Methoden und Tipps für die intravenöse Gabe von Adeno-assoziierten Virus an Ratten und Bewertung des zentralen Nervensystems Transduktion

Zusammenfassung

Methoden für eine breit angelegte zentrale Nervensystem gen Lieferung bei der Ratte sind abgedeckt. In diesem Beispiel ist der Zweck, eine Krankheit zu imitieren, die das gesamte Rückenmark betrifft. Die weit verbreitete Transduktion lässt sich ein therapeutisches Protein aus einer einmaligen, periphere Verwaltung an die CNS liefern.

Zusammenfassung

Adeno-assoziierte Virus (AAV) Vektoren sind eine wichtige Reagenz in den Neurowissenschaften für gruppierte regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR), Optogenetik, Cre Lox targeting usw.. Dieses Manuskript soll die Ermittler versuchen expansive zentrale Nervensystem (ZNS) Gentransfer bei der Ratte über Heck Vene Injektion von AAV zu unterstützen. Breit angelegte Ausdruck ist relevant für Bedingungen mit weit verbreiteten Pathologie und einem Rattenmodell ist bedeutend wegen seiner größeren Größe und physiologischen Ähnlichkeiten mit Menschen im Vergleich zu Mäusen. In dieser Beispielanwendung wird eine breit angelegte neuronale Transduktion verwendet, um eine Neurodegenerative Erkrankung zu imitieren, die betrifft das gesamte Rückenmark Amyotrophe Lateralsklerose (ALS). Die effiziente breit angelegte CNS Transduktion einsetzbar auch therapeutische Protein Faktoren in präklinischen Studien zu liefern. Nach einem Intervall von mehreren Wochen nach der Injektion Ausdruck sind die Auswirkungen der Transduktion bewertet. Für ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) Steuerung Vektor wird der Betrag der GLP im Kleinhirn durch ein basic imaging-Programm schnell und zuverlässig geschätzt. Für motor Krankheit Phänotypen, die durch die ALS induziert werden im Zusammenhang mit Protein transactive Antwort DNA-bindendes Protein von 43 kDa (TDP-43), sind die Defizite von Flucht-Reflex und Rotarod erzielte. Über Krankheit Modellierung und Gentherapie gibt es vielfältige Anwendungsmöglichkeiten für das breit angelegte gen Zielen hier beschrieben. Die erweiterte Nutzung dieser Methode hilft bei der Beschleunigung in den Neurowissenschaften und Neurogenetik Hypothesentests.

Einleitung

Rekombinantes Adeno-assoziierte Virus (AAV) Vektoren sind unverzichtbare Werkzeuge für die CNS-Forschung, weil sie für transducing Neuronen in-vivo so effizient sind. AAV-Vektoren sind sehr vielseitig für verschiedene transgene und Protein-Isoformen, verschiedenen Geweben, verschiedenen Wirtsarten und verschiedenen Darreichungsformen zu studieren. Zum Beispiel kann AAV verabreicht werden mit Mäusen ein Peripheriegerät, relativ nichtinvasiv, intravenöser Injektion, Neuronen im gesamten ZNS als erstes transduzieren Foust Et Al. und Duque Et Al. beschrieben (siehe Jupiter Papier von Gombash Et Al. (2014)). ^{1 , 2 , 3} dieser gen Lieferung Ansatz wird verwendet bei Ratten entweder grünes fluoreszierendes Protein (GFP) effizient zum Ausdruck bringen oder die ALS im Zusammenhang mit Protein, transactive Antwort DNA-bindendes Protein von 43 kDa (TDP-43) im ZNS. ^{4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9} arbeiten bei Ratten ist bedeutsam, weil die Ratte physiologische und metabolische Parameter für den Menschen im Vergleich zu Mäusen näher sind und es Verhaltens- und toxikologische Tests, die speziell für die Ratten gibt. Weiterhin mehr transgene Ratte Linien sind immer verfügbar, die in AAV gen Übertragung Studien genutzt werden.

