Wir zeigen eine Methode, um mehrere Moleküle innerhalb heterogener Nanostrukturen bei Einzelmolekülgenauigkeit unter Verwendung sequentieller Bindung und Elution von fluoreszenzmarkierten Antikörpern abzubilden.
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Methodenartikel
Hochmultiplexed, Super-Auflösung Bildgebung von T-Zellen mit madSTORM
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Imaging heterogener zellulärer Strukturen unter Verwendung einer Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie wurde durch unzureichende Lokalisierungsgenauigkeit und Multiplexfähigkeit behindert. Unter Verwendung von fluoreszierenden Nano-Diamant-Markierungsmarkern beschreiben wir die Driftkorrektur- und Ausrichtungsverfahren, die erforderlich sind, um eine hohe Präzision in der Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie zu erhalten. Zusätzlich wird eine neue Multiplex-Strategie, madSTORM, beschrieben, bei der mehrere Moleküle in der gleichen Zelle mit sequentieller Bindung und Elution von fluoreszierenden Antikörpern gerichtet werden. MadSTORM wird auf einer aktivierten T-Zelle demonstriert, um die Orte verschiedener Komponenten innerhalb einer membrangebundenen, Multi-Protein-Struktur, die so genannte T-Zell-Rezeptor-Mikrocluster, zu visualisieren. Darüber hinaus wird die Anwendung von madSTORM als allgemeines Werkzeug zur Visualisierung von Multi-Protein-Strukturen diskutiert.
Einleitung
Es wurde eine Vielzahl von Super-Auflösungs-Mikroskopietechniken entwickelt, um die Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie (~ 200 nm) zu überwinden. Darunter befindet sich eine Kategorie von Techniken, die als Singlemolekül-Lokalisierungsmikroskopie (SMLM) bezeichnet werden, die eine Photoaktivierungslokalisierungsmikroskopie (PALM) und eine stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) umfasst. SMLM-Techniken teilen sich bei der Verwendung von Fluorophoren, die zwischen auf (fluoreszierenden) und aus (dunkel / foto geschalteten) Zuständen umgeschaltet werden können, was eine sequentielle Lokalisierung der Fluoreszenz von einzelnen Molekülen
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Protokoll
Achtung: Bitte konsultieren Sie vor dem Gebrauch alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS). Mehrere der in diesem Protokoll verwendeten Chemikalien sind toxisch und krebserregend. Bitte wenden Sie bei der Durchführung des Protokolls alle geeigneten Sicherheitshinweise an, einschließlich des Einsatzes von Ingenieurkontrollen (Dunstabzugshaube, Handschuhfach) und persönlicher Schutzausrüstung (Schutzbrille, Handschuhe, Laborkittel, Volllängenhose, Zeltschuhe).
1. Multiplexed Imaging von aktivierten T-Zellen
- Direkt konjugierte Antikörper mit Alexa-647 (A647) -Farbstoff unter Verwendung des Alexa 647 Antikörper-Markierungskits....
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Ergebnisse
Das sequentielle Elutions- und Färbeverfahren wurde verwendet, um das gemultiplexte madSTORM-Bild von Mikroclustern und anderen Strukturen in einer aktivierten Jurkat-T-Zelle zu erzeugen ( Fig. 1 , Kontrollfigur-Ausrichtungen). Jedes pseudofarbige Bild repräsentiert eine Runde der madSTORM-Bildgebung, die in den Schritten 1.1.1 bis 1.3.13 erworben wurde. Wie zuvor beschrieben, sollte das Sichtfeld auf Restsignal von vorherigem, nicht-eluiertem Antikörper übe.......
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Diskussion
Die sequentielle Multiplex-, Driftkorrektur- und Ausrichtungsprozeduren in madSTORM ermöglichen eine präzise, hochmultiplexierte Visualisierung heterogener Strukturen in Zellen. 10 Darüber hinaus vermeidet madSTORM die Einschränkungen von mehrfarbigem STORM wie chromatische Aberration und suboptimale Photoscharter / Emissionseigenschaften von nicht-fernen roten Farbstoffen 9 , 12 . Da der Elutionsschritt die sterische Interferenz von se.......
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Offenlegungen
Wir haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Wir danken Xufeng Wu für den Zugang zum STORM-Mikroskop. Diese Forschung wurde durch das Intramurale Forschungsprogramm des National Cancer Institute (NCI) Centre for Cancer Research und des National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 8-Well-Deckglaskammer | Lab-tek | 155409 | |
| 0,1 % Poly-L-Lysin-Lösung | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| NV-100 nm Fluoreszierender Nano-Diamant | Adamas | Red FND | |
| anti-CD3ε Antikörper | BD Biosciences | 555329 | |
| Rinderserumalbumin, Fraktion V | KSE | Scientific 98-100P | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 10% Paraformaldehyd | EMS | 15712 | Karzinogene |
| Gelatine aus Süßwasserfischhaut | Sigma-Aldrich | G7041 | |
| Alexa 647 Antikörpermarkierungskit | Thermo Fisher | A20186 | |
| Magnesiumchlorid-Hexahydrat | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| ROHRE | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7154 | Hochgiftiges, luftempfindliches |
| Cysteamin | Sigma-Aldrich | 30070 | Hochgiftiges |
| Cyclooctatetraen 98% | Sigma-Aldrich | 138924 | Hochgiftiges, luftempfindliches |
| 10x PBS | KD Medizin | RGF-3210 | |
| 10x TBS | KD Medizin | RGF-3385 |
Referenzen
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
