Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

In Situ Charakterisierung von Shewanella Oneidensis MR1 Biofilmen von SALVI und ToF-SIMS

9.4K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/55944

⸱

18. August 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Earth and Biological Sciences Directorate, Pacific Northwest National Laboratory, 2Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel stellt eine Methode für den Anbau eines Biofilms für in Situ Time-of-Flight secondary Ion Massenspektrometrie für chemische Zuordnung im hydratisierten Zustand durch einen mikrofluidischen Reaktor, System zur Analyse an der flüssigen Vakuum-Schnittstelle aktiviert. Die Shewanella Oneidensis MR-1 mit grünen Fluoreszenz-Protein wurde als Modell verwendet.

Zusammenfassung

Bakterielle Biofilme sind Oberfläche-assoziierte Gemeinschaften, die stark untersucht werden, um ihre selbst produzierten extrazellulären Polymeren Substanzen (EPS) und ihre Rolle im Umweltmikrobiologie zu verstehen. Diese Studie beschreibt eine Methode zum Biofilm Bindung an das System für die Analyse bei flüssigen Vakuum Schnittstelle (SALVI) zu kultivieren und in Situ chemische Zuordnung der lebende Biofilm durch Time-of-Flight secondary Ion mass Spectrometry (ToF-SIMS) zu erreichen. Dies geschieht durch die Kultivierung von Bakterien sowohl außerhalb als auch innerhalb des Kanals SALVI mit unseren spezialisierten Einrichtung sowie durch optische bildgebende Verfahren zur Erkennung von Biofilm Präsenz und Stärke vor der ToF-SIMS-Analyse. Unsere Ergebnisse zeigen die charakteristischen Gipfel des Biofilms Shewanella in seinem Naturzustand hydratisiert dehydriert Hervorhebung auf seine lokalisierte Wasser-Cluster-Umgebung, sowie EPS Fragmente, die sich drastisch von des gleichen Biofilms unterscheiden Zustand. Diese Ergebnisse zeigen die Durchbruch-Fähigkeit von SALVI, der in Situ Biofilm Bildgebung mit einem Vakuum-basierten chemischen Bildgebung Instrument ermöglicht.

Einleitung

Bakterielle Biofilme sind Oberfläche-assoziierte Gemeinschaften, die im Laufe der Zeit als eine Verteidigung gegen Bakterien überleben unterschiedlicher ungünstige physikalische und mechanische reizen, wobei Zellen in der Lage sind zu befestigen und in vielen möglichen Umgebungen überleben entwickelt haben. 1 , 2 Biofilme werden erheblich untersucht und finden Anwendung in vielen Bereichen wie Biomedizin, biomedizinische Technik, Landwirtschaft und industrielle Forschung und Entwicklung. 1 , 2 die chemische Zuordnung dieser komplexe mikrobielle Gemeinschaften, einschließlich ihre selbst produzierten extrazellulären Polymeren Substanzen (EPS) und ihre lokalen Wasser-Cluster-Umgebung zu verstehen gilt, gewinnt eine genaue und detaillierte Darstellung ihrer biologischen Aktivitäten. 2

Biofilme bestehen und wachsen innerhalb eines stark hydratisiert Staates. Dies stellt eine große Herausforderung im Umgang mit Vakuum-basierten Oberflächenanalyse Techniken wie Time-of-Flight secondary Ion mass Spectrometry (ToF-SIMS) aufgrund der Schwierigkeiten bei der Untersuchung der flüchtiger Flüssigkeiten im Vakuum. Infolgedessen wurden Vakuum-basierten Oberflächenanalyse Techniken beschränkt sich fast ausschließlich auf Biofilm Proben im getrockneten Zustand zu studieren. Studium einen Biofilm im getrockneten Zustand hemmt jedoch die genaue Untersuchung der seine wahre biologische Mikroumgebung. Es führt oft zu drastische Veränderungen der EPS Integrität und Biofilm-Morphologie, die nach einem Vergleich trocken Biofilm Masse spektrale Ergebnisse in Situ flüssige Studien nachgewiesen wurde. 3 , 4 dieser Artikel stellt eine Lösung für das Studium von Biofilmen innerhalb ihrer natürlichen hydratisierten Zustand durch die Verwendung unseres Systems zur Analyse an flüssigen Vakuum Schnittstelle (SALVI),5,6 mikrofluidischen Reaktor, enthält Flüssigkeit unter seine dünne Silizium-Nitrid (SiN) Membran in eine Microchannel gemacht von Polydimethylsiloxan (PMDS), so bietet direkten Zugang zu den sekundären Ionenstrahl Sonde unter Beibehaltung der strukturellen Integritätdes der flüssigen Matrix in einem luftleeren Raum Kammer. 7 , 8

S. Oneidensis MR-1 mutiert auszudrücken, grüne Fluoreszenz-Protein (GFP) wurde gewählt, als Modellorganismus für dieser Biofilm Verfahren Abbildung aufgrund seiner metabolischen Vielseitigkeit und gemeinsame Nutzung in Umwelt- und angewandte Mikrobiologie, basiert stark auf seine einzigartige Fähigkeit zur Verringerung der Metall und extrazelluläre Elektronentransfer. 9 , 10 , 11 darüber hinaus ermöglichte das Vorhandensein von GFP einfach kontinuierliche Biofilm-Dicke Überwachung durch Fluoreszenz-Mikroskopie, mithilfe eines Filters Fluorescein erfolgt (FITC). Unsere frühere Studien haben Hinweise auf diese Bakterien begünstigt Anlage zum Fenster SiN mit in Operando Fluoreszenz-Bildgebung für Biofilm Wachstum bis zu einer Dicke von bis zu hundert Mikrometern gezeigt. 4 , 12 während dieses Papier nur die Bestätigung der Biofilm Präsenz durch Fluoreszenzmikroskopie besprechen, die SALVI ist kompatibel mit anderen optischen bildgebenden Verfahren wie Höchstauflösung Fluoreszenz-Bildgebung (d. h. die strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM)9) und konfokale Laser-scanning-Mikroskopie (CLSM) imaging-4). Optische Bildgebung kann dienen zur Messung der Dicke von Biofilm und ein 3D-Bild der Form des Biofilms erhalten, wie es scheint, seine Stärke und seine Verbundenheit mit der Sünde-Fenster bestätigt. 9 während GLP diente in der SIMS-Analyse, S. Oneidensis , ohne GFP diente für die Wachstumskurve, als diese nur erforderliche Messung der optischen Dichte und Fluoreszenz-Bildgebung nicht erforderlich. In der Regel die Differenz zwischen der GFP markiert und untagged Arten in der Wachstumskurve ist bedeutungslos. Darüber hinaus während dieses Protokoll S. Oneidensis MR-1 GFP als Modellorganismus verwendet, um das Verfahren zu beschreiben, ist dieses Verfahren für jeden Bakterienstamm ausgelegt, die für den Anbau in SALVI erforderlich sein kann. Obwohl Wissen der bakteriellen Belastung benötigt gegeben, müssen einige Bedingungen wie Zeit, Temperatur und Sauerstoff-Umgebung den Bakterienstamm zu verwendende angepasst werden. Wachstumsmedium verwendet dieses Verfahren "Nanodrähte" Mittel, tryptic Soy Bouillon (TSB) ohne Traubenzucker und tryptic Soy Agar (TSA) ohne Traubenzucker zur Kultivierung. Die Zusammensetzung des "Nanodrähte" Medium speziell formuliert für das Wachstum und für die Überwachung von Erweiterungen der Membran und Periplasma S. Oneidensis , die angezeigt werden, nehmen die Form von kleinen Drähten und die mittlere Zusammensetzung wurde in früheren Untersuchungen niedergelassen. 13 , 14

