Tumor Engraftment in einem Xenograft-Maus-Modell der menschlichen Mantel-Zell-Lymphom

Zusammenfassung

Mantel-Zell-Lymphom (MCL) ist ein schwer zu B-Zell-Störung zu behandeln, und es ist ebenso schwierig, zur Einrichtung eines Xenograft-Maus-Modell der primären MCL zu studieren und Therapeutika zu entwickeln. Hier beschreiben wir die erfolgreiche Etablierung von MCL Xenotransplantate bei Mäusen zu helfen, die zugrunde liegende Biologie zu verstehen.

Zusammenfassung

B-Lymphozyten sind wichtige Akteure im Immunzelle Zirkulation und sie vor allem zu Hause und in den lymphatischen Organen befinden. Während normalen B-Zellen vermehren sich nur, wenn durch T-Lymphozyten stimuliert, Onkogene B-Zellen überleben und autonom in undefinierter Orgel Nischen zu erweitern. Mantel-Zell-Lymphom (MCL) ist eine solche B-Zell-Störung, wo die mediane Überlebenszeit der Patienten von 4-5 Jahren. Dies erfordert die Notwendigkeit wirksamer Mechanismen, durch die das Homing und Engraftment dieser Zellen blockiert werden, um das Überleben zu erhöhen, und Langlebigkeit des Patienten. Daher ist der Aufwand, ein Xenograft-Maus-Modell um die Wirksamkeit von MCL-Therapeutika zu studieren, durch die Blockierung der homing Mechanismus in Vivo zu entwickeln von größter Bedeutung. Entwicklung der tierischen Empfänger für menschliche Zelle Xenotransplantation, frühen Phase Medikamente zu testen haben seit langem verfolgt worden, wie relevanten präklinischen Mausmodelle für neue Therapeutika Bildschirm entscheidend sind. Dieses Tiermodell ist, menschliche Transplantat Ablehnung zu vermeiden und, ein Modell für menschliche Krankheiten entwickelt und es kann sein, dass ein extrem nützliches Werkzeug, Fortschreiten der Erkrankung von verschiedenen Lymphom-Arten zu studieren und Kandidat Drogen für präklinische Tests durchführen hämatologischen malignen Erkrankungen wie MCL. Wir etabliert ein Xenograft-Maus-Modell, die als eine hervorragende Ressource zu erforschen und entwickeln neue therapeutische Ansätze für MCL dienen wird.

Einleitung

Lymphozyten von der Natur eine wichtige Rolle in Immunüberwachung und Lymphozyten Menschenhandel ist ein entscheidender Schritt bei der Montage von Antigen-spezifischen Immunantwort^1,2. Dieser Prozess umfasst Migration von naiven T-Lymphozyten aus dem Thymus in den Blutkreislauf und von dort nach sekundären lymphatischen Organe, einschließlich Lymphknoten, Peyer Patches oder Milz, wo sie cognate Antigene treffen. Die B-Lymphozyten im Knochenmark differenzieren und Wandern als naive Zellen in Follikel der sekundären lymphatischen Organe³. Einige dieser B-Zellen Antigen mit ihrem Rezeptor binden und werden durch spezifische T-Zellen aktiviert. Proliferation und Differenzierung dieser B-Zellen schiebt die nicht aktivierte, naive B-Zellen in der Mantelzone des Follikels. Aktivierte Zellen können dann in den Speicher B Zellen, die Patrouille des Körpers, oder in Immunglobulin sezernierenden Plasmazellen, die Migration auf das Knochenmark⁴Reifen zu unterscheiden.

MCL tritt auf, wenn ein Tumor naive B-Lymphozyten in der Mantelzone verwandeln. Diese Lymphom-Zellen befinden sich in der Mikroumgebung der lymphatischen Organe und vermehren sich unabhängig von spezifischen T-Lymphozyten-Steuerung. Jedoch in einem bestimmten Stadium der Dichte Flucht aus dieser Nische und Umwälzen in die Blutbahn auf der Suche nach Nischen in anderen Organen. In Anbetracht der Komplexität der Adhäsionsmoleküle und die Promiskuität der Chemokine und ihre Rezeptoren der Mechanismus des zellulären Menschenhandel in Vivo kaum verstanden und daher behindert Therapie. Neuartige Methoden genügen, um dieses Migrationsprozesses um die Lymphomzellen B daran hindern, neue Mikroumgebungen effektiv zu blockieren.