Methoden sind für expansive CNS Gentransfer in die Ratte und schnelle, zuverlässige Quantifizierung der Ergebnisse detailliert. Breit angelegte CNS Transduktion wird verwendet, um die Symptomatik Alsen in Ratten zu imitieren, TDP-43 in das Rückenmark zum Ausdruck zu bringen. Die Methode ist Tail Vene Injektionen von TDP-43 Vektor zu jungen Erwachsenen Ratten wie in Jackson Et al. ^{6 , 8 , 9} nach mehreren Wochen, TDP-43-induzierte motorische Defizite werden erzielt durch zwei Methoden: entkommen, Reflex und Rotarod wie in Dayton Et Al. und Jackson Et Al. ^{5 , 6 , 7 , 9} für Kontrolle GFP Vektor, in Post-Mortem-Analyse ist die fluoreszierende Fläche des Kleinhirns als Index der Transduktion Effizienz wie bei Jackson Et Al. berechnet ^{6 , 8} die Analyse des Kleinhirns erweist sich eine schnelle und zuverlässige Index für den Grad der CNS Transduktion nach peripheren gen Lieferung und auf eine Vielzahl von Ansätzen versucht peripher-zentrale Gentransfer anwendbar sein sollte.

Protokoll

alle Verfahren der entsprechenden NIH-Richtlinien befolgt. Alle Verfahren gefolgt Tier Protokolle, die von der Animal Care and Use Committee an LSU Health Sciences Center in Shreveport genehmigt wurden. Weibliche Sprague-Dawley Ratten im Alter von 6 Wochen für dieses Verfahren verwendet wurden.

1. bestimmen die Dosen/Mengen des Vektors benötigt

1. wiegen die Ratten injiziert werden und bestimmen die Höhe der viralen Vektoren benötigt für jedes Tier der Titer (Konzentration) der Vektor-Vorbereitung anhand. Verwenden Sie Vektor-Dosen, die zuvor für effiziente Ausdruck bei der Ratte CNS erfolgreich gewesen (siehe Jackson Et Al. ⁶).
   Hinweis: für AAV9 TDP-43 oder AAV9 GFP, eine typische Dosis beträgt 3 x 10 ¹³ - 1 x 10 ¹⁴ Vektor Genomen/kg. Die jungen Erwachsenen Ratten im Alter von 6 Wochen wiegen ca. 150 g.
2. Stellen entsprechende Dosen pro kg bei allen Tieren für systematische Vergleiche. Stellen Sie sicher, dass die Lautstärke nicht standard beraten Einspritzmengen (250-500 µL für eine 250 g-Ratte) überschreitet. Eine typische Injektionsvolumen ist 200 μl zu einem jungen Erwachsenen Ratte.

2. Arbeitsplatz vorbereiten

1. alle erforderlichen Vorräte: Paraffin Film quadratisch (ca. 5 x 5 cm) pro Tier, einem Alkoholtupfer Vorbereitung pro Tier, Gaze-Pads (2-3 pro Tier), Pipettieren Tipps und einer Mikropipette.
2. Bereiten die Arbeitsfläche durch Reinigung der Oberfläche mit 70 % Ethanol. Legen Sie ein Heizkissen nach unten mit der Temperatur (~ 37 ° C) zu niedrig eingestellt. Legen Sie eine Bank-Pad auf der Oberseite des Heizkissens.
3. Bereiten die Gas-Anästhesie (Isofluran). Sorgen Sie für ausreichend Sauerstoff und Gas Narkose für den Eingriff. Reinigen Sie die Induktion Kammer und Anästhesie-Maske mit 70 % Ethanol, und legen Sie die Anästhesie-Maske auf der Bank.

