Methodenartikel

Quantitative Lokalisierung eines Golgi-Proteins von Imaging Center der Fluoreszenz Masse

DOI:

10.3791/55996

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10. August 2017

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1School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, 2Bioinformatics Institute, 3School of Computing, National University of Singapore

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die präzise Lokalisierung der Golgi-Bewohner ist wesentlich für das Verständnis der zellulären Funktionen der Golgi. Konventionelle Lichtmikroskopie ist jedoch nicht in der Lage, die Sub-Golgi-Struktur zu lösen. Hier beschreiben wir das Protokoll für eine konventionellen Mikroskopie basierte Höchstauflösung Methode, um die Sub-Golgi Lokalisation eines Proteins quantitativ zu bestimmen.

Zusammenfassung

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Der Golgi-Komplex besteht aus seriell gestapelten Membran Cisternen, die in Sub-Golgi Regionen, einschließlich der GUS-Staatenweiter kategorisiert werden können-Golgi, Medial-Golgi, Trans-Golgi und Trans-Golgi-Netzwerk. Zellfunktionen der Golgi werden durch die charakteristische Verteilung der ansässigen Proteine bestimmt. Die räumliche Auflösung der konventionellen Lichtmikroskopie ist zu niedrig um Sub-Golgi Struktur oder Cisternen zu lösen. So ist Immuno-Gold-Elektronen-Mikroskopie eine Methode der Wahl, ein Protein auf der Sub-Golgi-Ebene zu lokalisieren. Das Instrument und Technik sind jedoch darüber hinaus die Möglichkeit, die meisten Zelle Biologie Labors. Hier beschreiben wir unsere neu entwickelte Höchstauflösung Methode namens Golgi Protein Lokalisierung von imaging Center der Masse (GLIM), systematisch und quantitativ ein Golgi-Protein zu lokalisieren. GLIM basiert auf standard Fluoreszenz Kennzeichnung Protokolle und konventionellen Weitfeld- oder konfokale Mikroskope. Es geht um die Kalibrierung der chromatischen Verschiebung Aberration des mikroskopischen Systems, die Bildaufnahme und die Analyse nach der Übernahme. Die Sub-Golgi Lokalisierung eines Test-Proteins wird quantitativ die Lokalisierung Quotienten ausgedrückt. Es gibt vier Hauptvorteile von GLIM; Es ist schnell, bezogen auf konventionelle Methoden und Werkzeuge, das Ergebnis der Lokalisierung ist quantitativ und es bietet ~ 30 nm praktische Auflösung entlang der Golgi-Achse. Hier beschreiben wir das ausführliche Protokoll der GLIM einenTest Golgi Protein zu lokalisieren.

Einleitung

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Der Golgi-Komplex spielt entscheidende Rolle sekretorischen/endocytic Handel von Proteinen und Lipiden (im folgenden Ladungen) in Säugerzellen1,2,3. Bei der Golgi sind Ladungen nicht nur auf verschiedenen subzellulären Fächer sortiert sondern auch durch verschiedene Arten der Glykosylierung modifiziert. Der Säugetier-Golgi-Komplex umfasst zahlreiche seitlich angeschlossene Golgi-Stapel, die besteht in der Regel von 4-11 eng benachbarte und flache Membran Säcken genannt Cisternen. Seriell gestapelten Golgi-Cisternen werden weiter kategorisiert, von einem Ende zum anderen, als ....

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Protokoll

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Hinweis: Im folgenden ist ein Schritt für Schritt Protokoll von GLIM zur Bestimmung der LQ EGFP-Tags Tyrosylprotein Sulfotransferase 1 (TPST1), ein Golgi-resident-Enzym in HeLa-Zellen.

