Beurteilung der räumlichen Gedächtnisstörung in einem Mausmodell der traumatischen Gehirnverletzung unter Verwendung eines Radialwasserlaufstreifens

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll für einen mausspezifischen Test der Kognition vor, der kein Schwimmen erfordert. Dieser Test kann verwendet werden, um kontrollierte kortikale Auswirkungen-induzierte traumatische Hirnverletzung Mäuse von Scheinkontrollen erfolgreich zu unterscheiden.

Abstract

Trotz der jüngsten Zunahme der Verwendung von Mausmodellen in der wissenschaftlichen Forschung, Forscher weiterhin kognitive Aufgaben, die ursprünglich entworfen und validiert wurden für Ratte verwenden. Der Radial-Wasser-Schritt (RWT) Labyrinth-Test des Raumgedächtnisses (speziell für Mäuse entworfen und kein Schwimmen erforderlich) wurde bisher gezeigt, um erfolgreich zwischen kontrollierten kortikalen Schlag-induzierten TBI-Mäusen und Scheinkontrollen zu unterscheiden. Hier wird ein ausführliches Protokoll für diese Aufgabe vorgestellt. Das RWT-Labyrinth nutzt die natürliche Tendenz von Mäusen, um offene Flächen zugunsten der Umarmung der Seiten eines Apparates (Thigmotaxis) zu vermeiden. Die Wände des Labyrinths sind mit neun Fluchtlöchern versehen, die über dem Boden des Apparates platziert sind, und Mäuse sind ausgebildet, um visuelle Hinweise zu verwenden, um das Fluchtloch zu finden, das aus dem Labyrinth herausführt. Das Labyrinth ist mit einem Zoll kaltes Wasser gefüllt, genug, um die Flucht zu motivieren, aber nicht tief genug, um zu verlangen, dass die Maus schwimmt. Die Erwerbszeit beträgt nur vier SchulungenTage, mit einem Test der Gedächtnisretention am Tag fünf und ein Langzeitgedächtnistest am Tag 12. Die hier gemeldeten Ergebnisse deuten darauf hin, dass das RWT-Labyrinth eine machbare Alternative zu Ratten-validierten, schwimmenden kognitiven Tests bei der Beurteilung von räumlichen ist Speicherdefizite in Mausmodellen von TBI.

Introduction

Gedächtnisstörungen gehören zu den häufigsten Symptomen, die von Patienten nach traumatischen Hirnverletzungen (TBI) ^{1 , 2 berichtet wurden} . Eine genaue Identifizierung und Bewertung von analogen Speicherdefiziten in Tiermodellen von TBI ist daher für unser Verständnis dieser Bedingung und ihrer Verwaltung unerlässlich. Hier stellen wir ein Protokoll vor, um räumliches Gedächtnis in einem Mausmodell von TBI unter Verwendung eines Radial Water Tread (RWT) Labyrinths zu testen. Dieses Gerät wurde bisher gezeigt, um kognitive Defizite in Mausmodellen von kontrollierten kortikalen Auswirkungen (CCI) -induzierten TBI ³ zu bewerten und stellt eine mögliche Alternative zu Ratten-validierten, schwimmen-basierten Tests der Kognition dar.

Die zunehmende Vielfalt und Verfügbarkeit von transgenen Mausmodellen hat zu einer jüngsten Zunahme der Verwendung von Mäusen gegenüber Ratten in der wissenschaftlichen Forschung geführt ⁴ . Trotz dieser Verschiebung verlassen sich die Forscher weiterhin auf VerhaltensweisenKognitive Aufgaben, die ursprünglich für die Rattengebrauch entworfen und validiert wurden. Die häufigsten Tests, die zur Beurteilung der Erkenntnis bei Mäusen, dem Morris Water Maze (MWM) und dem Barnes Circular Labyrinth verwendet wurden, wurden speziell entworfen, um auf instinktive Verhaltensweisen, die bei Ratten ^{5 , 6} gefunden wurden, zu profitieren. In Anbetracht der genetischen, neuroethologischen und kognitiven Unterschiede, die zwischen diesen beiden Arten ^{4 bestehen} , ist es nicht überraschend, dass Mäuse sich konsequent diesen Aufgaben unterziehen ^{7 , 8} .