3. Bereiten Sie den Vektor

1. des Vektors bei Zimmertemperatur auftauen, und beschriften Sie eine sterile Microcentrifuge Schlauch für jedes Tier.
2. Pipettieren, das Volumen des AAV bestimmt in, der entsprechenden Röhre 1.1 betreten und bringen das Volumen bis zu der gewünschten Injektionsvolumen (hier: 200 μl) mit gesäugt Ringer ' s Lösung oder Kochsalzlösung.
3. Puls der Probe für 1-2 s Wirbel und dann Puls Zentrifuge für 5 s, die Probe an der Unterseite des Rohres zu bringen.
4. Pipettieren der gesamten Injektionsvolumen für die Ratte aus der Tube und auf den Platz von Paraffin Film.
5. Eine 1 mL Spritze eine 30 Gauge-Nadel aufsetzen.
6. Legen Sie die Nadel mit der Fase nach unten in den Vektor auf dem Paraffin-Film. Ziehen Sie den Kolben der Spritze bis das Virus in die Nadel und Spritze ist. Vermeiden Sie Luftblasen in die Nadel, die mit etwas Übung leichter zeichnen.

4. Bereiten Sie die Ratte

1. schalten Sie den Sauerstoff bis zu 1 L/min und die Isofluran-Narkose auf 5 % festgelegt. Sicherzustellen, dass die Gas-Anästhesie zur Induktion Kammer fließt durch Überprüfung aller Anschluss-Schläuche und Absperrhahn Orientierungen.
2. Legen Sie die Ratte in Anästhesie Induktion Gaskammer ca. 3 min, bis die Ratte reagiert.
3. Gewährleisten ausreichende Tiefe der Narkose durch Kneifen der Zehs. Es darf keine Bewegung in den Fuß oder das Bein nach der Zehe Prise.
4. Reduzieren die Isofluran-Narkose auf 2 % für die Wartung der Anästhesie und der Hahn so einstellen, dass die Narkose, Anästhesie-Maske fließt.
5. Legen Sie die Ratte ' s Nase in der Anästhesie-Maske und die Ratte so einstellen, dass es auf der Seite liegenden ist.
6. Identifizieren die seitlichen Schweif Vene.
   Hinweis: Die seitlichen Schweif Venen liegen bei ca. 10 und 2 o ' Uhr mit der dorsalen Spitze der Rute als 12 o ' Uhr. Mit der Ratte liegend, sollten die seitlichen Schweif Vene up zugewandt sein
7. Wischen Sie die Injektion Fläche mit Vorbereitung Alkoholtupfer. Die Injektionsstelle beträgt 2 / 3 über die gesamte Länge der Rute.

5. Injizieren den Vektor

1. fest zu halten die Rute leicht oberhalb des Bereichs der Injektion mit einem Finger direkt über die seitlichen Schweif Vene; dies wird die Vene erweitern.
2. Mit der Fase nach oben, die Nadel mit der sichtbaren Schweif Vene in die gleiche Richtung ausrichten.
3. Durchbohren die Haut über die Rute Vene und die tolle Betreuung auf der anderen Seite hält die Rute und drücken auf die Rute Vene zu vermeiden.
4. Druck von der Rute Vene für normale Blutfluss ermöglichen.
5. Bewegen Sie die Nadel in die Vene. Um sicherzustellen, dass die Nadel die Rute Vene durchstochen hat, ziehen Sie leicht am Kolben. Wenn die Nadel in die Vene ist, strömt Blut in die Nadel.
   1. Neu positionieren der Nadel nach Bedarf. Dann, um die Nadel zu stabilisieren, bewegen Sie die Hand oberhalb der Injektionsstelle, unterhalb der Einstichstelle und halten Sie das Ende der Spritze gegen das Heck.
6. Langsam injizieren den Vektor in das Heck (ca. 20 µL/s).
   Hinweis: Die Vene verlieren Farbe als der Vektor durchströmt. Anzeichen dafür, dass die Lösung außerhalb der Vene injiziert wurde gehören Blebbing, Bleichen der Haut, oder der Widerstand beim Einspritzen des Vektors. Mit etwas Übung extra vaskuläre Belastung minimiert werden.
7. Nachdem der Vektor verabreicht wurde, entfernen Sie die Nadel aus der Ratte und drücken Sie einem Tupfer gegen die Injektionsstelle zur Eindämmung der Blutung für 30-60 s.