1. Vorbereitung der Fluoreszenz-markierten Golgi Mini-stacks

  1. Glasdeckgläser vorbereiten
    1. Aliquoten 0,3 mL sterile Dulbecco geändert Adlers Medium (DMEM) zu einem Brunnen von einer 24-Well-Platte in einer Gewebekultur-Haube.
    2. Wischen Sie ein Stück Φ 12 mm No.1.5 Glas Deckglas mit weichem Tissue-Papier getupft mit 70 % Ethanol, um Ablagerungen auf der Oberfläche von Glas-Deckglas zu entfernen. Verwenden Sie ein paa....

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Ergebnisse

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Die moderne Forschung Grade Lichtmikroskop ausgestattet mit einem Plan apochromatische Objektiv, wie verwendet in unserem Labor zeigt minimale chromatische Aberration (Abbildung 2A). Eine sorgfältige Prüfung der fluoreszierenden Perlen Multi-Color-Bild zeigen jedoch die Verlagerung der verschiedenen farbige Bilder von der gleichen Wulst (Abbildung 2B). Wir definieren, dass der rote Kanal frei von.......

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Diskussion

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Die Lokalisation eines Proteins Golgi unter der Lichtmikroskopie war bisher vor allem durch den Grad der Korrelation oder Überlappung des Bildes des Proteins mit dem Bild einer Golgi-Markierung von bekannten Lokalisierung15,16quantifiziert, 17. Resultierende Korrelation oder überlappende Koeffizient spiegelt wider, wie nah das Test-Protein die Golgi-Marker räumlich ist. Es gibt mindestens drei Einschränkungen für diesen Ansatz........

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Danksagungen

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Wir möchten D. Stephens (University of Bristol, Bristol, Vereinigtes Königreich) für die TPST1-EGFP DNA Plasmid, Lakshmi Narasimhan Govindarajan Danke für die Hilfe bei der Software-Optimierung. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Medical Research Council (NMRC/CBRG/007/2012), Ministerium für Bildung (AcRF Tier1 RG 18/11, RG 48/13 und RG132/15 und AcRF Tier2 MOE2015-T2-2-073), l.l.

....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Fluoreszenzkugeln. Handelsname: TetraSpeck BeadsInvitrogenT7279Als mehrfarbige Perlen zur Kalibrierung der chromatischen Verschiebung des Mikroskops
Glass coverslip & Phi; 12 mm (Nr. 1,5)MenzelCB00120RAC
Glass coverslip & Phi; 25 mm (Nr. 1,5)Menzel
DMEMCapriconDMEM-HPA-P50
Trypsin-EDTA
FBSGE HycloneSV30160.03
NocodazolMerck487928
Transfektionsreagenz. Handelsname: Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019
Transfektionsmedium. Handelsname: OptiMEMInvitrogen31985070
TPST1-EGFPAddgene66617Ein Geschenk von D. Stephens (University of Bristol, Bristol, Vereinigtes Königreich)
GalT-mCherryHergestellt in unserem Labor
ParaformaldehydMerck1.04005.1000
SaponinSigma-Aldrich47036
Poly (Vinylalkohol) (MW ~31.000). Handelsname: Mowiol-488CALBIOCHEM475904
BSASigma-AldrichA9647
Maus Anti-GM130BD Biosciences610823Primärer Antikörper gegen menschliches GM130
Weit-rote Fluoreszenz-konjugierte Ziegen-Anti-Maus-IgG. Handelsname: Alexa Fluor 647 konjugierte Ziegen-Anti-Maus-IgGInvitrogenA-21235Fernrote Fluoreszenz konjugierte sekundäre Antikörper

Referenzen

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  1. Glick, B. S., Luini, A. Models for Golgi traffic: a critical assessment. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005215(2011).
  2. Klumperman, J. Architecture of the mammalian Golgi. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).
  3. Lu, L., Hong, W.

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Schlagwörter

Lokalisierung von Golgi ProteinenGLIM MethodeFluoreszenzbildgebungchromatische Shift KorrekturMassenschwerpunktanalyseGolgi Mini StacksLokalisationsquotientWeitfeldmikroskopieKonfokalmikroskopieProtokoll zur Bildanalyse

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