Speziesabhängige Unterschiede in der Prüffähigkeit sind insbesondere bei schwimmenden kognitiven Tests wie dem MWM zu berücksichtigen. Während sowohl Ratten als auch Mäuse kompetente Schwimmer sind, haben Forscher mehrere Mausstämme identifiziert, die bemerkenswert schlecht auf schwimmenden kognitiven Aufgaben ^{9 , 10 , 11 , 12 , 13} . Sogar bei Wildtyp-Tieren übertreffen Ratten in der Regel Mäuse ^{7 , 8} . Während dies als Spezies-spezifischer Unterschied im Raumgedächtnis interpretiert werden konnte, zeigten analoge Folgeuntersuchungen mit einem Trockenland-Labyrinth keine speziesabhängigen Unterschiede in der kognitiven Leistungsfähigkeit ⁸ . Eine Reihe von Faktoren, die nicht mit der Erkenntnis in Zusammenhang stehen, könnte für diesen Befund verantwortlich sein, einschließlich artenabhängiger Unterschiede in der Schwimmfähigkeit oder der Suchstrategie. In der Tat zeigen die Faktorenanalyse von mausspezifischen Suchstrategien im MWM, dass nicht-kognitive Faktoren (insbesondere Thigomotaxis und Passivität [ dh Floating]) eine bedeutendere Rolle bei der MWM-Leistung spielen können als das räumliche Lernen ¹⁴ .

Hier zeigen wir den Einsatz eines kognitiven Tests, der darauf abzielt,Stinktuales Verhalten von Mäusen, und die kein Schwimmen erfordert, um die räumliche Gedächtnisstörung in einem Mausmodell von CCI-induziertem TBI zu messen. Während das RWT-Labyrinth ( Abbildung 1 A-B ) als neuartiges Hybrid aus dem MWM- und Barnes-Kreis-Labyrinth konzipiert wurde, wurde es speziell entworfen, um das thigmotaktische Verhalten instinktiv für die Mäuse ^{15 , 16 zu nutzen} . Die Apparatur besteht aus einer galvanisierten Stahlwanne mit einem Durchmesser von 32 Zoll, in der sich neun gleichmäßig beabstandete Austrittslöcher gebohrt haben. Die Löcher sind 2-1 / 4 Zoll über dem Boden der Wanne zentriert und sind so bemessen, dass sie häufig vorhandene 1-1 / 2 Zoll ABS DWV SPG x SJ Fangadapter passen. Acht der Ausgänge sind von außen verschlossen und bis zu einer Tiefe von 1 Zoll mit Gummistopfen verblendet. Der Neunte ist durch ein 90 ° Acrylnitril-Butadien-Styrol (ABS) -Ellbogen mit einer opaken Plastikbox verbunden, aus der die Maus nach dem Testen leicht entfernt werden kann. Im Laufe einesKurze Erfassungsperiode, wird die Maus trainiert, um die einzigartigen visuellen Cues zu verwenden, die das Labyrinth auskleiden, um diese Fluchtbox zu lokalisieren. Während des Testens wird das Labyrinth mit einem Zoll kaltes Wasser (12-14 ° C) gefüllt, das ausreichend aversiv genug ist, um die Flucht zu fördern, aber nicht tief genug, dass die Maus zum Schwimmen benötigt wird.

Das RWT-Labyrinth stellt eine kostengünstige, wartungsarme Alternative zum MWM dar und wurde erfolgreich bei alten und transgenen Mäusen ^{15 , 17 , 18 , 19} und CCI-induzierten Mausmodellen von TBI ^{3 eingesetzt} . Das hier skizzierte Protokoll stellt eine einfache und effektive Methode zur Messung der räumlichen Gedächtnisstörung dar, die keine Vorverletzungstraining erfordert und sich leicht an die Bedürfnisse eines Forschungslabors anpassen lässt.

Protocol

Alle Verfahren und Tierhandhabung wurden in Übereinstimmung mit den Tierpflege-Richtlinien von den National Institutes of Health und von der University of Washington Animal Care and Use Committee durchgeführt.

