Summary
Hier beschrijven we een innovatieve methode om complementaire receptor 1 (CR1) lengte polymorfismen te bepalen voor gebruik bij verschillende toepassingen, met name de beoordeling van de gevoeligheid voor ziekten zoals de ziekte van Alzheimer (AD). Deze methode kan nuttig zijn om de rol van CR1-isoformen beter te begrijpen bij de pathogenese van AD.
Abstract
Complementreceptor 1 (CR1), een transmembrane glycoproteïne dat een sleutelrol speelt in het aangeboren immuunsysteem, wordt uitgedrukt op vele celtypen, maar vooral op rode bloedcellen (RBC's). Als een receptor voor de complementcomponenten C3b en C4b reguleert CR1 de activatie van de complementcascade en bevordert de fagocytose van immuuncomplexen en cellulaire rommel, evenals het amyloïde-beta (Aβ) peptide in de ziekte van Alzheimer (AD). Verscheidene studies hebben bevestigd AD-geassocieerde single nucleotide polymorphisms (SNPs), evenals een kopie-nummer variatie (CNV) in het CR1 gen. Hier beschrijven we een innovatieve methode om de lengte-polymorfie van de CR1-receptor te bepalen. De receptor omvat drie domeinen, genaamd lange homologe herhalingen (LHR) -LHR-A, LHR-C en LHR-D- en een n-domein, LHR-B, waarbij n een geheel getal is tussen 0 en 3. Met een enkel paar Van specifieke primers, wordt het genetische materiaal gebruikt om een eerste fragment van het LHR-B domein te amplificeren (thE variant amplicon B) en een tweede fragment van het LHR-C domein (het invariant amplicon). De variant amplicon B en het invariant amplicon verschillen verschillen bij vijf nucleotiden buiten de hybridisatie gebieden van de genoemde primers. De aantallen variant ampliconen B en van invariant ampliconen worden afgeleid met behulp van een kwantitatief gereedschap (HRM) krommen) en de verhouding van het variant amplicon B naar het invariant amplicon verschilt volgens het CR1 lengte polymorfisme. Deze methode biedt meerdere voordelen ten opzichte van de canonische fenotype methode, omdat het geen nieuw materiaal nodig heeft en is goedkoper, sneller en derhalve van toepassing op grotere populaties. Zo zou het gebruik van deze methode nuttig moeten zijn om de rol van CR1-isoformen beter te begrijpen bij de pathogenese van ziekten zoals AD.
Introduction
AD, de meest voorkomende oorzaak van dementie, treft meer dan 30 miljoen mensen over de hele wereld en is een belangrijk probleem in de volksgezondheid 1 . Klinisch wordt AD gekenmerkt door neurocognitieve stoornissen die leiden tot een progressief verlies van autonomie 2 . AD wordt gekenmerkt door twee neuropathologische kenmerken, namelijk extracellulaire amyloïde afzettingen en intracellulaire neurofibrillair tangles 3 .
Traditioneel, volgens de leeftijd van het ontstaan van de ziekte, is AD ingedeeld in twee vormen. Ten eerste is het vroege begin AD (EOAD), waar het meest voorkomt voor 65 jaar; Dit formulier staat voor minder dan 5% van de AD gevallen. Het is een zeldzame autosomale dominante vorm van AD, die resulteert in volledig penetrerende mutaties, ook in het amyloïde precursor eiwit ( APP) 4 , preseniline 1 ( PSEN1 ) 5 of preseniline 2 ( PSEN2 )> 6 genen. Ten tweede, de meest voorkomende vorm van de ziekte (> 90% van de AD-gevallen) heet "sporadische" late onset AD (LOAD) en komt meestal voor bij personen van 65 jaar of ouder. Het komt voort uit meerdere genetische en milieu-risicofactoren 7 . Bij LOAD is de 4 allele van het apolipoproteïne E ( APOE ) gen de belangrijkste genetische risicofactor 8 , 9 . Bovendien zijn meer dan 20 gen loci geïdentificeerd door genoom-wide associatiestudies (GWAS) als geassocieerd met het risico van AD, waarvan één het complementcomponent (3b / 4b) receptor 1 ( CR1 ) gen 10 is , dat op Chromosoom 1q32 in een cluster complement-gerelateerde eiwitten. Het CR1 gen codeert voor het complement receptor type 1 (CR1) eiwit, een component van de complement activator regulatoren.
CR1 (de C3b / C4b receptor, CD35), een transmembrane glycoproteïne van ongeveerEly 200 kDa 11 bindt aan de C3b, C4b, C3bi, Clq, mannan-bindende lectine (MBL) en ficolin complement-eiwitten 12 . De biologische functie van CR1 varieert met de celtypen waarin het wordt uitgedrukt. Bij mensen is 90% van het totale circulerende CR1 gevonden in rode bloedcellen (RBC's) 13 . Bind op het oppervlak van RBC's, bindt CR1 aan C3b- of C4b-opsoniseerde micro-organismen of immuuncomplexen, waardoor hun klaring uit de omloop wordt vergemakkelijkt. Complexen gebonden aan CR1 worden inderdaad overgebracht naar fagocyten wanneer RBC's door de lever gaan en milt 11 , 14 . Door de afzetting van C3b en C4b te beperken, kan CR1 overmatige complementactivering voorkomen. Daarom wordt de expressie van CR1 op RBC's beschouwd als een essentieel element in de bescherming van weefsels, zoals het cerebrale zenuwstelsel, tegen immuuncomplexafzetting en de resulterende ziekten. De CR1 op RBCs is ook bekendSpeel een belangrijke rol bij pathogene infectie 15 , 16 . Daarnaast is CR1, als sleutelrolder in aangeboren immuniteit, betrokken bij de regulering van de complementcascade en bij het transport en opruimen van immuuncomplexen. CR1 oefent deze activiteit uit door C3b- en C4b-fragmenten te binden en klassieke en alternatieve convertasen te dissociëren (dissociatie van C2a uit het C4b2a complex en dissociatie van C3b uit het C3bBb complex). Als een cofactor van de plasma serine protease factor I (FI), remt CR1 de klassieke en alternatieve complement pathways door de splitsing van C4b en C3b door FI, een eigenschap bekend als cofactor activiteit (CA) te verhogen en door de C3 amplificatie lus te remmen Op zijn beurt verhinderen verdere complementactivering. Rogers en collega's bewijzen dat het Aβ peptide de complement pathway kan binden en activeren in afwezigheid van antilichamen 17 en suggereren dat het Aβ peptide cl isUit circulatie door middel van complementafhankelijke aanhechting aan het CR1 uitgedrukt op RBC's 18 .