MCL ist einer der am schwierigsten zu B-Zell-Tumoren zu behandeln. Die Entwicklung eines neoplastischen Phänotyps MCL ist das Ergebnis einer mehrstufigen Kaskade, zeichnet sich durch den Erwerb von einzigartigen biologischen Eigenschaften. Zum Zeitpunkt der Diagnose stellen die meisten Patienten (70 %) bereits verbreitet Krankheit, mit der Mehrheit der Fälle ausstellenden extranodal Beteiligung an Milz, dem Knochenmark und/oder Magen-Darm-Trakt^5,6. Bei behandelten Patienten ist Rückfall von resistenten Tumoren innerhalb weniger Jahre weit verbreitet, obwohl konventioneller Chemotherapie hohe Remissionsraten bei kurzfristigen^{7,8 induziert}. Hier präsentieren wir ein neues Krankheitsmodell, das helfen kann MCL Verbreitung und seine zugrunde liegende Biologie zu verstehen: wir etabliert ein menschliche MCL Xenograft-Maus-Modell aus der primären Tumorzellen des Patienten. Wir hoffen, dass dieses Modell hilft therapeutische Strategien gegen MCL Verbreitung zu entwickeln, und eventuell neue klinische Perspektiven für optimale Diagnose und Behandlung der refraktären Patienten geben.

Protokoll

Die menschlichen Blutproben wurden nach Genehmigung durch die lokale Ethik und menschliche Experimente Ausschüsse des Universitätsspitals Genf Verfahren verwendet.

Tierische Verfahren wurden im Einklang mit den institutionellen ethischen Ausschuss von Animal Care in Genf, der Schweiz und beim kantonalen Veterinäramt durchgeführt (Zulassungsnummer: GE/26/15).

1. Vorbereitung primäre peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) durch Dichtetrennung Gradient

Hinweis: 3-5 mL des peripheren Blutes wurden Patienten mit MCL in einer leukämischen Phase entnommen. Die Diagnose wurde gemäß standard diagnostischen Kriterien für die Durchflusszytometrie (CD5 +, CD23−, CD200 +, monoklonalen B-Zell-Population) und anschließend durch Vorhandensein von chromosomalen Translokation t(11;14) und Überexpression von cyclin D1 bestätigt. In allen Fällen stellte monoklonale B-Zellen zu > 90 % der gesamten B-Zell-Population. Die verbleibenden Zellen waren vor allem Monozyten und T-Zellen.

1. Verdünnen Sie (1:1) 5 mL MCL Blutprobe mit 5 mL Medium Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI) (Abbildung 1A).
2. Invertieren Sie die Dichte Gradienten Medien (Table of Materials) mehrmals vor der Verwendung um gute Durchmischung zu gewährleisten.
3. Hinzugeben Sie 5 mL Dichte-Gradienten-Medien in eine 15 mL Zentrifugenröhrchen mit Hilfe einer Pipette Absauganlage.
4. Sanft Schicht verdünnten Blutprobe über die Dichte Gradienten Medien in der 15 mL Zentrifugenröhrchen mit einer Absauganlage (das Blut Dichte-Gradienten Medien-Verhältnis sollte 2:1, z.B., 10 mL Blut bis 5 mL der Dichte-Gradienten-Medien). Keine Mischung sollten der beiden Schichten (Abbildung 1 b, C) achten.
5. Zentrifugieren Sie die Probe bei 400 X g 40 min bei Raumtemperatur mit der Zentrifuge Bremsen ausgeschaltet.
6. Mit einer sterilen Pasteurpipette vorsichtig Aspirieren die mittlere Schicht (weißliche, dünner Ring mit einem Pfeil (Abbildung 1, E) markiert), enthält die mononukleären Zellen und in ein sauberes Röhrchen überführen.
7. Waschen von mononukleären Zellen
   1. Schätzen Sie das Volumen der übertragenen Zellsuspension und hinzufügen 3 Bände von sterilen 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA).
   2. Mischen Sie die Suspension durch Pipettieren nach oben und unten mehrmals.
   3. Zentrifugieren Sie die Federung bei 400-500 X g für 10-15 min bei Raumtemperatur.
   4. Den Überstand der Zelle Pellet und wiederholen der Waschschritt zu verwerfen.
   5. Entfernen des Überstands und die Zellen in der gewünschten Lautstärke, z.B., 1 oder 2 mL PBS Aufschwemmen.
   6. Die Anzahl der Zellen durch eine automatisierte Zelle Zähler oder manuell über eine Hemocytometer (Neubauer Kammer).

