zellkulturschalen 100 mmGreiner Bio-one664-160
Nunc MicroWell 96-Well-MikrotiterplattenThermo Fisher Scienctific269620
Nunc 96-Well-Mikrotiterplattenaus Polystyrol mit konischem BodenThermo Fisher Scienctific249570
Puralub Vet SalbeDechra9N-76855
FluoreszenzmikroskopOlympusOlympus IX81

Referenzen

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