CR1 vertoont drie soorten polymorfismen: structurele of lengtepolymorfismen, dichtheidspolymorfismen en Knops bloedgroeppolymorfismen 11 , 19 . Het structurele polymorfisme is gerelateerd aan een variatie in het aantal lange homologe herhalingen (LHR's) en definieert hierbij vier isoformen. In feite is het extracellulaire domein van het CR1-eiwit samengesteld uit een reeks herhalende eenheden, genaamd korte consensus herhalingen (SCR's) of complement control repeats (CCP's). Deze SCR's zijn aangetoond uit het complement-deoxyribonucleïnezuur (cDNA) dat codeert voor CR1. De SCR's zijn gerangschikt in tandemgroepen van zeven, bekend als LHR's. CR1 is ingericht in vier LHRs, aangeduid als LHR-A, -B, -C en -D, voortvloeiende uit de duplicatie van een zeven-SCR-eenheid 19 , 20 ,21 .
In toenemende volgorde van frequentie zijn deze CR1 isoformen bepaald door Western blot (WB) CR1 * 1 (A / F) (snelle migratie op gelelektroforese), CR1 * 2 (B / S) (langzame migratie op gelelektroforese), CR1 * 3 (C / F`) en CR1 * 4 (D). De twee meest voorkomende isoformen, CR1 * 1 (A / F) en CR1 * 2 (B / S), zijn samengesteld uit respectievelijk vier en vijf LHR's, terwijl CR1 * 3 (C / F`) en CR1 * 4 ) Zijn samengesteld uit respectievelijk 3 en 6 LHR's. De meest voorkomende isoform (CR1 * 1), bestaande uit 30 SCR's, bevat drie C4b bindingsplaatsen (SCRs 1-3, 8-10 en 15-17) en twee C3b bindingsplaatsen (SCRs 8-10 en 15-17) , Terwijl SCRs 22-28 C1q, ficolines en MBL 12 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 binden. Zo bevat CR1 * 2 een extra C3b / C4b bindingsplaats vergelijkenD tot CR1 * 1. Figuur 1 illustreert de structuren, nomenclaturen en molecuulgewichten van de vier verschillende isoformen van CR1.
De dichtheidspolymorfie komt overeen met een stabiel fenotype dat het niveau van constitutieve expressie van CR1 op RBC's vertegenwoordigt. Bij gezonde Kaukasische onderwerpen is aangetoond dat het aantal CR1 moleculen per RBC kan variëren tot een factor van tien (variërend van 150 tot 1.200 moleculen per cel) 26 . RBC's van het Helgeson fenotype hebben een zeer lage CR1 dichtheid, die bleek te zijn lager dan 150 moleculen per cel 27 , 28 . De CR1 dichtheid op RBC's is genetisch geassocieerd met een autosomaal codominant biallel systeem op het CR1 gen, gecorreleerd met een Hin dIII restrictie fragment lengte polymorfisme (RFLP) 29 . Een enkele-punt mutatie in Intron 27 van het CR1 gen, tussen de exonen die voor de tweede coderenSCR LHR-D, resulteert in het genereren van een polymorfe HindIII plaats binnen dit gebied 30. Genomische Hin dIII fragmenten van 7,4 en 6,9 kDa identificeren alleelen die verband houden met hoge (H-allele) of lage (L-allele) CR1-dichtheid op respectievelijk RBC's. Nochtans werd geen correlatie gevonden tussen CR1 dichtheid op RBCs en Hin dIII polymorfismen in sommige West-Afrikaanse populaties 31 , 32 . Het mechanisme linking CR1 dichtheid regelgeving een niet-coderend HindIII polymorfisme onbekend. Onder verscheidene polymorfismen zijn Q981H in SCR16 en P1786R in SCR28 gerapporteerd te zijn gekoppeld aan de CR1 dichtheid op RBCs 30 , 33 .
De Knops (KN) polymorfisme, volgens de internationale nomenclatuur, is het 22e bloedgroepsysteem dat geïndexeerd wordt door de International Society of Blood Transfusion. Het bevat 9 antigene speciFiciteiten uitgedrukt door de CR1 op RBC's, waaronder drie antitetische antigeenparen, KN1 / KN2, KN3 / KN6 en KN4 / KN7, evenals 3 geïsoleerde antigenen, KN5, KN8, KN9. De KN1-, KN3-, KN4- en KN5-antigenen zijn hoogfrequente antigenen van het KN-systeem (dat wil zeggen uitgedrukt in meer dan 99% van de algemene populatie). De rol van deze polymorfisme in AD blijft echter bepaald 13 .
Het protocol dat in dit werk is beschreven, werd ontworpen om de CR1-lengte polymorfisme genotypen te bepalen die betrokken zijn bij de gevoeligheid voor verschillende aandoeningen, zoals AD, systemische lupus erythematosus en malaria. Onze methode voor bepaling van CR1-lengte polymorfisme maakt gebruik van het aantal LHR-Bs die de CR1-isoformen en de sequentieverschillen tussen LHR-B en LHR-C omvat ( Figuur 2 ).
