Verbesserung der Anwendung des hochmolekularen Biotinylierte Dextran Amin für Thalamocortical Projektion Tracing in der Ratte

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen eine raffinierte Protokoll um effektiv biotinylierte Dextran Amin (BDA) Kennzeichnung mit einem fluoreszierenden Färbung Methode durch eine wechselseitige neuronale Weg zu offenbaren. Es ist geeignet für die Analyse der Feinstruktur des BDA Etikettier- und unterscheidet sie von anderen neuralen Elemente unter einem konfokalen Laser-scanning-Mikroskop.

Zusammenfassung

Hochmolekularen biotinylierte Dextran Amin (BDA) hat seit vielen Jahrzehnten als hochsensible neuroanatomischen Tracer verwendet worden. Da die Qualität der Beschriftung durch verschiedene Faktoren, die hier betroffen war bieten wir eine raffinierte Protokoll für die Anwendung des hohen Molekulargewichts BDA für optimale neuronale Kennzeichnung in das zentrale Nervensystem zu studieren. Nach Stereotaktische Injektion von BDA in den ventralen Posteromedial Kern (VPM) des Thalamus bei der Ratte durch eine zarte Glaspipette war BDA mit fluoreszierenden Streptavidin-Alexa (AF) 594 befleckt und counterstained mit fluoreszierenden Nissl Fleck AF500/525. Auf dem Hintergrund der grünen Nissl Färbung die roten BDA Kennzeichnung, einschließlich der neuronalen Zellkörpern und axonalen Terminals, deutlicher im somatosensorischen Cortex zeigte. Darüber hinaus verdoppelt fluoreszierende Färbung für BDA und die Kalzium-bindenden Proteins Parvalbumin (PV) wurde durchgeführt, um die Korrelation von BDA Kennzeichnung und PV-positiven Interneuronen im kortikalen Ziel, bietet die Möglichkeit, die lokale neuronale studieren zu beobachten Schaltungen und deren chemischen Eigenschaften. Also, diese raffinierte Methode eignet sich nicht nur zur Visualisierung von hochwertigen neuronale Markierung mit hohem Molekulargewicht BDA durch gegenseitige Nervenbahnen zwischen Thalamus und Großhirnrinde, aber auch erlauben die gleichzeitige Vorführung von andere neuronale Marker mit fluoreszierenden Histochemie oder Immunchemie.

Einleitung

Hochmolekularen BDA (10.000 Molekulargewicht), eine hochempfindliche Tracer für tracing Nervenbahnen in das Zentralnervensystem für über 20 Jahre¹verwendet worden. Obwohl die Verwendung des BDA eine gemeinsame neuronale Trakt tracing Technik, kann die Qualität der BDA Kennzeichnung bei Tieren durch verschiedene Faktoren^1,2,3beeinflusst werden. Unsere aktuelle Studie darauf hingewiesen, dass die optimale Struktur der BDA Beschriftung ist nicht nur eine richtige nach der Injektion Überlebenszeit zugeordnet, sondern auch mit der Färbung Methode

Protokoll

Diese Studie wurde von der Ethikkommission an der China Academy of chinesische Medical Sciences (Referenznummer 20160014) genehmigt. Alle Verfahren wurden im Einklang mit den nationalen Instituten der Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren (nationale Akademie-Presse, Washington, D.C., 1996) durchgeführt. Vier Erwachsene männlichen Ratten (Gewicht 250-280 g) wurden in dieser Studie verwendet. Alle Tiere waren untergebracht in einem 12 h Hell/Dunkel-Zyklus mit kontrollierter Temperatur und Luftfeuchtigkeit, und erlaubt freien Zugang zu Futter und Wasser. Die Instrumente und Materialien in der vorliegenden Studie wurden in Abbildu....

Ergebnisse

Überleben der 10 Tage Post Einspritzung von BDA in der VPM war ausreichend für die Herstellung von intensiven neuronalen Kennzeichnung auf den entsprechenden kortikalen Areale ipsilateral zur Injektion Seite (Abbildung 2). Sowohl konventionelle ABC und fluoreszierende Färbung Verfahren für BDA offenbart das ähnliche Muster der neuronalen Beschriftung auf der S1, einschließlich Anterogradely mit der Bezeichnung Thalamocortical Axone und doppelthebel mit der Be.......

Diskussion

Auswahl einer richtigen Tracers ist ein wichtiger Schritt für eine erfolgreiche neuronale Ablaufverfolgung Experiment. In der Familie der BDA, hochmolekularen BDA (10.000 Molekulargewicht) wurde empfohlen, bevorzugt durch die Anterograde neuronalen Signalweg im Gegensatz zu niedermolekularen BDA (3.000 Molekulargewicht)^2,3 transportiert werden ^{, 11 , 12 , 13}. .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Biotinyliertes Dextran-Amin (BDA)	Molekulare Sonden	D1956	10.000 Molekulargewicht
Streptavidin-Alexa Fluor 594	Molekulare Sonden	S32356	Schutz vor Licht
500/525 grün fluoreszierend Nissl-Färbung	Molekulare Sonden	N21480	Schutz vor Licht
Stereotaxie-Instrument für das Gehirn	Narishige	SR-50
Gefriermikrotom	Thermo	Microm International GmbH
Konfokale Bildgebung	Olympus	FV1200
System
Micro Drill	Saeyang Microtech	Marathon-N7
Sprague Dawley	Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences	SCKX (JUN) 2012-004
Vectastain ABC Kit	Vector Laboratories	PK-4000
Superfrost plus Objektträger	Thermo	#4951PLUS-001	25x75x1mm
Photoshop und Illustration	Adobe	CS5