6. Sanierung

1. schalten Sie die Isoflurane Narkose und Sauerstoff. Die Ratte zu überwachen, bis er das Bewusstsein wiedererlangt, und wieder in seinen Käfig.
2. Legen Sie vorsichtig alle Nadeln in die Scharfbehälter. Entsorgen Sie alle anderen Einweg-Materialien, die in einen entsprechenden Biohazard Behälter mit AAV potenziell kontaminiert sind. Reinigen Sie die Arbeitsstationen mit 70 % igem Ethanol.

7. Bewerten Megalosauridae Flucht-Reflex

Hinweis: Megalosauridae Defizite entstehen in der Regel 2-6 Wochen nach TDP-43 Gentransfer, abhängig von der Dosis der Vektor.

1. Auf eine flache Oberfläche frei von Schutt mit zwei Fingern greifen die Ratte ' s Heck ca. 2 cm aus dem Körper. Heben Sie vorsichtig die Ratte, bis die Vorderbeine beim Betrachten der ventralen Unterseite der Ratte hängen.
   1. Ausführen der Prozedur wöchentlich im experimentellen Zeit-Verlauf nach Gentransfer (z. B. bis zu 12 Wochen nach Gentransfer).
      Hinweis: Gäste auch Vordergliedmaße Defizite auf diese Weise, aber Megalosauridae Defizite sind wahrscheinlicher, in diesem Modell, je nach der verwendeten Vektor-Dosis.
2. Der Hintergliedmaßen für 10 S. Hinweis zu beobachten, wenn eine oder beide Hinterbeine in Richtung der Mittellinie 10 Ballen s.
Wiederholen Sie diesen Test für insgesamt drei Mal mit 30
3. s zwischen Studien. Wenn eines oder beide Hinterbeine für jede der drei Studien geballt sind, zeigt die Ratte motorische Störungen. Notieren Sie die Daten (manuell in Noten) als entweder ein- oder beidseitig Megalosauridae Defizit vorhanden, wenn es stimmt, dass Pressen in allen drei Studien.

8. Bewerten Motorik auf die Rotarod

1. zum Einrichten der Rotarod, legen Sie eine Bank-Pad unter den Rotarod und Beschleunigung auf 4-40 Umdrehungen pro Minute (u/min) über 2 min (die Rate steigt von ~0.3 u/min/s). Für einen 12-Wochen-Zeit-Kurs, laufen die Fächer mit 2, 4, 8 und 12 Wochen nach gen übertragen.
2. Ermöglichen die Ratte zu akklimatisieren, um den Prüfraum für 20 min.
3. , Die Ratte die Rotarod zum ersten Mal verwenden, zuerst beginnen die Rotarod mit einer eingestellten Geschwindigkeit von 4 u/min und dann legen Sie die Ratte auf die Rotarod zu trainieren. Lassen Sie die Ratte zu gehen für eine volle Umdrehung 4 u/min, dann beginnen die Beschleunigung und ermöglichen Sie die Ratte zu Fuß auf den Rotarod, bis es fällt ab. Training fortsetzen, bis die Ratte konsequent für mindestens 40 Fuß s. Eine gesunde, junge Erwachsene Ratte wird leicht auf diese Weise trainiert werden.
   1. Im Falle einer Ratte mit einer spürbaren motorischen Beeinträchtigungen, die kann verhindern, dass der Ratte erreichen eine Basislinie Latenz von 40 fallen s, bieten der Ratte 3-5 Ausbildung Versuche vor Beginn erzielte Rotarod.
4. Um Rotarod testen zu beginnen, legen Sie die Ratte auf die Rotarod und Beschleunigung der Rotarod beginnen. Notieren Sie die Zeit, an der die Ratte aus der Rotarod fällt; Dies ist die Latenz zu fallen. Bleibt die Ratte auf die Rotarod nach 120 s, Kappe die Sitzung an diesem Punkt, entfernen Sie die Ratte aus der Rotarod und aufzeichnen eine Herbst-Latenz von 120 s.
5. Wiederholen Sie die Prüfung zweimal für eine Gesamtmenge von drei Studien. Um die Auswirkungen von Müdigkeit zu minimieren, Raum der Prüfungen mindestens 5 min auseinander. Die Ergebnisse der drei Studien im Durchschnitt. Eine ungestörte Erwachsenen Ratte hat in der Regel eine durchschnittliche Wartezeit von fallen > 40 s.
6. Legen Sie die Ratte zurück in den Käfig, und reinigen Sie die Rotarod und Umgebung mit 70 % Ethanol.