Protocol
Het protocol voor humane bloedinzameling en -behandeling is beoordeeld en goedgekeurd door de regionale ethische commissie (CPP Est II), en het protocolnummer is 2011-A00594-37.
OPMERKING: Het volgende protocol beschrijft de behandeling van menselijk bloed. Gelieve de institutionele richtlijnen te volgen bij het verwijderen van biohazard materiaal. Laboratoriumveiligheidsuitrusting, zoals labcoats en handschoenen, moet gedragen worden. Een stroomdiagram die het protocol beschrijft wordt weergegeven in figuur 3 .
1. Bloed- en lichaamsvloeistof-DNA-extractie
- Pipet 20 μl eiwitase K (15 μg / μl) in de bodem van een 1,5 ml buis.
- Voeg 200 μL monster toe aan de 1,5 ml buis. Gebruik maximaal 200 pl volbloed, plasma, serum, buffy coat of lichaamsvloeistoffen, of tot 5 x 10 6 lymfocyten in 200 pi PBS.
- Voeg 200 μl lysisbuffer toe aan het monster. Meng door puls-vortexing gedurende 15 s.
- Incubeer bij 56 ° C gedurende 10 minuten in een waterbad.
- Centrifugeer de 1,5 ml buis kortmatig om de druppels van de binnenkant van de deksel te verwijderen.
- Voeg 200 μl ethanol (96-100%) toe aan het monster en meng opnieuw met pulswerveling gedurende 15 s. Na het mengen, centrifugeer de 1,5 ml buis kortjes om de druppels van de binnenkant van de deksel te verwijderen.
- Breng het mengsel zorgvuldig uit stap 1.6 aan de membraankolom (in een collectiebuis van 2 ml). Zonder de rand te bevochtigen, sluit de kap en centrifugeer bij 6000 xg gedurende 1 minuut. Plaats de membraankolom in een schone 2 ml collectibuis en gooi de buis die het filtraat bevat af.
- Open de membraankolom voorzichtig en voeg 500 μL wasbuffer 1 toe zonder de rand te bevochtigen. Sluit de kap en centrifugeer bij 6000 xg gedurende 1 minuut. Plaats de membraankolom in een schone 2 ml collectibuis en gooi de buis die het filtraat bevat.
- Maak de membraankolom zorgvuldig open en voeg 500 μl wasbuffer 2 toe zonder het te bevochtigenE rand. Sluit de kap en centrifugeer bij volle snelheid (20.000 xg) gedurende 3 minuten.
- Plaats de membraankolom in een nieuwe collectiebuis van 2 ml en gooi de verzamelbuis met het filtraat. Centrifugeer bij 20.000 xg gedurende 1 minuut.
- Plaats de membraankolom in een schone 1,5 ml buis en gooi de verzamelbuis die het filtraat bevat.
- Open de membraankolom voorzichtig en voeg 200 μl gedistilleerd water toe. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en centrifugeer vervolgens gedurende 6 minuten bij 6000 xg.
- Ga door tot de bepaling van de DNA concentratie stap of vries de DNA monsters bij -20 ° C
2. Bepaling van de DNA-concentratie
OPMERKING: zie figuur 4 .
- Druk op 1 om de DNA-modus op een spectrofotometer te selecteren. Selecteer een 5 mm padlengte met de linker- en rechterpijlen. Selecteer een verdunningsfactor van 1 met de linker- en rechterpijlen.
- Selecteer de eenheid (μg / mL) met behulp van thE links en rechts pijlen. Selecteer een factor van 50 met de linker en rechter pijlen. Druk op OK .
- Pipet 10 μl gedistilleerd water in de cuvette. Zet de cuvette in de spectrofotometer. Druk op de knop OA / 100% T.
- Pipetteer 10 μl van het DNA-monster (1/4 verdunning in gedistilleerd water) in de cuvette. Zet de cuvette in de spectrofotometer. Druk op de groene knop (lees / start). Let op de concentratie.
- Bevroren het DNA-monster bij -20 ° C.
3. HRM-PCR Protocol
- Doe de DNA monsters op. Verdun de DNA-monsters in 1,5 ml buizen met water om ze aan te passen aan een concentratie van 10 ng / μL
OPMERKING: Het totale volume verdund DNA moet tussen 2 μL en 10 μL liggen. - Doe de primeroplossingen op. Verdun de primeroplossingen in 1,5 ml buizen met water om ze aan te passen aan dezelfde concentratie van 6 μM.
OPMERKING: De primersequenties en reactieomstandigheden worden in T gegevenIn staat 1.
Tabel 1: Primers en parameters die worden gebruikt bij de hoge-resolutie smeltanalyse.
- Doe de HRM-PCR-kitoplossingen op en meng ze zorgvuldig door vortexen om het herstel van de gehele inhoud te garanderen. Kort draaien de drie flesjes die de enzymatische mengsel met DNA bindende kleurstof, MgCl2 en water in een microcentrifuge alvorens ze te openen. Bewaar ze bij kamertemperatuur.
- Bereid de PCR-mix voor een reactie van 20 μL in een 1,5 ml buis bij kamertemperatuur door de volgende componenten toe te voegen in onderstaande volgorde:
- 10 μl enzymatisch mengsel met DNA bindende kleurstof;
- 2 ui 25 mM MgCl2;
- 1 μl primer 1, 6 μM (eindconcentratie: 300 nM);
- 1 μl primer 2, 6 μM (eindconcentratie: 300nM); en
- 5 μl water.
OPMERKING: Om de PCR-mix voor meer dan één reactie op te stellen, vermenigvuldigt u de bovenstaande volumes met het aantal reacties dat u wilt uitvoeren, plus een extra reactie.
- Meng goed door vortexing.
- Pipet 19 μL PCR-mengsel, hierboven bereid, in elke putje van een witte multiwellplaat.
- Voeg 1 μl concentratie-aangepaste DNA-sjabloon toe, bereid in stap 3.1.