Unsere vorherigen Protokoll auf in Situ illustrierte flüssige ToF-SIMS nutzen SALVI für Protein Immobilisierung und Verbundenheit mit der Sünde, sowie ein detailliertes Protokoll auf ToF-SIMS Analyse und Datenreduktion zu bieten hat. 12 statt Daten Reduzierung Schritte wiederholen, wird dieses Papier dienen sich stattdessen auf den einzigartigen Ansatz der Einrichtung und Pflege von Biofilmen innerhalb unserer SALVI Microchannel sowie die bildgebenden Schritte zur Erkennung von Biofilm Präsenz und Stärke vor ToF-SIMS-Analyse. Während Biofilme zuvor begrenzt worden, haben nur getrocknet Proben innerhalb der Kammer Vakuum-basierten analytische Oberflächentechniken, detaillierte EPS und Biofilm chemische Zuordnung von Biofilmen Leben jetzt in Situ durch diese neue Funktion erhalten.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

1. Vorbereitung der Materialien

  1. Vorbereitung der Medium Tubing
    1. Serum-Flaschen (eine pro Biofilm Kultur und drei pro Wachstumskurve benötigt benötigt)
      Hinweis: wie bereits in der Einführung, Wachstum Medium geeignet, um die Nährstoffe benötigt, für den Bakterienstamm Interesse bieten kann für dieses Verfahren genutzt werden; in diesem Fall " Nanodrähte " Medien und TSB ohne Dextrose Medium für das Wachstum von S. Oneidensis MR-1 GLP verwendet wurde. 13
      1. Anzahlung 20 mL Nährmedium in einer 70 mL Serum-Flasche, den Stopfen verschließen und crimp-die Flasche. Decken Sie die Spitze mit einem sauberen sterilen Aluminiumfolie.
      2. Autoklaven die Flasche mit einem flüssigen Zyklus für 30 min bei 121 ° C. danach die sterilisierte Serum-Flasche bei Raumtemperatur lagern.
    2. Anaerobe Kultur Röhren
      1. 5 mL Wachstumsmedium auf eine anaerobe Kultur-Schlauch mit Luft Headspace einzahlen, auf den Stopper und crimp-Flasche. Decken Sie die Spitze mit einer sterilen Folie.
  2. Vorbereitung Bubble Trap Schlauch
    1. mit einer 22 Gauge-Nadel sorgfältig punch ein Loch durch einen Gummistopfen Serum Flasche.
    2. Cut 20 in 1/32 " Polytetrafluorethylen (PTFE) Schlauch mit einem Rasiermesser so, dass ein Ende des Segments Schlauch gerichtet ist.
    3. Mit dem spitzen Ende den PTFE-Schlauch durch das Loch im oberen Bereich des Gummistopfens thread. Schieben Sie den Schlauch durch, bis etwa 2 cm über den Stopper und schneiden Sie das Spitze Ende der PTFE-Schlauch mit einem Rasiermesser, ein flaches Ende haben.
    4. Entfernen Sie den Kolben der Spritze 5 mL und passen den Gummistopfen aus Schritt 1.2.3 in das offene Ende der Spritze. 2 cm endet PTFE Schlauch in den Lauf von der Spritze. Dies ist die Blase Falle.
    5. Wickeln die Blase Falle (die PTFE Schläuche, Gummistopfen und Spritze) machte im Schritt 1.2.4 mit Alu-Folie und mit Autoklav Klebeband zu sichern. Autoklaven die Folienverpackung, sterilisieren, die Schläuche mit einem Schwerpunkt bei 121 ° C für 30 min. Zyklus speichern die versiegelten Folienverpackung bei Raumtemperatur bis bereit für Schritt 2.4.
  3. Bakterielle Wachstumskurve
    Hinweis: dieses Protokoll verwendet S. Oneidensis MR-1 GFP als Modellorganismus für den Anbau des Biofilms in SALVI. Dieses Verfahren kann jedoch an anderen Bakterien wachsen aerob oder anaerob unterzubringen. Je nachdem welche Belastung verwendet wird, Wachstumszeit und Umwelt müssen entsprechend angepasst werden.
    Hinweis:-80 ° C bakterielle Gefrierschrank Aktien bestand aus einer 1:1 Mischung von TSB ohne Traubenzucker und Glycerin. Das Wachstum Kurve Beispiel in Abbildung 1 B bereitete keine Dextrose in jeweiligen 0,2 mL Mengen dreimal auf 70 mL Serum Flaschen mit 20 mL übertragen eine Starterkultur von TSB mit " Nanodrähte " Medium, Spuren von TSB zu entfernen. Dieses Protokoll setzt jedoch voraus, dass nur ein Wachstumsmedium verwendet werden und, dass spätere Übertragungen nicht, als dies durchgeführt werden mit diesen bestimmten mittleren Lösungen für S. Oneidensis geschah. Obwohl nicht in diesem Protokoll beschrieben, sind zusätzliche Übertragungen wie dies empfohlen, da zunächst Hinterlegung der Bakterien, die reiche TSB die gefrorenen Zellen wiederherstellen hilft; und drei weiteren Transfers zu " Nanodrähte " gewährleistet, dass alle TSB verschwunden ist und typische Wachstumsdynamik auftreten.
    1. Impfen die Starterkultur
      1. den bakteriellen Glycerin bestand aus dem-80 ° C Gefrierschrank zu entfernen und warm die Aktie mit einem behandschuhten Hand so schnell wie möglich Auftauen. Verschieben Sie diesen Gefrierschrank bestand in der biologischen Sicherheitsschrank (BSC).
      2. Innerhalb der BSC, verwenden Sie eine 1 mL Spritze mit einer 22G Nadel befestigt um 0,1 mL Gefrierschrank bestand auf eine angeschnittene Ärmel und gekräuselte anaerobe Kultur-Röhrchen mit 5 mL des Kulturmediums mit keine Dextrose in Schritt 1.1.2 vorbereitet zu übertragen. Entsorgen Sie die Restposten Gefrierschrank in der entsprechenden biologischen Abfallbehälter, als wieder einfrieren könnte die Zellen schockieren.
      3. Brüten die Starterkultur in einem Shaker/Inkubator bei 30 ° C bei 150 Umdrehungen pro Minute (u/min) und achten Sie darauf, eine Extinktion bei 600 nm (OD 600) lesen, wenn Sie bereit sind für den Einsatz zu nehmen. Notieren Sie die Zeit des Wachstums und der OD 600 derart, dass es gleichzeitig für den späteren Gebrauch, getan werden kann, so, dass die Ergebnisse reproduzierbar sind. Als Beispiel dieser Starterkultur für 15 h wachsen durfte und verwendet bei einer OD 600 von ca. 1,0.
    2. Impfen Wachstumsmedium
      1. die drei Serum-Flaschen im Schritt vorbereitet, 1.1.1.2 und die Starterkultur in 1.3.1.3. zubereitet, und bringen sowohl für die BSC.
      2. Innerhalb der BSC mit einer sterilen 1 mL Spritze mit einer 22G Nadel befestigt, Transfer 0,1 mL der Lösung aus der Starterkultur zu jedem der Serum-Flaschen bzw..
      3. Sterilisation oben auf die Serum-Flaschen mit 70 % Ethanol und Abdeckung mit sterilisierten Aluminiumfolie, entsprechend zu kennzeichnen, und übertragen auf einem Orbitalschüttler im Inkubator. Die Orbitalschüttler bis 150 u/min und den Inkubator auf 30 gesetzt ° C. Incubate bis der erste OD 600 Datenpunkt erfolgt im Schritt 1.3.3.
    3. Erlangung OD 600 Datenpunkten
      1. bereiten eine leere durch Hinterlegung 100 µL Filter sterilisiert destilliertem deionisiertes (DI) Wasser in einen sterilen Küvette. Wickeln Sie Kunststoff Paraffin Film um den oberen Rand der Küvette, so dass das Wasser nicht verunreinigt wird. Bei Raumtemperatur lagern. Verwendung dieser leer mit der UV/Vis-Spektralphotometer vor der Einnahme alle Datenpunkte für die Wachstumskurve durch Einfügen der Küvette und drücken " leer ".
        Hinweis: Alle 48 h eine neue leere sollten bereit sein, falsche Lesung zu vermeiden wie regelmäßig ersetzen eine leere ratsam ist.
      2. Für jeden Datenpunkt OD 600, entfernen die Serum-Flaschen im Schritt 1.3.2.3. aus dem Inkubator und Transfer zu einem sterilisierten BSC vorbereitet. Nehmen Sie 0,1 mL des Mediums beimpften von jedem Serum Flasche und Kaution in drei separat beschriftet sterile Küvetten.
      3. Nach Ausblendung, legen Sie die Küvette mit der Kultur in der ultravioletten sichtbar (UV/Vis) Spektralphotometer OD 600 eine zu einem Zeitpunkt zu lesen und erfassen alle drei Lesungen für diesen Zeitpunkt.
        Hinweis: Für S. Oneidensis MR-1, waren Datenpunkte zu 1, 14, 28, 32, 41, 57, 81 und 105 h nach der Inokulation eingenommen. Das Wachstum ist abgeschlossen, wenn die Bakterien hat der Tod abgeschlossen. Diese Punkte sollten entsprechend angepasst werden, wenn es Mangel an Wissen auf bestimmten Wachstumszeit und Tendenz der Bakterien, die in diesem Protokoll verwendeten. Besteht Unsicherheit über die Wachstumstendenz, sollte Daten häufiger, z. B. alle drei Stunden für die ersten 12 h, alle 6 Std. für nachfolgende 36 h, 12 h Abständen für die folgenden 100 h und 24 h Abständen für die endgültige 124 h.
      4. Mit OD 600 Datenpunkte als y-Achse und die Zeit als die x-Achse graph eine Kurve mit dem Durchschnitt der drei Punkte mit Standardabweichung Fehlerindikatoren für jeden Zeitpunkt mit einem Grafik-Software übernommen. Die Wachstumskurve S. Oneidensis MR-1 wird in Abbildung 1 B im Abschnitt repräsentative Ergebnisse.
      5. Verwendung des Diagramms vorbereitet im Schritt 1.3.3.4, den Zeitrahmen des Abschnitts Log-Phase die Wachstumskurve zu identifizieren. Für Shewanella ist dies zwischen 12 und 33 h des Wachstums; Daher kann gefolgert werden, dass bei 24 h von Wachstum, Shewanella werden innerhalb der Log-Phase des Wachstums, vorausgesetzt, dass die Bakterien kultiviert werden werden, mit den gleichen Medien und Behandlung vor der Verwendung, der für die Wachstumskurve verwendet wurde.