9. Quantifizierung der GFP Expression im Kleinhirn

1. die Ratten zu betäuben und mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und dann 4 % Paraformaldehyd durchspülen. Sezieren Sie das Gehirn und das Rückenmark zu und Einweichen Sie Gewebe in das Fixiermittel über Nacht und verschieben Sie sie dann in eine 30 % ige Saccharose-Lösung. Nach Gleichgewichtherstellung, geschnitten 50 μm koronalen Abschnitte auf einer verschiebbaren Mikrotom mit dem Einfrieren der Stufe ^{4 , 5 , 6}.
2. Wählen Sie 3-6 Abschnitte des Kleinhirns, die gleichmäßig verteilt sind in der Vermis, der zentralen Lappen des Kleinhirns. Eindringmittel Label der GFP, das Signal zu maximieren. Den primäre Antikörper für GFP bei 1: 500 und verwenden die Alexa-488-konjugierten Sekundärantikörper bei einer Verdünnung von 1: 300 ^{4 , 5 , 6}.
   Hinweis: Siehe Referenzen ^{4 , 5 , 6} für weitere Einzelheiten über die Probenahme, schneiden und färben Verfahren.
3. Photomicrograph mit geringer Vergrößerung Objektiv mit einem Mikroskop jeden Abschnitt in der definierten Region von Interesse. Verwendung einer 2,5 X Objektiv (N.A 0,12) und Filter set 10, 450-490/515-565 Erregung/Emission). Halten Sie die Kameraeinstellungen (Belichtungszeiten, z. B. 2 s) das gleiche über Proben analysiert werden. Speichern als ein. TIF-Datei.
4. Öffnen der Mikrophotographie in der weithin verfügbar Scion Bildprogramm; zwei Fenster öffnet sich. In der Nähe des Fensters angegeben als " indizierte Farbe ".
5. Wählen " Optionen ", dann " Dichte SliceŔ eine Palette von Schattierungen in rot im Fenster Look-Up Table (LUT) angegeben werden wird. Verwenden Sie den Cursor im Fenster, die spezifische GFP Kennzeichnung nur ausfüllen und aufhören, wenn die unspezifischen Hintergrund beginnt im Bild abgeholt werden.
   Hinweis: Damit wird die fluoreszierenden Bereich auf der Mikrophotographie quantifiziert werden markiert. Die Einstellungen sollten optimiert werden, um speziell alle sichtbar fluoreszierenden Zellen zu erfassen. Mit etwas Übung kann diese Methode genau die spezifischen Fluoreszenz hervorheben.
6. Vor der Messung fluoreszierende Bereich zunächst sicherstellen, dass die Messungen in die richtigen Einheiten (Pixel) sind. Um dies tun, klicken Sie " Analyse ", dann " Set ScaleŔ die vierte Zeile sollte sagen " Einheiten ". Wählen Sie aus der Dropdown-Liste, Pixel, gemessen in Pixel ein, und klicken Sie dann auf " OK ". Umschalten der Analysemöglichkeiten zu " gehören innere Löcher " um die Einbeziehung der gesamten Zellkörper in der Analyse zu gewährleisten.
Klicken Sie
7. um die fluoreszierende Fläche messen " Analyse " und klicken Sie dann auf " Maßnahme ". Um diesen Wert anzuzeigen, klicken Sie " Analyze " klicken Sie dann auf " zeigen ResultsŔ ein Fenster wird angezeigt. Die fluoreszierende Flächenmessung werden unter der Überschrift mit der Bezeichnung " Bereich ".
8. Um Standardisierung innerhalb der Messungen zu gewährleisten, ändern nicht die hervorgehobenen Werte im Fenster LUT.
9. Wenn alle Messungen aufgezeichnet wurden, Durchschnittswerte für jedes Tier (von 3-6 Teile pro Tier). Verwenden Sie einen geeigneten statistischen Test, um transduced Bereiche zwischen den Gruppen zu vergleichen. ⁶