OPMERKING: Voor controle-reacties moet u altijd een negatieve controle uitvoeren met de monsters. Om een negatieve controle op te stellen, vervang het sjabloon DNA met water. - Verzegel de witte multiwellplaat met afdichtfolie.
- Plaats de witte multiwellplaat in de centrifuge en balans het met een geschikt tegengewicht ( dwz een andere multiwellplaat). Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 1.500 xg in een standaard swing-centrifuge met een rotor voor multiwellplaten met geschikte adapters.
- Plaats de witte multiwellplaat in het HRM-PCR-instrument.
- Start het HRM-PCR programma met de volgende PCR condities:
Denaturatie: 95 ° C gedurende 10 minuten; 1 cyclus.
Versterking: 95 ° C gedurende 10 s, 62 ° C gedurende 15s en 72 ° C gedurende 20s; 47 cycli.
Smeltcurve: 95 ° C; Opritsnelheid: 0,02 ° C / s; 25 overnames per ° C; 1 cyclus.
Koelen: 40 ° C gedurende 30 s; Ophangsnelheid 2,2 ° C / s; 1 cyclus.
4. HRM Analyse om de CR1-lengte Polymorfisme te bepalen
OPMERKING: De beschreven methode ( figuur 5 ) is specifiek voor onze software (zie de tabel van materialen ), hoewel andere softwarepakketten kunnen worden gebruikt.
- Open een genscanningsoftware voor het uitvoeren van de CR1-lengte polymorfisme scananalyse.
- Open het experiment dat het versterkingsprogramma en het smeltcurveprogramma bevat.
- Klik op Sample editor in de modulebalk en selecteer vervolgens de SCanning workflow .
- Definieer de eigenschappen van de monsters ( dwz naam, onbekend of negatief controle).
- Klik op Analyse in de modulebalk .
- Selecteer Gen Scan in de lijst Nieuwe analyse maken .
- Klik op het tabblad Normalisatie om de smeltcurves te normaliseren.
- Klik op het tabblad Temperatuurverschuiving om de temperatuuras (x-as) van de smeltcurves te resetten.
OPMERKING: De onderste grafiek toont smeltcurven die zowel genormaliseerd als temperatuurverschuiven zijn. - Klik op de knop Bereken om de resultaten te analyseren en de groepering te bepalen.
- Klik op het tabblad Verschil plot in het tabblad gebied om de genormaliseerde en gesplitste smeltcurven en de genormaliseerde en temperatuurverschilverschilplot te bekijken .
Representative Results
Figuur 6 A toont de fenotypering van het CR1-lengte polymorfisme door WB. Figuur 6 B en C tonen de curven die worden verkregen tijdens HRM-PCR analyse, waardoor de bepaling van het CR1-lengte polymorfisme mogelijk is. Analyse van de fusiecurven die gebruik maken van de software na de hoge-resolutie smelting van de PCR-afgeleide ampliconen uit het genomische DNA van proefpersonen met verschillende CR1-isoformen produceert curven die onderwerpen onderscheiden volgens hun allotypische CR1-expressiefenotypen.
Figuur 6 B toont een eerste presentatiemodus, genaamd "Normalized and Shifted Smelting Curves", terwijl Figuur 6 C een tweede presentatiemodus toont, genaamd "Normalized and Temp-Shifted Difference Plot."
Figuur 6 A worden weergegeven : (CR1 * 3, CR1 * 1); (CR1 * 1, CR1 * 2); CR1 * 1; CR1 * 2; En (CR1 * 2, CR1 * 4). Dit stelt de genotypering van de CR1-lengte polymorfie in gebruik met deze nieuwe moleculaire biologie methode.
Figuur 1: Schematische weergave van de structuur en polymorfismen van het complement receptor 1 eiwit. Elke korte consensusreactie (SCR) of complement control protein (CCP) wordt weergegeven door een cirkel. De SCR's zijn gegroepeerd in een herhalende, hogere orde structuren genaamd LHR's. Van het extracellulaire domein naar het celmembraan zijn de LHR's: LHR-A, -B, -C, -D en -S (aanvullende of extra LHR). In de meest voorkomende CR1 isoform(CR1 * 1), de C4b / decay versnellende activiteit (DAA) bindingsplaats is gevestigd bij LHR-A (SCRs 1-3, groene cirkels), de C3b / C4b / cofactor activiteit (CA) bindingsplaats bevindt zich in de 3 N-terminale SCR's van LHR-B (SCRs 8-10, rode cirkels) en LHR-C (SCRs 15-17, paarse cirkels) en de bindingsplaats voor C1q / MBL en ficolin worden gevonden in de LHR-D (SCRs 22-28, blauwe cirkels). De homologe structuren zijn identiek gekleurd. De CR1 * 2 (S) isoform presenteert een extra LHR (LHR-S) en bevat derhalve een extra C3b / C4b bindingsplaats. KDa, kilodalton. NRC, niet-gereduceerde voorwaarden. RC, verminderde condities. TM, transmembrane domein. Deze figuur is aangepast van Brouwers et al. 36 met toestemming van Nature Publishing Group. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
"/files/ftp_upload/56012/56012fig2.jpg" />