2. Kultivierung von Bakterien

  1. ersten Tag: impfen die Agarplatte
    Hinweis: in diesem Abschnitt des Verfahrens mit einer Agarose-Pla verwendet wurdeTe, eine Kolonie-bildende Einheit (KBE) in Log-Phase, statt der flüssigen Starterkultur verwendet für die Wachstumskurve zu nehmen. Dies könnte davon ausgegangen werden, um die gleichen Wachstumsbedingungen zu reproduzieren, dass TSA ohne Traubenzucker verwendet wurde und anschließend ins " Nanodrähte " Medium in das Wachstum Kurve Verfahren und die TSA hat die gleichen Inhaltsstoffe, die TSB umfassen.
    1. S. Oneidensis MR-1 GFPbacteria Lager von-80 ° C Gefrierschrank und Ort in einem Eiskübel zu entfernen, setzen Sie diese Eimer innerhalb des sterilisierten BSC.
    2. Innerhalb der BSC verwenden eine sterile 1 µL Impfschlinge kratzen die Oberfläche des gefrorenen Bakterien-Lager und die Schleife zu T-Streifen die Oberfläche eines Agarose-Platte.
    3. Nach der Versiegelung der Seiten der Platte mit Kunststoff Paraffin-Film, die Platte umdrehen und speichern in einem 30 ° C Inkubator für 24 h, bis einzelne Kolonien erscheinen.
  2. Tag 2: impfen die Serum-Flasche
    1. Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und öffnen in der BSC.
    2. Innerhalb der BSC, reinigen Sie die Oberfläche des Gummistopfens auf einer vorbereiteten Serum-Flasche aus Schritt 1.1.1 mit 70 % Ethanol in Wasser DI.
    3. Wählen Sie einen einzelnen KBE aus der Agarplatte und mit einer sterilen Spritze mit einer angehängten 22 gauge Nadel, genügend Wachstumsmedien um die Kolonie von der Platte zu vertreiben, ohne Sie zu berühren alle benachbarten Kolonien einzahlen und mischen die Kolonie mit dem Medium mit der Spitze des die Nadel.
      Anmerkung: A einzeln Kolonie gewählt werden, die weit genug weg von anderen Bakterien auf den Teller, so dass Medium drauf ohne irgendwelche anderen Kolonien hinterlegt werden kann.
    4. Mit der gleichen Spritze die Flüssigkeit von der Oberfläche der Platte zu extrahieren.
    5. Nach dem Abstich, Luftblasen in der Spritze, Spritzen Sie die Flüssigkeit in der Serum-Flasche, und legen Sie auf einem Orbitalschüttler innerhalb von 30 ° C einstellen bei 150 u/min für 24 h
      Hinweis: Tippen auf die Luftblasen aus der Spritze ist wichtig zur Vermeidung von Einführung mehr Sauerstoff in die Flasche Serum wie experimentelle Bedingungen ändern und Kohärenz zwischen den Zeiten für Bakterien verringern kann mehr Sauerstoff in die Flasche einführen.
  3. Tag 2: Sterilisation von SALVI Microchannel
    Hinweis: zur Förderung der Sterilität der das Schlauchsystem Schritte, die erfordern, lösen die Spritze aus dem Schlauch und Ersatz mit einer neuen Spritze innerhalb der BSC getan werden. Hierzu lösen Sie einfach die Spritze aus der Spritzenpumpe durch Abschrauben des Halters Metall Spritze, und bringen Sie die Spritze mit Schlauch angebracht zu einem sterilen BSC. Wenn Schlauchsystem wird erwähnt in den Verfahren, dies bezieht sich auf die Spritze mit der Flüssigkeitsbehälter, verbunden mit einem Injektor Polyetheretherketon (PEEK), PTFE-Schläuche, befestigt die Tropfkammer, hat einen PEEK-Injektor passend angebracht die SALVI Zulauf Schlauch, sowie die Outlet-Container, dem SALVI Outlet Schläuche zu dicht ist.
    1. Verwenden ein Neugerät SALVI und einseitig von einem PTFE-Schläuche eine PEEK-Montage und Injektor beimessen.
      Hinweis: SALVI Geräte werden frisch für jedes Experiment Folgendes zubereitet Gerät Herstellung frühere Studien und Patente detailliert. 5 , 6 , 8 , 15
    2. eine Spritze 2 mL 70 % igem Ethanol berücksichtigen und verbinden mit der PEEK-Montage auf die SALVI. Nach dem Anschluss der Spritze um eine Spritzenpumpe und Befestigung der Steckdose die SALVI an einer Abfallflasche, erlauben die Ethanol DI-Wasser-Lösung durch die SALVI mit 20 µL/min für 1,5 h laufen
    3. Nehmen 4 mL sterilisiert DI Wasser in eine Spritze und schließen Sie an den Eingang des gleichen SALVI. Nachdem Sie die Spritze mit einer Spritzenpumpe verbinden, lassen Sie das Wasser durch die SALVI mit 20 μl/min für mindestens 3 h laufen
    4. In ein BSC, die Folie Paket vorbereitet im Schritt 1.2.5 öffnen und schließen eine sterile PEEK-Injektion passend zum Ende der 5 mL-Spritze und sterile PEEK Armaturen bis zum Ende des TFE-Schläuche. Nehmen ~ 3 mL steriles Medium in eine Spritze und heften sich an die TFE-Röhre. Die 5 mL Tropfkammer invertieren und mit einer sterilen Spritze, das Wachstumsmedium injizieren in die Tropfkammer, bis zu einem Gesamtvolumen von 1 mL.
    5. Schließen Sie das Ende der Tropfkammer 5 mL Spritze mit dem Einlass der SALVI.
    6. 10 mL Wachstumsmedium in eine sterile Spritze und anschließen mit dem Einlass der Tropf Schläuche. Ermöglichen Sie nachdem Sie die Spritze mit einer Spritzenpumpe verbinden Mittel-und führen Sie durch die SALVI mit 20 µL/min für 12 h (oder über Nacht). Verwenden Sie Klebeband um diese Teile zu sichern. Decken Sie die Steckdose Flasche mit Folie oder Kunststoff Paraffin Film um die Wahrscheinlichkeit von Staubpartikeln und Organismen, die darin enthaltenen Medium verunreinigen zu minimieren. In Abbildung 1 A finden Sie eine detaillierte Darstellung wie diese Einrichtung aussehen soll.
      1. Erlauben die Tropf-Schläuche werden vertikal, was bedeutet, dass die Spritzenpumpe auf einer erhöhten Fläche mit Tropf, Schläuche gesicherten mit Band und mit der SALVI gesichert auf einer ebenen Fläche unten platziert werden soll.
      2. Medium durchlaufen die SALVI für 12 h um sicherzustellen, dass alle Spuren von Ethanol entfernt wurden aus dem Microchannel und Schläuche von den SALVI vor mit Bakterien impfen.
      3. Für zusätzlichen Schutz, halten die SALVI Microchannel Kammer innerhalb einer sterilisierten Petrischale mit den Seiten geschnitten, um den Einlass und Auslass-Schlauch. Darüber hinaus halten Sie Band immer am Fenster zum Schutz der Sünde Membran und Kanal vor bildgebende Analyse.
  4. Tag 3: Inokulation von SALVI Microchannel
    1. die gesamte Schlauchsystem (Spritze angeschlossen, um die Kammer SALVI, verbunden mit der Abfallflasche verbunden Tropfen) aus der Spritzenpumpe zu entfernen und bringen es auf eine sterilisierte BSC. Darüber hinaus entfernen Sie das Serum-Fläschchen aus Schritt 2.2.5 aus dem Inkubator und bringen es auf den BSC.
    2. Reinigen Sie die Oberfläche des Serum-Flaschenverschluss mit 70 % Ethanol um jegliche Kontamination zu verhindern, und verwenden Sie dann eine sterile Spritze mit einer angehängten sterile 22G Nadel 4 mL Bakterien aus der Flasche zu extrahieren.
    3. SALVI aus der 5 mL-Kammer der Tropf Schläuche zu trennen und verbinden Sie die Spritze mit beimpften Medium direkt mit dem Einlass der SALVI. Lassen Sie den Tropf-Schlauch in eine sterile Aluminium-Folie-Paket oder innerhalb der BSC.
    4. Die Spritzenpumpe mit 20 µL/min für 3 h den Kanal von SALVI, impfen, um mehrere Volumenänderungen der Flüssigkeit enthaltenen SALVI ermöglichen laufen die Spritze mit SALVI und Auslass Flasche beimessen.
    5. Nach der Inokulation, trennen Sie die Spritze mit SALVI aus der Spritzenpumpe und bringen in der BSC. Nach dem Anbringen des Einlass der SALVI zurück, die 5 mL Tropfkammer aus Schritt 2.4.3, eine sterile Spritze 20 mL Wachstumsmedium berücksichtigen und den Einlass der Tropf Schläuche beimessen.
    6. Bringen den Schlauch an die SALVI von der BSC zur Spritzenpumpe befestigt und ermöglichen das Medium durch den Schlauch mit einer Rate von 2 µL/min für sechs bis zehn Tage oder bis Fluoreszenz-Bildgebung (in Schritt 3 beschrieben) für günstige sichtbar Biofilm Wachstum zeigt ToF-SIMS-Analyse. Füllen Sie frisches Medium, wie es abläuft innerhalb der BSC eine neue sterile Spritze mit 10mL Wachstumsmedium füllen und Zuweisen der SALVI, nachdem das vorherige Wachstumsmedium abgelaufen ist.
      Hinweis: Nach Beginn der Impfung mit 2 µL/min, die Durchflussmenge sollte nie erhöht werden oder verringert, wie das Ändern des Durchfluss würde erstellen Schubspannung innerhalb des Kanals und den Biofilm zu lösen. Es ist wichtig, dass diese Durchflussrate nie geändert werden sollte; zur Vorbereitung dieser, ~ 24 h vor SIMS beobachten Sie den Schlauch eng, um sicherzustellen, gibt es keine Bläschen, so dass es keine Notwendigkeit, weitere Mittel zu drücken mit einer schnelleren Rate in den Schlauch.
      1. Vermeiden Sie Luftblasen in der Microchannel wie sie den Biofilm aus dem Kanal schieben können. Es ist wichtig, Blasen in der Unterseite der 5 mL Tropf Schläuche vorsichtig zu sein, wo es auf das SALVI Rohr verbindet. Frisches Medium kann in das Ende des Injektors PEEK um sicherzustellen, dass keine Luft in die SALVI gezwungen werden injiziert werden.