1. Chirurgie

1. Anästhesieren Sie die Maus bei 5% Isofluran in einer Induktionskiste bis unbewusst. Bestätigen Sie die Anästhesie durch eine Verringerung der Atemfrequenz und das Fehlen eines Rückzugsreflexes nach Zehensperre.
2. Pflegen Sie die Anästhesie über Nasenkegel bei 2-2,5% während der Operation. Überwachen Sie die Atemfrequenz während der Operation, um sicherzustellen, dass die Maus unbewusst bleibt.
3. Legen Sie die Maus anfällig auf ein Heizkissen und positionieren Sie die Maus in die stereotaktische Gerät mit Ohrbügel, so dass der Kopf sicher und flach ist.
4. Haare aus der Kopfhaut mit Haarentfernungscreme entfernen. Spülen Sie die Kopfhaut gründlich mit Kochsalzlösung.
5. Reinigen Sie die chirurgische Stelle mit einem abwechselnden Jod und 70% Ethanol waschen.
6. AdministeRa-subkutane Injektion von Lidocain und Bupivacain (1 mg / kg) an der Kopfhaut.
7. Mit chirurgischen Scheren, machen eine Längsschnittlinie Einschnitt, und ziehen Sie die Haut, um den Schädel zu enthüllen.
8. Mit einer 5 mm Trephinsäge-Vorform eine Kraniotomie über die linke frontoparietale Kortex mit Mittelpunkt bei 2,5 mm hinter Bregma und 2,5 mm links von der Mittellinie. Entfernen Sie vorsichtig den Kreis des Knochens, um das Gehirn freizulegen.
9. Stellen Sie das Impaktorgerät auf eine Geschwindigkeit von 6 m / s und 200 ms Verweilzeit ein.
10. Positionieren Sie die Impaktor-Vorrichtung, bis die 3 mm konvexe Schlagspitze die Oberfläche des Gehirns bei 2,5 mm hinter Bregma und 2,55 mm links von der Mittellinie leicht berührt. Ziehen Sie die Aufprallspitze ein und senken Sie um 1 mm (Aufpralltiefe). Wenn bereit, schießen Sie das Gerät, wodurch die gewünschte Wirkung.
11. Decken Sie die Kraniotomie mit einer sterilen Polypropylen-Scheibe zementiert, um die Haut mit Gewebe Klebstoff zementiert, und Naht der Einschnitt geschlossen.
12. Entfernen Sie die Maus aus der Anästhesie und geben Sie die IP-Injektion von BuprEnorphin (0,5 mg / kg).
13. Lassen Sie die Maus in einem sauberen Käfig erholen, erwärmt von einem Heizkissen. Die Maus sollte während der nächsten 24 Stunden auf Anzeichen von Schmerzen oder Bedrängnis überwacht werden.
    HINWEIS: Scheinkontrollen sollten eine identische Behandlung wie oben erhalten, wobei die Schritte 1.8-1.9 weggelassen wurden.

2. Radiale Wasser-Lauffläche Maze Bau

1. Bore 9 Ausstiegslöcher, groß genug, um 1-1 / 2 Zoll ABS DWV SPG x SJ Trap Adapter, in gleichen Intervallen um den Umfang einer 32 Zoll Durchmesser galvanisierten Stahlwanne unterzubringen. Zentrieren Sie diese Austrittslöcher etwa 2-1 / 4 Zoll über dem Boden der Wanne.
2. Setzen Sie einen 1-1 / 2 Zoll ABS DWV SPG x SJ Fangadapter in jede der Austrittslöcher und sichern Sie mit den mitgelieferten Ringmuttern.
3. Mit Gummistopfen, Kappe acht der neun Ausgänge aus dem Äußeren des Gerätes. Die endgültige, unbeschlossene Ausfahrt dient als Fluchtweg. Es spielt keine Rolle, welcher Ausgang als Fluchtweg bezeichnet wird.
4. Befestigen Sie ein 90 ° ABSEllenbogen zum äußeren Ende des verbleibenden Ausstiegs. Die 90 ° -Biegung dient dazu, die Versuchspersonen daran zu hindern, den richtigen Fluchtweg aus dem Inneren des Labyrinths visuell zu bestimmen.
5. Konstruieren Sie die Fluchtkiste aus jeder opaken Box, die in der Lage ist, saniert zu werden und ungefähr 30 cm x 15 cm x 15 cm groß zu sein. Schneiden Sie ein Loch auf der Seite der Box, direkt über dem Boden, groß genug, um die 90 ° ABS Ellenbogen unterzubringen.
6. Bringen Sie den Fluchtkasten an der Klemmende des 90 ° ABS Ellenbogens an.
7. Ziehen Sie den Fluchtkasten (weniger als einen Zoll) über die Oberfläche des Bodens. Dies ermöglicht genügend Platz für ein elektrisches Heizkissen oder eine andere Heizquelle, die unter dem Fluchtkasten platziert werden soll.
8. Drucken und Laminieren mindestens 5 einzigartige, visuelle Hinweise. Verwenden Sie einfache, kontrastreiche Bilder, die man leicht aus dem Gerät heraus erkennen kann. Schwarz-Weiß-Clipart-Formen (Dreieck, Quadrat, Kreis) werden empfohlen.
9. Mit Magneten, haften die visuellen Hinweise auf die Innenwände derGerät. Cues sollten ungefähr gleich weit entfernt sein, um den Umfang des Gerätes herum.