Figuur 2 : Schematische weergave van de CR1 isoform structuur met sequentie amplicon posities verkregen door HRM-PCR. Elke doos staat voor een SCR. De SCR's zijn gegroepeerd in LHR's: LHR-A, -B, -C en -D. De homologe structuren zijn identiek gekleurd. De CR1 * 2 en CR1 * 4 isoformen presenteren extra LHR's (LHR-B) en bevatten dus een extra amplicongebied (amplicon B, in rood). CR1 * 3 heeft geen LHR-B en bevat minder amplicon gebied (ontbreekt amplicon B). Nucleotide verschillen tussen amplicon B (196 bp) en het invariant amplicon (197 bp) worden respectievelijk in rood en blauw afgebeeld. Verschillen in de verhouding: (amplicon B, in rood / invariant amplicon, in blauw) tussen elke CR1 isoform worden bepaald door de HRM-PCR, waardoor genotypering mogelijk is. De CN3- en CN3re-primersequenties worden onderstreept. TM, transmembrane domein. CYT, cytoplasmatische staart.Pg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Figuur 3: Flowchart van het protocol voor het genotyperen van de CR1-lengte polymorfisme uit humane bloedmonsters. Verzamel een menselijk DNA-monster. Extract het DNA om een DNA bloedmonster te verkrijgen. Bepaal de DNA-concentratie en verdun om de DNA-concentratie te verkrijgen bij 10 ng / μl. Gebruik HRM-PCR om het CR1-lengte polymorfisme genotype te verkrijgen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4 : Screenshots van de spectrofotometer ons Ed om de DNA-concentratie te bepalen. Druk op 1 ( A ) om de DNA-modus op de spectrofotometer te selecteren. Selecteer een 5 mm padlengte ( B ) met de linker en rechter pijltjestoetsen ( C ). Selecteer de eenheid (μg / mL) ( D ) met de linker en rechter pijltjestoetsen ( C ). Selecteer verdunningsfactor 1 ( E ) met de linker- en rechterpijlen ( C ). Selecteer een factor van 50 ( F ) met de linker- en rechterpijlen. Druk op OK ( G ). Pipet 10 μl gedistilleerd water in de cuvette. Zet de cuvette in de spectrofotometer ( H ). Druk op de OA / 100% T knop ( I ). Pipetteer 10 μL DNA-monster (1/4 verdunning in gedistilleerd water) in de cuvette. Zet de cuvette in de spectrofotometer ( K ). Druk op de groene knop (lees / start) ( L ). Let op de concentratie ( M ).Es / ftp_upload / 56012 / 56012fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Figuur 5: Screenshots van de grafische interface van de software die wordt gebruikt in stap 4 van het protocol. ( A ) Open de genscanningsoftware. ( B ) Versterkingsprogramma en smeltcurve programma. ( C ) Klik op Sample editor in de Module bar. ( D ) Selecteer Scannen . ( E ) Definieer de eigenschappen van de monsters. ( F ) Klik op Analyse in de modulebalk . ( G ) Klik op het tabblad Normalisatie om de smeltcurves te normaliseren. ( H ) Klik op het tabblad Temperatuurverschuiving om de smeltcurves weer te geven die beide zijnGenormaliseerd en temperatuurgeschoven. ( I ) Klik op de knop Bereken om de resultaten te analyseren en de groepering te bepalen. ( J ) Klik op het tabblad Verschilplot om de genormaliseerde en gesplitste smeltcurven en de genormaliseerde en temperatuurverschilverschilplot te bekijken . ( K ) Gekleurde groepering van de monsters volgens de CR1-lengte genotypen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Fenotyping van de CR1-lengtepolymorfismen waargenomen in het WB en hun bijbehorende profielkrommen verkregen door HRM-PCR. ( A ) Fenotyping van de CR1-lengte polymorfismen met behulp van WB. ( B C ) Genotypering van CR1-lengte polymorfismen met behulp van HRM-PCR analyse. HRM-curve analyse van PCR amplicons verkregen uit het genomische DNA van proefpersonen die verschillende CR1 isoformen tonen, leidden tot de identificatie van specifieke curve profielen: (CR1 * 3, CR1 * 1) (paars); (CR1 * 1, CR1 * 2) (blauw); CR1 * 1 (groen); CR1 * 2 (rood); En (CR1 * 2, CR1 * 4) (grijs). Deze komen overeen met de CR1-lengte polymorfisme allelen. Zoals getoond door de twee modi van presentatie- "Normalized and Shifted Smelting Curves" (B) en "Normalized and Temp-Shifted Difference Plot" (C) worden de curve profielen verdeeld volgens de (CR1 * 3, CR1 * 1) ; (CR1 * 1, CR1 * 2); CR1 * 1; CR1 * 2; En (CR1 * 2, CR1 * 4) groepen. Deze figuur is aangepast van Mahmoudi et al. 38 met toestemming van Elsevier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Hier beschrijven we een breed toegankelijke methodologie om CR1-lengte polymorfismen te bestuderen. De moleculaire biologie technieken voor amplificatie of segmentale hybridisatie hebben nog nooit in staat gesteld om bevredigende resultaten te geven die de bepaling van CR1-lengte polymorfismen in alle individuen mogelijk maken. Dit komt door de herhalende structuur van het CR1-gen ( dwz de zeer herhalende SCR's van CR1). De hier beschreven moleculaire biologie methode exploiteert de kwantitatieve verdeling van LHR-B in het CR1 molecuul. Het CR1 molecuul omvat n LHR-B domeinen, waar n een getal is tussen 0 en 3 en slechts één LHR-C domein, zoals beschreven en geïllustreerd in Figuur 2 . Quantitative domain B detectie maakt het mogelijk om één extra of ontbrekend domein B volledig te onderscheiden.
Uit het geëxtraheerde genetische materiaal wordt een eerste DNA fragment uit LHR-B geamplificeerd door PCR met behulp van een enkel paar specifieke primers, representerenTing een kenmerkende variant van LHR-B genaamd "variant amplicon B." Een tweede DNA fragment, genaamd "invariant amplicon" en behorende tot LHR-C, wordt ook versterkt. Dit tweede DNA fragment is een fragment van LHR-C, maar een ander invariant fragment van LHR-A of -D zou ook kunnen worden gebruikt.