3. Optische Bildgebung des Biofilms innerhalb der SALVI Microchannel

  1. Fluoreszenz Mikroskopie Imaging
    Hinweis: Shewanella verwendet als Modellorganismus innerhalb dieses Protokolls auszudrücken, GFP mutiert ist, als solche ist nicht erforderlich Färbung. Wenn die Bakterien Färbung benötigen, sollte dies immer an den gleichen Durchfluss (z. B. 2 µL/min), Biofilm ablösen zu vermeiden erfolgen. Darüber hinaus Wenn Zellen ohne Nährstoffverfügbarkeit gehen, werden sie sich lösen. Daher, wenn zusätzliche Färbung erforderlich ist, sollte der Fleck das Wachstumsmedium anstatt Wasser injiziert werden vor der Auslieferung um die Zellen zu beflecken.
    1. Lösen die SALVI aus den Tropf, Schläuche im Inneren der BSC und Schrauben die PEEK-Armaturen um Finger-anziehen die PEEK-Union in der Nähe der SALVI.
    2. Mit Klebeband die Schläuche der SALVI Microchannel Kammer sicher auf einen Glasobjektträger derart, dass das Fenster ganz flach und nach nach oben. Entfernen Sie die Schutzfolie vom Fenster. Klemmen Sie die Folie auf die Bühne des Mikroskops durch den Objektträger zwischen Bühne Klemmen auf der Plattform platzieren.
    3. Niedriger die Bühne des Mikroskops so dass oben die SALVI positioniert ist nahe genug, um das Ende des 10 X-Objektiv, wo Anpassung des Fokus wird nicht dazu führen, dass das Objektiv, das Fenster zu berühren.
    4. Schalter auf die Hintergrundbeleuchtung und finden Sie den Kanal mit der 10-fach Mikroskopobjektiv durch Einstellung des Fokus. Sicherstellen Sie zu diesem Zeitpunkt, dass das Vorhandensein der bakteriellen Anlage zum Fenster SiN die SALVI im Vergleich zu Fenster einen Steuerkanal mit keine beimpften Bakterien hervorgeht. Zur genaueren Darstellung der Zellen, wechseln Sie zu den 20 X Objektiv. Im Vergleich zu einem leeren SALVI Kanal sollte das Vorhandensein von Bakterien an das Fenster angebracht eine starke grüne Fluoreszenz haben.
    5. Schalten Sie die Hintergrundbeleuchtung und der Mikroskop-Quecksilber-Quelle. Warten Sie 2-3 Minuten und wechseln Sie zu der FITC Filtersatz am Mikroskop zu Ansicht und Capture Bilder des Biofilms an das Fenster angebracht. Als ein Beispiel wie die gereifte Biofilm aussehen wird wenn Sie bereit sind, beziehen sich auf Abbildung 1 C.
    6. Turn off die Quecksilber-Quelle und SALVI aus der Folie lösen. Bei Bedarf legen auf 2 µL/min mittlere Strömung wieder, um mehr Wachstum vor imaging wieder zu ermöglichen, oder die SALVI Auffangeinrichtungen Verwendung für ToF-SIMS Analyse übertragen. Dies ist erforderlich, wenn Biofilm Dicke der Schluss gezogen wird, nicht dick genug sein, und mehr Zeit für Wachstum ist vor der ToF-SIMS Analyse erforderlich. Um Strom steht erneut zuordnen, finden Sie unter Schritt 2.3.6.
      Hinweis: Ob setzen Sie wieder unter Strom steht, Fluoreszenz-Bildgebung wieder vor der ToF-SIMS-Analyse durchgeführt werden soll.
      1. Geben den Biofilm Wachstumsmedium um es zu füttern, bis ToF-SIMS-Analyse durchgeführt werden kann. Obwohl dies nicht empfohlen, wenn nötig, die geschlossene SALVI kann über Nacht innerhalb von 4 ° C gelagert werden, darf aber auf Raumtemperatur erwärmen vor dem Einlegen in die Vakuumkammer der ToF-SIMS. Jedoch analysieren den Biofilm unmittelbar nach losgelöst von Medium-Fluss, Biofilm ablösen zu reduzieren.

4. ToF-SIMS Data Acquisition

Hinweis: Dieser Abschnitt dient als Überblick und wird ausführlicher in unseren früheren Protokoll beschreibt adsorbierten Protein Molekül SIMS Flüssigkeitsanalyse diskutiert. 12

  1. Installieren SALVI in die ToF-SIMS Klemmbalken Kammer
    Hinweis: sollten Handschuhe getragen werden, in allen Zeiten als SALVI Handhabung und installieren Sie es auf die ToF-SIMS zur Vermeidung von möglichen Kontaminationen während Oberfläche Stadium Analyse.
    1. Mount SALVI auf die Bühne und mit mehreren Schrauben befestigen. Sicherstellen Sie, dass die Sünde Fenster flach durch Anpassung Schraube Dichtigkeit und einfügen Silizium-Wafer Stücke am unteren Rand der PDMS Microchannel Kammer. Entfernen Sie die Schutzfolie aus dem Fenster, dann laden Sie die Bühne in der ToF-SIMS Klemmbalken Kammer.
    2. Öffnen der ToF-SIMS Klemmbalken, halten die Bühne horizontal auf der Ladefläche und Klemmbalken Tür schließen. Die Vakuumpumpe zu initiieren und warten, um sicherzustellen, dass geeignete Vakuum erreicht ist.
    3. Die SALVI in die Hauptkammer zu bewegen, sobald das Vakuum bis 1 x 10 -7 Mbar stabilisiert wird.
  2. Tiefe Profilierung und sammeln Daten Punkte
    1. den Mikrofluidik-Kanal das optische Mikroskop ausgestattet in ToF-SIMS zu finden.
    2. Positive oder negative Auswahlmodus vor der Datenerfassung. Nutzung der 25 keV Bi 3 + beamen als der primäre Ionenstrahl in allen Messungen, und Flut Elektronenkanone verwenden, um die Aufladung bei allen Messungen Oberfläche neutralisieren.
    3. Scan der Bi-3 +-Strahl mit 150 ns Impuls Breite auf einer runden Fläche mit einem Durchmesser von ~ 2 µm mit 64 Pixel x 64 Pixel Auflösung. Nach dem Stanzen durch Fenster SiN 100 nm, weiterhin für weitere 150 scan s high-Intensity-Daten für die Bildgebung zu sammeln. Nach Punch through erheblich in die Tiefe Profilierung der Region die Grafen. Nach Stabilisierung, dies kann bezeichnet werden als die Region von hoher Intensität.
    4. Reduzieren die Impulsbreite bis 50 ns für die Datenerfassung, Spektren mit besseren Massenauflösung zu erwerben. Diese Akquisition für über 200 weiter s.
    5. Wiederholen Sie diese Schritte für das Sammeln von mindestens drei Positive und drei negative Datenpunkte.
      Hinweis: Achten Sie darauf, die Punch through Bereichen Raum so, dass die Sünde-Fenster nicht brechen wird und Leck in die Kammer des Vakuums aus Fenster Integrität gefährdet.

