Mosaik Klonanalyse in Drosophila imaginären Scheibenepithelien ist ein leistungsfähiges Modellsystem, um die genetischen und zellulären Mechanismen der Tumorentstehung zu studieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Induktion von Tumoren in Drosophila Flügel imaginären Scheiben mit dem GAL4-UAS-System, und führen Sie eine Diagnose-Methode, um die Tumor-Phänotypen zu klassifizieren.
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
In den frühen Stadien des Krebses zeigen transformierte mutierte Zellen zytologische Anomalien, beginnen unkontrollierte Überwucherung und zerstören die Gewebeorganisation schrittweise. Drosophila melanogaster hat sich als ein populäres experimentelles Modellsystem in der Krebsbiologie entwickelt, um die genetischen und zellulären Mechanismen der Tumorentstehung zu untersuchen. Insbesondere genetische Werkzeuge für Drosophila- Imagialscheiben (Entwicklung von Epithelien in Larven) ermöglichen die Entstehung von transformierten Pro-Tumor-Zellen innerhalb eines normalen Epithelgewebes, eine Situation ähnlich der Anfangsphase des menschlichen Krebses. Eine neuere Studie der Tumorentstehung in Drosophila- Flügel-Imaginalscheiben zeigte jedoch, dass die Tumorinitiierung von der gewebe-intrinsischen Cytoarchitektur und der lokalen Mikroumgebung abhängt, was darauf hindeutet, dass es wichtig ist, die regionsspezifische Anfälligkeit für tumorigene Reize bei der Bewertung von Tumor-Phänotypen im imaginären Bereich zu berücksichtigen Scheiben Zur Erleichterung der phänotypischen Analyse von Tumor progressiIn imaginären Scheiben beschreiben wir hier ein Protokoll für genetische Experimente mit dem GAL4-UAS-System, um neoplastische Tumore in Flügel-imaginären Scheiben zu induzieren. Wir stellen ferner eine Diagnosemethode vor, um die Phänotypen von in imaginären Epithelien induzierten klonalen Läsionen zu klassifizieren, da eine klare Klassifizierungsmethode zur Unterscheidung verschiedener Stadien der Tumorprogression (wie Hyperplasie, Dysplasie oder Neoplasie) bisher nicht beschrieben wurde. Diese Methoden können weitgehend auf die Klonanalyse von Tumor-Phänotypen in verschiedenen Organen in Drosophila anwendbar sein.
Einleitung
Epithelgewebe sind hoch organisierte Systeme, die die bemerkenswerte homöostatische Fähigkeit haben, ihre Organisation durch Entwicklung und Zellumsatz zu erhalten. Dieses robuste Selbstorganisationssystem wird jedoch während der Tumorentwicklung zunehmend unterbrochen. Zu Beginn der Tumorentwicklung treten einzelne Mutantenzellen aus der Onkogenaktivierung oder der Tumor-Suppressor-Gen-Inaktivierung innerhalb einer Epithelschicht auf. Wenn diese transformierte "Pro-Tumor-Zelle" einer unterdrückenden Umgebung entzieht, die Epithelorganisation stört und unkontrollierte Proliferation beginnt, tritt die Tumorentstehung auf 1 . In den vergangenen ....
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Protokoll
1. Fliegen Sie Kreuze und Klon Induktion
- Entfernen Sie alle Fliegen in der Durchstechflasche 12 h, bevor Sie Jungfliegen sammeln.
- Anästhesieren Sie die Fliegen in der Durchstechflasche, indem Sie CO 2 -Gas injizieren und Fliegen auf ein CO 2 -Flugpad legen.
- Übertragen Sie 10 - 20 Jungfrauen und 10 Männer aus dem CO 2 Fliegenkissen in eine frische Ampulle und inkubieren für 1 Tag bei 25 ° C.
- Übertragen Sie diese Fliegen in eine frische Ampulle und inkubieren für 12 h bei 25 ° C.
HINWEIS: Verwerfe die erste Durchstechflasche als Jungfrau Weibchen legen nicht genug Eier am ersten Tag. ....
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Ergebnisse
Um die neoplastische Tumorbildung, die experimentell durch RNAi- vermittelte NTSG-Knockdown in Drosophila- Flügel-Imagialscheiben induziert wurde, zu demonstrieren, wurden drei verschiedene GAL4-Treiber verwendet, um UAS-RNAi für lgl oder scrib auszudrücken : (1) sd-GAL4, das eine starke UAS-Expression in der Flügelbeutel und milde Expression in den Scharnierbereichen ( Fig. 2 und Fig.......
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Diskussion
Das GAL4-UAS-System ist eines der leistungsstärksten genetischen Werkzeuge für die gezielte Genexpression in Drosophila 26 und erleichtert die Injektion und Analyse von Tumorzellen in vivo 4 . Dieses System ermöglicht die Erzeugung von Klonen, die den Knockdown von Tumorsuppressorgenen oder die Überexpression von Onkogenen im Wildtyp-Epithelgewebe tragen, eine Situation, die den Anfangsstadien des menschlichen Krebses sehr ähnlich ist, wo transformierte P.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Wir danken J. Vaughen für kritisches Lesen des Manuskripts. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse von JSPS KAKENHI Grant Numbers 26891025, 15H01500 und The Takeda Science Foundation Research Grant zu YT
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Reagenzien | |||
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Wako | 162-19321 | |
| TritonX-100 | Wako | 168-11805 | |
| Formaldehyd | Wako | 064-00406 | |
| Rinderserumalbumin | Sigma | A7906 | |
| normales Ziegenserum | Sigma | G6767 | |
| Eindeckmedium, Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Maus-Anti-Dlg 4F3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 Anti-Discs groß, RRID:AB_528203 | in PBTG verdünnt, 1:40 |
| Maus-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3A6B4, RRID:AB_579780 | 3 gemischt 1:1:1 und verdünnt in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3B8D12, RRID:AB_579781 | 3 gemischt 1:1:1 und verdünnt in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 5H7B11, RRID:AB_579779 | 3 gemischt 1:1:1 und verdünnt in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-atubulin | Developmental Studien Hybridoma Bank | AA4.3, RRID:AB_579793 | in PBTG verdünnt, 1:100 |
| Alexa Fluor 546 Phalloidin | Molekularsonden | A22283 | verdünnt in PBS, 1:40 |
| Ziegen-Anti-Maus-IgG-Antikörper, Alexa Fluor 546 | Molekularsonden | A11030 | in PBTG verdünnt, 1:400 |
| Name | Company | Katalognummer | Comments |
| Fly strains | |||
| sd-Gal4Bloomington | Drosophila Stock Center | #8609 | rekombiniert mit UAS-EGFP |
| >upd-Gal4Bloomington | Drosophila Stock Center | #26796 | rekombiniert mit UAS-EGFP |
| UAS-lgl-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #51247 | |
| UAS-scrib-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #105412 | |
| UAS-RasV12 | Bloomington Drosophila Stock Center | #64196 | |
| UAS-Yki3SA | Bloomington Drosophila Stock Center | #28817 | |
| hsFLP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6 | |
| Act>CD2>GAL4 (ausklappbar GAL4) | Bloomington Drosophila Stock Center | #4780 | rekombiniert mit UAS-EGFP |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #5428 | X-Chromosom |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6658 | drittes Chromosom |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24650 | zweites Chromosom |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24651 | drittes Chromosom |
| vkg-GFPMorin | et al. 2001 | GFP-Proteinfalle |
Referenzen
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Struhl, G., Basler, K.
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Nachdrucke und Genehmigungen