De twee DNA-fragmenten, variant amplicon B en het invariant amplicon worden geamplificeerd door dezelfde primers en vertonen vijf verschillen in nucleotide sequenties. Dit kenmerk maakt het mogelijk in de volgende stap het aantal variant amplicon B en het aantal invariant ampliconen te bepalen met gebruikmaking van een kwantitatief molecuulbiologie gereedschap, HRM, dat hiervoor is aangepast. De verhouding tussen het aantal amplicon B en het invariant amplicon (verhouding: amplicon B / invariant amplicon) varieert afhankelijk van de lengte van het CR1 molecuul. Inderdaad geeft CR1 * 4 3 amplicon B eenheden aan 1 invariant amplicon, CR1 * 2 geeft 2 amplicon B eenheden aan 1 invariant amplicon, CR1 * 1 toont 1 amplicon B tot 1 invariant amplicon en CR1 * 3 geeft 0 amplicon B eenheden aan 1 invariant amplicon ( Figuur 2 ). Zo maakt deze HRM-PCR-methode het genotyperen van de CR1-lengte polymorfisme mogelijk.
Niettemin vereist deze techniek bij het begin van de studie dat gebruik wordt gemaakt van referentieonderwerpen waarvan de CR1-fenotypes al bekend zijn ( dwz eerder door WB vastgesteld) om de genotypering van CR1 te kunnen vaststellen volgens het referentieprofiel van de verkregen curves Door HRM-PCR. Twee soorten representatie, namelijk 'Normalized and Shifted Smelting Curves' en 'Normalized and Temp-Shifted Difference Plot', zijn beschikbaar. Ze tonen afzonderlijke groepen curve profielen die zijn gekleurd volgens de CR1-lengte-polymorfisme fenotypering verkregen door WB ( Figuur 6 ). Vanuit de "Normalized and Shifted Smelting Curves" -stap maakt onze methode het mogelijk om te discriminerenE duidelijke groepen krommen die overeenkomen met de isoformen van CR1, gegroepeerd volgens kleur. Het 'Normalized and Temp Shifted Difference Plot', dat overeenstemt met een andere wiskundige representatie, maakt het echter mogelijk om de afzonderlijke groepen van krommen gemakkelijker te visualiseren. Hoewel de software van de fabrikant routinematig in deze studie was gebruikt, zou andere software (zoals uANALYSE) kunnen worden gebruikt als data-extractieprogramma voor curve analyse.
Tot op heden is de WB analyse techniek de originele techniek die de identificatie van de verschillende CR1 lengte polymorfismen op het niveau van het eiwit mogelijk maakt. Deze techniek heeft echter een aantal nadelen. In het bijzonder kan eiwitanalyse door WB alleen worden uitgevoerd na de extractie van de celmembranen. Als gevolg daarvan is het complex en erg tijdrovend. Bovendien vereist deze techniek het verkrijgen van een vers bloedmonster in geschikte omstandigheden aan het begin van de procedure om nuttige res te verkrijgenULT's. Integendeel, het uitvoeren van HRM-PCR op DNA maakt het mogelijk om zelfs droge bloedvlekjes of monsters te gebruiken na langdurige opslag. HMR-PCR vereist een gespecialiseerd DNA smeltinstrument, ofwel een speciaal instrument of een HMR-capaciteit thermocycler met HRM software. SNP detectie is afhankelijk van verschillende factoren: i) SNP's opgenomen in grote PCR fragmenten zijn moeilijker te detecteren dan dezelfde SNP's in kleine PCR fragmenten; Ii) SNP's die behoren tot de klassen III en IV, zijn moeilijker te detecteren dan die van de klassen I en II 34 ; En iii) SNP's die door de nabije buurman-basissymmetrie ( bijvoorbeeld 5'-G (G / C) C-3 ') worden geflankeerd, kunnen niet gesorteerd worden door smeltingen, ongeacht de resolutie van het HMR-platform. Het kan nuttig zijn om de voorspelde PCR-fragmenten die de SNP van belang met de uMELT-software 35 bevatten te testen om de validiteit van de test te beoordelen. Ten slotte is HMR-PCR een analoge methode, wat betekent dat de gelijkenis van smeltcurves weddenWeen een referentie en een sjabloon impliceert niet noodzakelijk dat de sjabloonreeks identiek is aan de referentie, omdat de sjabloonvolgorde anders kan zijn dan de referentie maar thermodynamisch equivalent. Deze beperkingen gelden echter niet voor de hier beschreven werkwijze, die gebaseerd is op het smelten van een mengsel van ampliconen die verschillen in termen van 5 nucleotidesequenties.
Bovendien heeft de hier beschreven techniek, gebaseerd op de analyse van HRM, vele voordelen. Ten eerste worden de CR1-lengtepolymorfismen sneller bepaald, aangezien de resultaten worden verkregen in ongeveer 2 uur zodra de extractie van het genetische materiaal is uitgevoerd. Omgekeerd vereisen traditionele biochemische technieken gebaseerd op WB eiwit analyse stappen die relatief lang zijn: de elektroforese van celmembraan extracten door middel van een acrylamide gel, een stap om eiwitten over te brengen aan een nitrocellulose of polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan en een stap om de Isoformen van deCR1 molecuul door immunochemiluminescentie. Ten tweede heeft de HRM-PCR-techniek het voordeel dat het niet te duur is, wat bijzonder belangrijk is voor een methode die waarschijnlijk wordt toegepast op veel individuen ( dwz grotendeels) om hun gevoeligheid voor de ontwikkeling van pathologieën zoals de ziekte van Alzheimer te bepalen, Lupus of malaria.
Onlangs hebben we en anderen aangetoond dat de CR1 * 2 isoform, die een extra C3b / C4b bindingsplaats bevat, werd geassocieerd met AD 36 , 37 , 38 . In onze eerder gepubliceerde studie waren de CR1-lengtepolymorfismen op het niveau van het gen en het eiwit consistent bij 98,9% van de onderwerpen 38 . De discordante resultaten verkregen bij het vergelijken van lengtepolymorfismen verkregen door HRM-PCR met die verkregen door WB, kwamen overeen met proefpersonen met een genotypeprofiel (CR1 * 1, CR1 * 2) bepaald door HRM (gen), maar exAlleen op de CR1 * 1 isoform op het oppervlak van de erythrocyt volgens WB (eiwit) drukken. In onze studie was het gebrek aan CR1 * 2-isoforme expressie (individuen die een stille allele hadden) reproduceerbaar als de WB werd uitgevoerd met een langere belichtingstijd en kan worden verklaard door het bestaan van een stille CR1-allele (CR1 * 2), beschreven In de literatuur van Helgeson 39 . Niettemin zijn verdere studies over grotere populaties nodig om deze hypothese te ondersteunen.