5. ToF-SIMS Datenanalyse

    1. Masse Kalibrierung mittels IonToF Software die Analysesoftware von ToF-SIMS (Messung Explorer) zu öffnen und klicken Sie dann auf die " Profile ", " Spektren " und " Bild " Tasten, bzw., um Prozess-Tiefenprofil, m/Z Spektrum und Bilddaten.
    2. Öffnen die Datendateien im gesamten ToF-SIMS Datenerfassung erhalten.
    3. Wählen Sie die Tiefe Profilerstellungsdaten von Interesse und rekonstruieren die Spektren entsprechend der zeitlichen Tiefe Profilserie.
    4. Presse " F3 " öffnen die " Masse Kalibrierung " Fenster. Wählen Sie Spitzen für die Kalibrierung anhand von chemischen Verbindungen, die voraussichtlich in der spezifischen Probe vorhanden sind.
  2. Peaks of Interesse Selection
    1. Peak Auswahl zur Probenanalyse notwendig ist, charakteristische Peaks der Probe nach Literatur oder anderen bisherigen Erkenntnissen, festzustellen, wenn überhaupt. Vergleichen Sie die Intensität der Gipfel des Interesses an den m/Z-Spektren. Bei Bedarf neue Spitzen hinzufügen oder Löschen von Störungen Gipfeln in der Spitze Liste.
    2. Klick auf einen Höhepunkt finden die roten Linien am linken unteren Fenster. Verschieben Sie die roten Linien zu umschließen die ganze Spitze.
    3. Wählen Sie ein Peak passend die chemische Formel im wichtigsten Spektrumfenster, und dann klicken Sie auf die " Höhepunkt hinzufügen " Taste über dem Fenster. < /Li >
  3. Masse kalibriert Daten exportieren
    1. Export eine Peak-Liste, in der " Peak Liste " Menü, wählen Sie " sparen … " der Peak-Liste in der " Itmil " Format.
    2. Ein Tiefenprofil, Export in das " Profil " Fenster, klicken Sie auf die " Datei " Menü, wählen Sie dann " exportieren ", und wählen Sie dann " speichern als " eine " .txt " Datei.
    3. Eine m/Z-Spektrum-Datei exportieren in die " Spektren " Fenster, klicken Sie auf die " Datei " Menü, wählen Sie dann " exportieren ", und wählen Sie dann " speichern als " eine " .txt " Datei.
    4. Export eine Image-Datei in das " Bild " Fenster "" Bildschirm drucken und speichern Sie als Image-Datei.