3. Radiales Wasser-Laufflächen-Labyrinth-Protokoll

HINWEIS: Wasser-Labyrinth-Tests sollten erst beginnen, nachdem die chirurgische Stelle geheilt wurde (etwa eine Woche nach der Operation).

1. Vorbereitung zum Testen.
   1. Lassen Sie Mäuse mindestens 30 Minuten vor dem Testen auf den Prüfraum einwirken.
   2. Das Gerät mit einem 70% igen Ethanol-Spray reinigen.
   3. Füllen Sie das Gerät mit ca. 1 Zoll kaltes (12-14 ° C) Wasser.
   4. Legen Sie einen elektrischen Heizkissen oder eine andere Heizquelle direkt unter die Fluchtbox. Halten Sie die Fluchtbox dunkel und warm während der Dauer der Prüfung.
   5. Positionieren Sie eine helle Lichtquelle über das Gerät.
      HINWEIS: Wenn Sie eine Lampe verwenden, die für die Forschung von Tieren aus dem Gerät selbst sichtbar ist, achten Sie darauf, dass die Lampe in der gleichen Position platziert wirdJeden Tag. Die Lampe selbst könnte ein weiteres visuelles Stichwort für die Mäuse darstellen, um die Fluchtkiste zu finden und sie drastisch von Tag zu Tag zu bewegen, könnte die Ergebnisse komplizieren.
2. Testprotokoll
   1. Entfernen Sie die Maus aus dem Käfig vorsichtig am Schwanz und legen Sie sie in die Mitte des Gerätes.
   2. Sobald das Tier im Apparat ist, beginnen Sie mit dem Timing.
   3. Sobald das Tier den richtigen Ausgang gefunden hat und den Escape-Box gefunden / eingegeben hat, stoppen Sie das Timing und notieren Sie die Anzahl der Sekunden, die benötigt werden, um den richtigen Pfad zu finden.
   4. Wenn das Tier versucht, in ein abschließendes Loch zu klettern und nicht spontan wieder in das Labyrinth nach 10 s zurückzukehren, führen Sie das Tier zurück in die Mitte des Labyrinths von Hand.
   5. Wenn das Tier den richtigen Weg zur Fluchtbox innerhalb von 3 min (180 s) nicht findet, schätzt man den Prozeß als Ausfall und notiert als 180 s. Führen Sie das Tier sorgfältig auf den richtigen Weg von Hand.
   6. Erlaube dieMaus, um in der Fluchtbox für eine 1 min zu bleiben, inter-trial Rest.
   7. Sobald die 1 min Ruhe vergangen ist, entfernen Sie das Tier aus dem Fluchtkasten und kehren Sie zu seinem Hauskäfig zurück.
   8. Die Fluchtkiste gründlich abwaschen und mit einem 70% igen Ethanol-Spray ausstoßen, um zu verhindern, dass die Maus mit olfaktorischen Cues den richtigen Fluchtweg findet. Dieser Schritt sollte nicht mehr als ein paar Sekunden dauern.
   9. Bringe die Maus zum Labyrinth für den nächsten Versuch.
   10. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.1-3.2.9, bis die Maus insgesamt drei Versuche abgeschlossen hat, und hat sich entweder dreimal in die Escape-Box gelegt.
   11. Nach der letzten 1 min Rest, die Maus zu seinem Hauskäfig zurückkehren.
   12. Ablassen und ersetzen Sie das Wasser in den Apparat zwischen den Tieren, um eine gleichbleibende Temperatur während der Prüfung zu gewährleisten.
   13. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.1-3.2.12 für jede zu testende Maus.
   14. Am folgenden Tag wiederholen Sie die Vorbereitungsschritte 3.2.1-3.2.5. Achten Sie besonders darauf, dass visuelle Hinweise bleibenIn konsequenten Positionen zwischen Testtagen.
   15. Testen Sie die Tiere mit dem obigen täglichen Testprotokoll für drei Versuche pro Tag für vier Tage (Trainingsphase), mit einem endgültigen Drei-Test-Test für Speicher-Retention am fünften Tag. Ein sechster Drei-Test-Test (Long Term Memory Retention) kann am zweiten Tag gegeben werden.
   16. Führen Sie keine Tests zwischen den Testtagen fünf und zwölf durch.
3. Analyse
   1. Wenn eine Maus das Labyrinth in unter 180 s während einer zwei-tägigen Periode nicht abschließen kann ( dh insgesamt aufeinanderfolgende 6 Versuche, die alle auf 180 s gezählt wurden), betrachten Sie die Maus unzureichend durch die Testbedingungen motiviert und entfernen Sie die Analyse.
   2. Berechnen Sie die mittlere Latenz, um das Labyrinth für jedes Fach durch das Testen des Datums durch Mittelung ihrer drei täglichen Versuche für diesen Tag abzuschließen.
   3. Erhalten Sie Gruppenunterschiede in der Speichererhaltung mit Standard-T-Tests, um Gruppen am fünften Tag Test und Langzeit-Speicher Testdatum zu vergleichen. Wenn mErz als zwei Gruppen verglichen werden, sollte eine einseitige ANOVA, gefolgt von einer angemessenen Post-Hoc-Analyse (wie Tukey-Test), um jede mögliche Bedeutung zu verfolgen, stattdessen verwendet werden.
   4. Erwerben Sie Gruppenunterschiede in der Erfassungsperiode (Tage 1-4) durch wiederholte Messungsanalyse der Varianz.