Opgemerkt moet worden dat privé-SNP's (SNP's die alleen in een kleine familiegroep of zelfs in een individueel voorkomen) tot duidelijke curveprofielen leiden die met behulp van referentiefenotypebepaling (WB) moeten worden ontcijferd, maar die niet met het canonieke profiel kunnen worden verward om te vermijden Elke misinterpretatie van het CR1-lengte polymorfisme genotype.
Disclosures
De auteurs zijn de uitvinders van een octrooi in eigendom van de Universiteit van Reims Champagne-Ardenne (URCA) (octrooi nummer WO 2015166194)
Acknowledgments
Wij bedanken alle leden van de Plateforme Regional de Biologie Innovante, het personeel van de afdeling Immunologie en het personeel van de afdeling Interne Geneeskunde en Geriatrie, die bijgedragen hebben tot het optimaliseren en valideren van het protocol. Dit werk is gefinancierd door de Reims University Hospitals (subsidie nummer AOL11UF9156). We danken ook Fiona Ecarnot (EA3920, Universitair Ziekenhuis Besancon, Frankrijk) voor redactionele bijstand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab coat | protection | ||
| SensiCareIce powder-free Nitrile Exam gloves | Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA | 486802 | sample protection |
| Eppendorf Reference 2 pipette, 0,5-10µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000024 | sample pipetting |
| Eppendorf Reference 2 pipette, 20-100µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000059 | sample pipetting |
| Eppendorf Reference 2 pipette, 100-1000µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000083 | sample pipetting |
| TipOne 10µL Graduated, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1121-3810 | sample pipetting |
| TipOne 1-100µL bevelled, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1120-1840 | sample pipetting |
| ART 1000E Barrier Tip | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 2079E | sample pipetting |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, Eppendorf Quality | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 0030120086 | mix |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA | SI-0236 | mix |
| QIAamp DNA Mini Kit (250) | Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France | 51306 | DNA Extraction |
| Buffer AL | Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France | 19075 | Lysis buffer |
| QIAamp Mini Spin Column | Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France | 1011706 | DNA binding |
| Buffer AW1 | Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France | 19081 | Wash buffer |
| Buffer AW2 | Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France | 19072 | Wash buffer |
| Biowave DNA spectrophotometer | Biochrom Ltd, Cambridge CB4 OFJ, England | 80-3004-70 | DNA concentration |
| Mikro 200 centrifuge | Hettich Zentrifugen, D-78532, Germany | 0002020-02-00 | centrifugation |
| Multipette E3 | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4987000010 | distribution |
| Light Cycler 480 multiwell plate 96, white | Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany | 04729692001 | reaction place |
| Light Cycler 480 sealing foil | Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany | 04429757001 | coverage |
| Heraeus Megafuge 11R centrifuge | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 75004412 | centrifugation |
| LightCycler 480 Instrument II, 96-well | Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany | 05015278001 | high resolution melting polymerase chain reaction |
| LightCycler 480 High Resolution Melting Master | Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany | 04909631001 | reaction reagents |
| light cycler 480 SW 1.5.1 software | Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany | software used for HRM PCR CR1 polymorphism data analysis | |
| CN3 primer: 5'ggccttagacttctcctgc 3' | Eurogentec Biologics Division, B- 4102 Seraing, Belgium | reaction reagent | |
| CN3re primer: 5'gttgacaaattggcggcttcg 3' | Eurogentec Biologics Division, B- 4102 Seraing, Belgium | reaction reagent |
References
- Prince, M., et al. World Alzheimer Report 2015, The Global Impact of Dementia: An analysis of prevalence, incidence, cost and trends. Alzheimer's Disease International. , (2015).
- McKhann, G. M., et al. The diagnosis of dementia due to Alzheimer's disease: recommendations from the National Institute on Aging-Alzheimer's Association workgroups on diagnostic guidelines for Alzheimer's disease. Alzheimers Dement. 7 (3), 263-269 (2011).
- Serrano-Pozo, A., Frosch, M. P., Masliah, E., Hyman, B. T.
- Goate, A., et al. Segregation of a missense mutation in the amyloid precursor protein gene with familial Alzheimer's disease. Nature. 349 (6311), 704-706 (1991).
- Sherrington, R., et al. Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease. Nature. 375 (6534), 754-760 (1995).
- Levy-Lahad, E., et al. A familial Alzheimer's disease locus on chromosome 1. Science. 269 (5226), 970-973 (1995).
- Mayeux, R., Stern, Y. Epidemiology of Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (8), (2012).
- Corder, E. H., et al. Gene dose of apolipoprotein E type 4 allele and the risk of Alzheimer's disease in late onset families. Science. 261 (5123), 921-923 (1993).
- Yu, J. T., Tan, L., Hardy, J. Apolipoprotein E in Alzheimer's disease: an update. Annu Rev Neurosci. 37, 79-100 (2014).
- Lambert, J. C., et al. Genome-wide association study identifies variants at CLU and CR1 associated with Alzheimer's disease. Nat Genet. 41 (10), 1094-1099 (2009).
- Liu, D., Niu, Z. X. The structure, genetic polymorphisms, expression and biological functions of complement receptor type 1 (CR1/CD35). Immunopharmacol Immunotoxicol. 31 (4), 524-535 (2009).
- Jacquet, M., et al. Deciphering complement receptor type 1 interactions with recognition proteins of the lectin complement pathway. J Immunol. 190 (7), 3721-3731 (2013).