6. ToF-SIMS Daten Plotten und Präsentation

  1. ein Grafik-Tool verwenden, um die Daten zu importieren.
  2. Machen ein Grundstück mit m/Z als die x-Achse und Peak Intensität als y-Achse das rekonstruierte Spektrum zeigen. Ein Beispiel ist dargestellt in Abbildung 2 A.
  3. Rekonstruiert kombinieren zweidimensionale (2D) Bilder von verschiedenen m/Z und bilden eine Matrix, entweder positiv oder Negativ-Ionen-Zuordnung zu zeigen. Ein Beispiel ist dargestellt in Abbildung 2 B.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Diese repräsentative Ergebnisse dienen, wie das chemische Profil des angehängten Biofilms kann erkannt und interpretiert, zu zeigen, wie durch ToF-SIMS erhalten. Nach dem Plotten Massenspektren von ToF-SIMS Datenerfassung, kurz im Abschnitt "Vorgehensweise" hervorgehoben sollte Peak Identifikation durchgeführt werden, um Identitäten zu jeder jeweiligen m/Z-Wert zuweisen. Dies kann erfolgen durch umfangreiche Literaturrecherche auf Massenspektrometrie auf Bakterien und bestimmte chemische ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Nach dem impfen bei Log-Phase, ist es wichtig, die Anzahl der Tage und die Temperatur bei dem der Biofilm wachsen sollte, bevor es gesund und dick genug für die Bildgebung, wie unter Punkt 3.1 beschrieben testen. Dieses Verfahren umfasst speziell Kultivierung einer S. Oneidensis MR1 Biofilm bei Raumtemperatur; jedoch können unterschiedliche Raumtemperaturen die Wachstumsrate beeinflussen. Daher ist es wichtig um zu verstehen, ob der Biofilm bereit, bevor Sie fortfahren, ToF-SIMS Analyse ist verwenden optische Bildgebung....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir sind dankbar für Unterstützung des Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) Erde und biologischen Wissenschaften (EBD) Mission Samen Labor leitete Forschung und Entwicklung (LDRD) Fonds. Instrumental wurde durch W. R. Wiley Umwelt Molecular Sciences Laboratory (EMSL) allgemeine Benutzer Vorschlag zur Verfügung. EMSL ist eine nationale wissenschaftliche Benutzer Einrichtung Büro der biologischen und ökologischen Forschung (BER) auf PNNL gesponsert. Die Autoren danken Dr. Yuanzhao Ding zum Beweis das Manuskript zu lesen und nützliche Rückmeldungen. Battelle für DOE unter Vertrag DE AC05 76RL01830 PNNL gesteuert.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ToF-SIMSIONTOFTOF. SIMS 5Auflösung: >10.000 m/Δ m für Massenauflösung; >4.000 m/Δ m für High Spatial
Resolution System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI)Pacific Northwest National LaboratoryN/ASALVI ist ein einzigartiges, in sich geschlossenes, tragbares Analysewerkzeug, das es zum ersten Mal vakuumbasierten wissenschaftlichen Instrumenten wie der Flugzeit-Sekundärionen-Massenspektrometrie (ToF-SIMS) ermöglicht, flüssige Oberflächen in ihrem natürlichen Zustand auf molekularer Ebene zu analysieren.
-80 Grad; C GefrierschrankNew Brunswick ScientificN/AU410 Premium Energy Efficient Ultra-Tiefkühlschrank
4&Grad; C KühlschrankBioCold ScientificN/ACOLDBOX1
OrbitalschüttlerNew Brunswick ScientificN/AInnova 4900 Mehrstufiger Umweltschüttler, eingestellt auf 30 Grad Celsius für die Kultivierung von Serumflaschen und -kolben, eingestellt auf 150 U/min.
SpritzenpumpeCole-ParmerEW-74905-02Cole-Parmer Spritzenpumpe, nur Infusion, Touchscreen-Steuerung 74905-02, zur Injektion von Flüssigkeit in das Schlauchsystem und SALVI bei konstanter Durchflussrate.
InkubatorBarnstead InternationalLT1465X3Lab-Line Inkubator, eingestellt auf 30 Grad Celsius für die Plattenkultur.
AutoklavGetinge533LSWird zur Sterilisation von PEEK-Fittings, Schlauchsystemen, Serumfläschchen und Medien verwendet. Modell 533LS Vakuum-Dampfsterilisator-Spektralphotometer
Thermo Fisher Scientific4001-000GENESYS 20 Spektralphotometer für OD600-Messwerte von Küvetten für Wachstumskurven.
Biologische SicherheitswerkbankThermo Fisher Scientific13851300 Serie AZ Biologische Sicherheitswerkbank
FluoreszenzmikroskopNikonN/ANikon OPTIPHOT-2 Fluoreszenzmikroskop mit Kamera und Netzteil für Superhochdruck-Quecksilberlampe.
pH-MessgerätMettler Toledo51302803Wird verwendet, um den pH-Wert des " Nanodrähte" medium nach Fertigstellung und vor dem Autoklavieren.
PEEK UnionValcoZU1TPKZum Verbinden des Ein- und Auslasses von SALVI, der Spritze mit dem Schlauchsystem und des Einlasses des SALVI mit der Tropfkammer des Schlauchsystems.
5 Achsen ProbentischIONTOFN/ATisch ist ein Eigenbau für die Montage von SALVI in ToF-SIMS.
Barnstead Nanoreines WasseraufbereitungssystemThermo Fisher ScientificD11921ROpure LP Umkehrosmose-Filtrationsmodul (D2716)
PipetteThermo Fisher Scientific21-377-821Bereich: 100 bis 1.000 & Mikro;L.
PipettenspitzeNeptune2112.96.BS1.000 & micro; L Pipettenspitzen
RasierklingengriffStanleyN/AStanley Bostitch Rasierklingenschaber mit 5 einschneidigen Klingen, zum Schneiden von PTFE-Schläuchen
SpritzeBD3096591 mL
SpritzeBD3096573 mL
SpritzeBD3096465 mL; Wird für die Herstellung der Tropfkammer
verwendet SpritzeBD30960410 mL
SpritzeBD30283020 mL
EinwegpipetteThermo Fisher Scientific13-678-1125 mL Fisherbrand™ Sterile serologische Einwegpipetten aus Polystyrol mit Lupenstreifen, zum Befüllen von Serumflaschen.
Elektrischer PipettenfüllerPipetenhilfeP-57260Elektrischer servologischer Pipettenfüller mit Vakuumdruck
SerumflascheSigma33109-UFasst ca. 69 ml Flüssigkeit für das Kulturwachstum, optimal für die Verwendung von 20 ml Kultur pro Flasche.