Results

Das RWT-Labyrinth ( Abbildung 1 ) wurde verwendet, um verletzungsabhängige räumliche Gedächtnisdefizite bei Mäusen zu untersuchen, die zufällig zugeordnet wurden, um entweder kontrollierte kortikale Schlag-induzierte TBI- oder Sham-Chirurgie zu erhalten. Die Verletzung erfolgte mit einem solenoidgetriebenen kortikalen Aufprall mit einer 3 mm konvexen Spitze und den folgenden Verletzungsparametern: 6 m / s Schlaggeschwindigkeit, 1 mm Eindringtiefe und 200 ms ...

Discussion

Das hier vorgestellte RWT-Labyrinth-Protokoll unterscheidet erfolgreich zwischen CCI-induzierten TBI-Mäusen und Sham-Kontrollen und stellt eine durchführbare, mauszentrische Alternative zum MWM- und Barnes-Kreis-Labyrinth dar. Während die hier gemeldeten Ergebnisse nur über die Verwendung des RWT-Labyrinths in einem TBI-Mausmodell sprechen, wurde dieses Gerät erfolgreich in alten und transgenen Modellen eingesetzt, bei denen eine stressbedingte Nichteinhaltung durch schwimmende Tests mit dem MWM unpraktisch

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 Gal. Feuergetauchte Stahl-Rundwanne	Home Depot	Internet #206638142	Benötigt: 1
1-1/2 Zoll ABS DWV SPG x SJ Trap Adapter	Home Depot	Internet #100344703, Store SKU #188956	Benötigt: 9
1-3/4 Zoll x 1-7/16 Zoll Schwarzer Gummistopfen	Home Depot	Internet #100114974 Store SKU #755844	Benötigt: 8
1-1/2 Zoll. ABS DWV 90 Degree Hub x Hub Elbow	Home Depot	Internet #100346663 Store SKU #188603	Benötigt: 1
HDX 10 Gal. Storage Tote	Home Depot	Internet #202523587 Store SKU #258804 Store SO SKU #258804	Benötigt: 1
Impact One Stereotaxic Impactor für CCI	Leica Biosystems	39463920	Benötigt: 1
Vernier Stereotaxic mit manuellem Feinantrieb Stereotaxisches Instrument für Kleintiere	Leica Biosystems	39463001	Benötigt: 1