- Pham, B. N., et al. Analysis of complement receptor type 1 expression on red blood cells in negative phenotypes of the Knops blood group system, according to CR1 gene allotype polymorphisms. Transfusion. 50 (7), 1435-1443 (2010).
- Cosio, F. G., Shen, X. P., Birmingham, D. J., Van Aman, M., Hebert, L. A. Evaluation of the mechanisms responsible for the reduction in erythrocyte complement receptors when immune complexes form in vivo in primates. J Immunol. 145 (12), 4198-4206 (1990).
- Krych-Goldberg, M., Moulds, J. M., Atkinson, J. P. Human complement receptor type 1 (CR1) binds to a major malarial adhesin. Trends Mol Med. 8 (11), 531-537 (2002).
- Cohen, J. H., Geffriaud, C., Caudwell, V., Kazatchkine, M. D. Genetic analysis of CR1 (the C3b complement receptor, CD35) expression on erythrocytes of HIV-infected individuals. Aids. 3 (6), 397-399 (1989).
- Rogers, J., et al. Complement activation by beta-amyloid in Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci USA. 89 (21), 10016-10020 (1992).
- Rogers, J., et al. Peripheral clearance of amyloid beta peptide by complement C3-dependent adherence to erythrocytes. Neurobiol Aging. 27 (12), 1733-1739 (2006).
- Krych-Goldberg, M., Atkinson, J. P. Structure-function relationships of complement receptor type 1. Immunol Rev. 180, 112-122 (2001).
- Klickstein, L. B., et al. Human C3b/C4b receptor (CR1). Demonstration of long homologous repeating domains that are composed of the short consensus repeats characteristics of C3/C4 binding proteins. J Exp Med. 165 (4), 1095-1112 (1987).
- Hourcade, D., Miesner, D. R., Atkinson, J. P., Holers, V. M. Identification of an alternative polyadenylation site in the human C3b/C4b receptor (complement receptor type 1) transcriptional unit and prediction of a secreted form of complement receptor type 1. J Exp Med. 168 (4), 1255-1270 (1988).
- Krych, M., Hourcade, D., Atkinson, J. P. Sites within the complement C3b/C4b receptor important for the specificity of ligand binding. Proc Natl Acad Sci USA. 88 (10), 4353-4357 (1991).
- Krych-Goldberg, M., et al. Decay accelerating activity of complement receptor type 1 (CD35). Two active sites are required for dissociating C5 convertases. J Biol Chem. 274 (44), 31160-31168 (1999).
- Klickstein, L. B., Barbashov, S. F., Liu, T., Jack, R. M., Nicholson-Weller, A. Complement receptor type 1 (CR1, CD35) is a receptor for C1q. Immunity. 7 (3), 345-355 (1997).
- Ghiran, I., et al. Complement receptor 1/CD35 is a receptor for mannan-binding lectin. J Exp Med. 192 (12), 1797-1808 (2000).
- Cornillet, P., Philbert, F., Kazatchkine, M. D., Cohen, J. H. Genomic determination of the CR1 (CD35) density polymorphism on erythrocytes using polymerase chain reaction amplification and HindIII restriction enzyme digestion. J Immunol Methods. 136 (2), 193-197 (1991).
- Moulds, J. M., Nickells, M. W., Moulds, J. J., Brown, M. C., Atkinson, J. P. The C3b/C4b receptor is recognized by the Knops, McCoy, Swain-langley, and York blood group antisera. J Exp Med. 173 (5), 1159-1163 (1991).
- Moulds, J. M., Moulds, J. J., Brown, M., Atkinson, J. P. Antiglobulin testing for CR1-related (Knops/McCoy/Swain-Langley/York) blood group antigens: negative and weak reactions are caused by variable expression of CR1. Vox Sang. 62 (4), 230-235 (1992).
- Wilson, J. G., et al. Identification of a restriction fragment length polymorphism by a CR1 cDNA that correlates with the number of CR1 on erythrocytes. J Exp Med. 164 (1), 50-59 (1986).
- Wong, W. W., et al. Structure of the human CR1 gene. Molecular basis of the structural and quantitative polymorphisms and identification of a new CR1-like allele. J Exp Med. 169 (3), 847-863 (1989).
- Herrera, A. H., Xiang, L., Martin, S. G., Lewis, J., Wilson, J. G. Analysis of complement receptor type 1 (CR1) expression on erythrocytes and of CR1 allelic markers in Caucasian and African American populations. Clin Immunol Immunopathol. 87 (2), 176-183 (1998).
- Rowe, J. A., et al. Erythrocyte CR1 expression level does not correlate with a HindIII restriction fragment length polymorphism in Africans; implications for studies on malaria susceptibility. Genes Immun. 3 (8), 497-500 (2002).
- Birmingham, D. J., et al. A polymorphism in the type one complement receptor (CR1) involves an additional cysteine within the C3b/C4b binding domain that inhibits ligand binding. Mol Immunol. 44 (14), 3510-3516 (2007).
- Venter, J. C., et al. The sequence of the human genome. Science. 291 (5507), 1304-1351 (2001).
- Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).
- Brouwers, N., et al. Alzheimer risk associated with a copy number variation in the complement receptor 1 increasing C3b/C4b binding sites. Mol Psychiatry. 17 (2), 223-233 (2012).
- Hazrati, L. N., et al. Genetic association of CR1 with Alzheimer's disease: a tentative disease mechanism. Neurobiol Aging. 33 (12), 2945-2949 (2012).
- Mahmoudi, R., et al. Alzheimer's disease is associated with low density of the long CR1 isoform. Neurobiol. Aging. 36, 1712-1765 (2015).
- Helgeson, M., Swanson, J., Polesky, H. F. Knops-Helgeson (Kna), a high-frequency erythrocyte antigen. Transfusion. 10 (3), 137-138 (1970).