Anaerober KulturschlauchVWR89167-178Anaerober Schlauch, 18 x 150 mm, Lieferung mit 20 mm blauem Butylkautschukstopfen und Aluminiumdichtung.
GummistopfenSigma27235-USilikonstopfen, der zum Verschließen von Serumflaschen und zum Erstellen des Schlauchsystems/der Tropfkammer verwendet wird.
Aluminium-Bördeldichtung (ohne Septum)Sigma27227-UAluminiumdichtung für die Oberseite der Serumflasche zur Verwendung mit der Serumflaschen-Crimpzange.
Serum Bottle Aluminium-Dichtungs-CrimpzangeWheaton22430730 mm Crimpzange mit Standard-Dichtung.
PTFE-SchlauchSupelco58697-U1,58 mm AD x 0,5 mm ID 50 ft. PTFE-Teflonschlauch, der zur Herstellung des Schlauchsystems verwendet wird.
Einweg-KüvettenGMBH759085D1,5 Ml zur Verwendung mit Spektralphotometern.
NadelBD30301522G; wird für die Injektion von Serumflaschen verwendet.
NadelBD30512023G; wird zum Durchstanzen des Gummistopfens verwendet, um ein Tropfschlauchsystem zu erstellen.
Shewanella oneidensis MR-1 mit GFPN/AN/AMatthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Konstruktion von GFP-Vektoren zur Verwendung bei anderen gramnegativen Bakterien als Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94. 
EthanolThermo Fisher Scientific S25310A95% denaturiertes
TSABD212305Tryptischer Soja-Agar zur Kultivierung des Modellorganismus (S. oneidensis), der in diesem Protokoll verwendet wird
PIPES BufferSigmaP-1851Verwendet für " Nanodrähte" mittel {Hill, E.A. 2007}
NatriumhydroxidSigmaS-5881Verwendet für " Nanodrähte" mittel {Hill, E.A. 2007}
AmmoniumchloridSigmaA-5666Verwendet für " Nanodrähte" mittel {Hill, E.A. 2007}
KaliumchloridSigmaP-4504Verwendet für " Nanodrähte" mittel {Hill, E.A. 2007}
Monobasisches NatriumphosphatSigmaS-9638Verwendet für " Nanodrähte" mittel {Hill, E.A. 2007}
NatriumchloridThermo Fisher ScientificS271-3Verwendet für " Nanodrähte" und zur Herstellung einer mineralischen Lösung verwendet, die für " Nanodrähte" mittel {Hill, E.A. 2007}
NatriumlactatSigmaL-137560%(w/w) Sirup @ 98% rein, d=1,3 g/mL, 7M, verwendet für " Nanodrähte" medium {Hill, E.A. 2007}
NatriumbicarbonatSigmaS-5761Wird zur Herstellung von Eisen(III)-NTA-Lösung verwendet, verwendet für " Nanodrähte" medium {Hill, E.A. 2007}
Nitrilotriacetic Acid Trisodium SaltSigmaN-0253Wird zur Herstellung von Eisen(III)-NTA-Lösung verwendet, verwendet für " Nanodrähte" mittel {Hill, E.A. 2007}
Eisen (III)-chloridSigma451649Wird zur Herstellung von Eisen(III)- NTA-Lösung verwendet, verwendet für " Nanodrähte" mittel {Hill, E.A. 2007}
MagnesiumsulfatSigma208094Wird zur Herstellung von Mineralien verwendet, verwendet für " Nanodrähte" mittel {Hill, E.A. 2007}
Mangan (II)-sulfat-MonohydratSigmaM-7634Wird zur Herstellung von Mineralien verwendet Lösung, verwendet für " Nanodrähte" mittel {Hill, E.A. 2007}
Eisen(II)-sulfat-HeptahydratSigma215422Wird zur Herstellung von Mineralien verwendet, verwendet für " Nanodrähte" mittel {Hill, E.A. 2007}
Calciumchlorid-DihydratSigma223506Wird zur Herstellung von Mineralien verwendet, verwendet für " Nanodrähte" mittel {Hill, E.A. 2007}
Kobalt(II)-chloridSigma60818Wird zur Herstellung von Mineralien verwendet, verwendet für " Nanodrähte" mittel {Hill, E.A. 2007}
ZinkchloridSigma229997Wird zur Herstellung von Mineralien verwendet, verwendet für " Nanodrähte" mittel {Hill, E.A. 2007}
Kupfer(II)-sulfat-PentahydratSigmaC-8027Wird zur Herstellung von Mineralien verwendet Lösung, verwendet für " Nanodrähte" mittel {Hill, E.A. 2007}
Aluminium-Kaliumsulfat-DodecahydratSigma 237086Wird zur Herstellung von Mineralien verwendet, verwendet für " Nanodrähte" mittel {Hill, E.A. 2007}
BorsäureSigmaB-6768Wird zur Herstellung von Mineralien verwendet, verwendet für " Nanodrähte" medium {Hill, E.A. 2007}
NatriummolybdatdihydratSigma331058Wird zur Herstellung von Mineralien verwendet, verwendet für " Nanodrähte" mittel {Hill, E.A. 2007}
Nickel(II)-chloridSigma339350Wird zur Herstellung von Mineralien verwendet, verwendet für " Nanodrähte" mittel {Hill, E.A. 2007}
Natriumwolframat-DihydratSigma14304Wird zur Herstellung von Mineralien verwendet, verwendet für " Nanodrähte" medium {Hill, E.A. 2007}
D-BiotinSigma47868Wird zur Herstellung von Vitaminlösung verwendet, verwendet für " Nanodrähte" mittel {Hill, E.A. 2007}
FolsäureSigmaF-7876Wird zur Herstellung von Vitaminlösung verwendet, verwendet für " Nanodrähte" mittel {Hill, E.A. 2007}
PyridoxinhydrochloridSigmaP-9755Wird zur Herstellung von Vitaminlösung verwendet, verwendet für " Nanodrähte" medium {Hill, E.A. 2007}
Riboflavin (B2)Sigma47861Wird zur Herstellung von Vitaminlösung verwendet, verwendet für " Nanodrähte" mittel {Hill, E.A. 2007}
ThiaminhydrochloridSigmaT-4625Wird zur Herstellung von Vitaminlösung verwendet, verwendet für " Nanodrähte" mittel {Hill, E.A. 2007}
NikotinsäureSigmaN4126Wird zur Herstellung von Vitaminlösung verwendet, verwendet für " Nanodrähte" medium {Hill, E.A. 2007}
D-Pantothensäure HemicalciumsalzSigma21210Wird zur Herstellung von Vitaminlösung verwendet, verwendet für " Nanodrähte" mittel {Hill, E.A. 2007}
Vitamin B12SigmaV-2876Wird zur Herstellung von Vitaminlösung verwendet, verwendet für " Nanodrähte" mittel {Hill, E.A. 2007}
4-AminobenzoesäureSigmaA-9878Wird zur Herstellung von Vitaminlösung verwendet, verwendet für " Nanodrähte" mittel {Hill, E.A. 2007}
ThioctsäureSigmaT-1395Wird zur Herstellung von Vitaminlösung verwendet, verwendet für " Nanodrähte" mittel {Hill, E.A. 2007}