Ergebnisse

TDP-43 induzierte motorische Beeinträchtigungen treten innerhalb von 2-6 Wochen abhängig von der Dosis der AAV TDP-43 verwendet (Abbildung 1). Erfolglose Schweif Vene Injektionen führen teilweise oder keine Beeinträchtigungen; die AAV muss in die Blutbahn um den Effekt zu produzieren gelangen. Eine erfolgreiche Injektion von AAV GFP führt GLP Ausdruck im gesamten Gehirn und Rückenmark in gewissem Vektor-Dosis abhängig. Bei der Verwendung der starken rekombina...

Diskussion

Eine Vielzahl von Touren für AAV-Vektoren wurden getestet: Intra-Parenchym, Intra-Cerebroventricular, Intra-thecal, intravenöse, intranasale, intramuskulären, etc.. Jede Route kann sowohl vor-als auch Nachteile haben. Heckrotorblätter Vene Verabreichung von AAV an erwachsenen Ratten ist eine zuverlässige Methode zur Erreichung konsistente Transduktion des ZNS. Die peripheren Injektionsverfahren vermeidet die Einführung einer Injektionskanüle in der CNS-Gewebe und ist daher minimal invasiv. Die effiziente CNS-Ausdruck, de...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Scale	Pelouze	SP5
Nalgene Eimer	Thermo Scientific	12014000	4000 mL
Mikrozentrifugenröhrchen	USA Scientific	1615-5500
Laktierte Ringer's Solution	Baxter Healthcare	0338-0114-04
Mini-Vortexer	Fisher Scientific	128101
Zentrifuge	Eppendorf	22624415
Laborfilm	Bemis	PM996
1-mL Spritze	BD	309626	Kommt mit einer 25g Nadel befestigt. Ersetzen durch 27-30g Nadel für die Injektion
30g Nadel	BD	305106
Isofluran	Piramal Healthcare	66794-013-25	Isofluran USP 250 mL
Anästhesiemaske	Kopf Instruments	906
Gauze	Henry Schein	100-2524	2" x 2" (5cm x 5cm)
Pipettenspitzen	USA Scientific	1111-0816
Mikropipette	Gilson	4642080
Gasanästhesie-Vaporizer	SurgiVet	4214322	Classic T3
Gasanästhesie-Vaporizer	SurgiVet	32373B10	Enviro-PURE
Heizkissen	Sears	17280
Bankpad	VWR	56617-006
Rotarod	Panlab/Harvard Apparatus	76-0772	4 Ratten/ 4 Mäuse
70% Ethanol	Decon Laboratories, Inc.	2401	140 proof
70% Isopropanol	VWR	89108-160
Scion Image	Scion Corporation
GFP Tag Polyklonaler Antikörper	Invitrogen	A11122	Primärer Antikörper - 1:500 Verdünnung
AlexaFluor 488	Invitrogen	A11070	Sekundärer Antikörper - 1:300 Verdünnung
Axioskop 40 Mikroskop	Zeiss