(2) Anreicherung von B-Zellen durch B-Zellen Negative Selektion

1. Die Zellen in PBS, eine Endkonzentration von 50 x 10⁶ Zellen/mL zu verdünnen.
2. Übertragen Sie die Zellen auf 5 mL Runde Polystyrol Unterrohr. 2 mL Zellsuspension 100 µL Antikörper cocktail aus dem B-Zell-Anreicherung-Kit hinzu, und mischen Sie leicht durch Pipettieren nach oben und unten (Abbildung 2-1).
3. Inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für 10 min.
4. Kurz Wirbel die Magnetpartikel mitgelieferten B Zelle Bereicherung für 30 s (Abbildung 2-2). 2 mL der Probe 150 µL der magnetischen Partikel hinzufügen.
5. Inkubieren Sie die Probe für weitere 5 Minuten bei Raumtemperatur.
6. Bringen Sie das Probenvolumen bis 2,5 mL mit 1 X PBS mit 2 % fetalen Kälberserum (FCS) und 1 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA). Legen Sie das Rohr in den Magneten und inkubieren Sie das Rohr für weitere 3-5 Minuten (Abbildung 2-3).
7. Abholen des Magnet mit dem Rohr im Ort und in einer kontinuierlichen Bewegung, das Rohr zu dekantieren, damit die angereicherten Zellsuspension in einem frischen Rohr (Abbildung 2-4) gesammelt werden. Zählen der Zellen durch eine automatisierte Zelle Zähler oder manuell über eine Hemocytometer, um die Gesamtausbeute der B-Zellen zu erhalten.
   Hinweis: In der Regel ergibt sich eine ~ 10⁵ B Zellen/mL für normale B-Zellen und 5-50 x 10⁶ Zellen/mL für MCL.
8. Bestätigt die Reinheit der B-Zell-Bereicherung
   1. Nehmen ~ 50.000 Zellen und inkubieren Sie die Zellen mit Anti-CD19/CD20-Antikörper (01:20 Verdünnung) und Anti-CD45 Antikörper gekoppelt mit verschiedenen Fluorochromes (01:10 Verdünnung) bei Raumtemperatur für 15-30 min.
   2. Waschen mit 1 mL 1 x PBS + 1 % BSA, die Zellen bei 400-500 X g für 5 min Zentrifugieren und Zellen in ~ 200 µL PBS aufzuwirbeln.
   3. Erwerben Sie die Zellproben durch Durchflusszytometrie und für die Reinheit der B-Zellen zu analysieren. Reinheit ist meist > 90 % von dieser Methode (Abbildung 3).

3. Entwicklung der Xenograft-Maus-Modell

1. Aussetzen Sie ~ 40-60 x 10⁶ Zellen in 150-200 µL 1 X PBS (Volumen benötigt, um per Mausklick zu injizieren).
2. 150 µL Zellsuspension intravenös zu injizieren (i.v.) in jede Rute Vene von 6-7 Wochen alten immungeschwächte NOD scid Gamma (NSG) Mäusen unabhängig vom Geschlecht (Abb. 4A).
3. Lassen Sie die Mäuse, menschlichen Lymphom für ~ 10 Wochen zu entwickeln.
   Hinweis: Primäre menschlichen Lymphom-Zellen dauert wesentlich länger, im Vergleich zu menschlichen Lymphom Zelllinien (~ 3 Wochen) Tumor zu entwickeln.
4. Wenn die Tiere beginnen, zeigen Symptome einer tödlichen Krankheit wie Gewichtsverlust, Opfern zerzauste Haare, verminderte Aktivität, Lähmung der hinteren Extremitäten, etc., die Mäuse Erstickungstod CO₂ gefolgt von kardialen Herz durchbohren, Blut zu erhalten.
5. Sammeln verschiedener Organe wie Knochenmark, Milz und Leber durch sezieren die Mäuse und peripheren Blut zu sammeln, indem man Blut vom Herzen zum Zeitpunkt des Opfers für Tumor Engraftment Analyse (Abbildung 4 b -F).