Referenzen

  1. Renner, L. D., Weibel, D. B. Physicochemical regulation of biofilm formation. MRS Bull. 36 (5), 347-355 (2011).
  2. Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 623-633 (2010).
  3. Aldeek, F., et al. Patterned hydrophobic domains in the exopolymer matrix of Shewanella oneidensis MR-1 biofilms. Appl Environ Microbiol. 79 (4), 1400-1402 (2013).
  4. Hua, X., et al. In situ molecular imaging of a hydrated biofilm in a microfluidic reactor by ToF-SIMS. Analyst. 139 (7), 1609-1613 (2014).
  5. Yu, X. Y., Yang, L., Cowin, J. P., Iedema, M., Zhu, Z. Systems and methods for analyzing liquids under vacuum. US Patent. , (2013).
  6. Yu, X. Y., Liu, B., Yang, L., Zhu, Z., Marshall, M. J. Microfluidic electrochemical device and process for chemical imaging and electrochemical analysis at the electrode-liquid interface in situ. US Patent. , (2014).
  7. Yang, L., Yu, X. Y., Zhu, Z. H., Thevuthasan, T., Cowin, J. P. Making a hybrid microfluidic platform compatible for in situ imaging by vacuum-based techniques. J Vac Sci Technol A. 29 (6), (2011).
  8. Yang, L., Yu, X. Y., Zhu, Z. H., Iedema, M. J., Cowin, J. P. Probing liquid surfaces under vacuum using SEM and ToF-SIMS. Lab Chip. 11 (15), 2481-2484 (2011).
  9. Ding, Y., et al. In Situ Molecular Imaging of the Biofilm and Its Matrix. Anal Chem. , (2016).
  10. Yang, J., Ghobadian, S., Montazami, R., Hashemi, N. Proceedings of the Asme 11th Fuel Cell Science, Engineering, and Technology Conference, 2013. , (2013).
  11. Yu, F., Wang, C. X., Ma, J. Applications of Graphene-Modified Electrodes in Microbial Fuel Cells. Materials. 9 (10), (2016).
  12. Yu, J., Zhou, Y., Hua, X., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS. J Vis Exp. (108), e53708(2016).
  13. Hill, E. A. Effects of Electron-Transport-System Impairment on Hydrogen Gas Production by the Bacterium Shewanella oneidensis MR-1. , Washington State University. Master's thesis (2007).
  14. McCormick, A. J., et al. Biophotovoltaics: oxygenic photosynthetic organisms in the world of bioelectrochemical systems. Energy Environ Sci. 8 (4), 1092-1109 (2015).
  15. Liu, B., et al. In situ chemical probing of the electrode-electrolyte interface by ToF-SIMS. Lab Chip. 14, 855-859 (2014).
  16. Keune, K., Hoogland, F., Boon, J. J., Peggie, D., Higgitt, C. Evaluation of the "added value" of SIMS: A mass spectrometric and spectroscopic study of an unusual Naples yellow oil paint reconstruction. Int J mass Spectrom. 284 (1-3), 22-34 (2009).
  17. Lee, M. Mass Spectrometry Handbook. , John Wiley & Sons Inc. 988(2012).
  18. Petrovic, M., Barcelo, D. Determination of anionic and nonionic surfactants, their degradation products, and endocrine-disrupting compounds in sewage sludge by liquid chromatography/mass spectrometry. Anal Chem. 72 (19), 4560-4567 (2000).
  19. Vickerman, J. C. Molecular Imaging and Depth Profiling by Mass Spectrometry--Sims, MALDI or DESI. Analyst. 136 (11), (2011).
  20. Weng, L. T., Bertrand, P., Stonemasui, J. H., Stone, W. E. E. Tof Sims Study of the Desorption of Emulsifiers from Polystyrene Latexes. Surf Interface Anal. 21 (6-7), 387-394 (1994).
  21. Peñuelas-Urquides, K., et al. Measuring of Mycobacterium tuberculosis crowth. A correlation of the optical measurements with colony forming units. Braz J Microbiol. 44 (1), 287-289 (2013).
  22. Dohnalkova, A. C., et al. Imaging hydrated microbial extracellular polymers: comparative analysis by electron microscopy. Appl Environ Microbiol. 77 (4), 1254-1262 (2011).
  23. Yang, L., et al. In situ SEM and ToF-SIMS analysis of IgG conjugated gold nanoparticles at aqueous surfaces. Surf Interface Anal. 46, 224-228 (2013).
  24. Yu, J. C., et al. Capturing the transient species at the electrode-electrolyte interface by in situ dynamic molecular imaging. Chem Commun. 52 (73), 10952-10955 (2016).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Weitere Artikel entdecken

Biofilm-Bildgebungmikrofluidischer KanalFlugzeit-Sekundärionen-MassenspektrometrieSystem zur Analyse an der Flüssigkeits-Vakuum-GrenzflächeIn-situ-chemische Kartierungextrazelluläre polymere SubstanzenKultivierung bakterieller Biofilme
In Situ Charakterisierung von Shewanella Oneidensis MR1 Biofilmen von SALVI und ToF-SIMS
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.