4. Chimerism Analyse der Tumorzelle pfropfte in verschiedenen Organen

1. Nach dem Sammeln der verschiedenen Organe, verarbeiten sie durch mechanische Störung, einzelne Zellsuspensionen nach lyse der Erythrozyten (RBC) mit 200 µL 1 x Ammoniumchlorid Kalium Puffer für Blut und Knochenmark, 500 µL für Milz und 2 mL für Leber zu generieren .
2. Zählen und die Zellen mit menschlichen B-Zell-spezifische Antikörper, d.h.Anti-CD19, Anti-CD20 und Anti-CD45 Flecken.
   Hinweis: NSG Mäusen fehlt B-Zellen und damit für Analyse, Zellen sind mit menschlichen bestimmten B-Zell-Markern gefärbt.
3. Analysieren Sie die Zellen, die von jedem Organ durch Durchflusszytometrie Anspritzung auf B-Zellen (CD19 +, CD20 +, CD45 +) abgeleitet.
4. Quantifizieren Sie die eingepflanzt Tumorzellen in verschiedenen Organen abgeleitet von MCL injiziert Mäuse basierend auf den geschlossenen Zellen, wie in Schritt 4.3 (Abbildung 4).
   Hinweis: Siehe Tabelle der Materialien für Details.

Ergebnisse

Das Manuskript beschreibt eine optimierte Protokoll für die erfolgreiche Entwicklung von einem Xenograft-Maus-Modell für Engraftment MCL Zellen. Vorbereitung einer reinen Zellpopulation (in diesem Fall MCL-Zellen), ist sehr kritisch, erfolgreiche MCL Xenotransplantate zu entwickeln. Abbildung 1 stellt die präparative Schritte zur Isolierung von mononukleären Zellen aus Blut MCL der Patienten durch Dichtetrennung Farbverlauf. Die mononukleären Zellen werden we...

Diskussion

Klinische Studien sind möglich für Medikamente, die in einem fortgeschrittenen Stadium der Entwicklung sind jedoch nicht für die Wirkstoffforschung verwendet werden. Bemühungen um tierische Empfänger für die menschliche Zelle Xenotransplantation zu entwickeln, um frühe Phase Medikamente zu testen haben lange verfolgt. Hier präsentieren wir ein Tiermodell, das menschliche Transplantat Ablehnung vermeidet und kann ein Modell für menschliche Krankheiten, wie MCL. Dies ist derzeit ein State-Of-The-Art-Xenograft-Modell, die M...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ficoll-Paque-Medien	GE Healthcare	17-1440-02	zur Trennung von mononukleären Zellen
RPMI Medium 1640	Gibco-Life-Technologien	61870-010	zur Verdünnung von Blutproben
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Waschen von Zellen
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A8412	zur Herstellung von PBS mit 1 % BSA, das in Waschzellen während der Isolierung verwendet wird
CD19-APC700	Beckman Coulter	B49212	humaner pan-B-Zellmarker
CD20-APC	Beckman Coulter	A21693	humaner pan-B-Zellmarker
CD20-ECD	Beckman Coulter	IM3607	humaner pan-B-Zellmarker
CD5-PC 5.5	Beckman Coulter	PN A70203	humaner T-Zellmarker
CD23-PE	Pharmingen	555711	Zelloberflächenprotein fehlt typischerweise in MCL
CD45 KO Beckman	Coulter	B36294	Pan-Leukozytenmarker
CD200-PE	Pharmingen	552475	Zelloberflächenprotein fehlt typischerweise nicht in MCL
NOD scid gamma (NSG) Mäusen	River Laboratories	5557	wurde in dieser Studie
zur Entwicklung von MCL-Xenotransplantaten verwendetEasy sep Humanes B-Zell-Anreicherungskit	Stammzelltechnologien	19054	zur Anreicherung von B-Zellen zur Gewinnung reiner Zellen für die Injektion in Mäuse
FACS	Beckman Coulter	Navios	zur Charakterisierung von MCL-Proben und zur Untersuchung der Organe für die MCL-Transplantation
1X Ammoniumchlorid, Kaliumpuffer			roter Blutlysepuffer (NH4Cl 8.024 mg/l; KHCO3 1.001 mg/l; EDTA. Na2· 2H2O 3,722 mg/l )

Charles , : ,