Methodenartikel

Quantitative Immunhistochemie der zellulären Mikroumgebung bei Patienten-Glioblastom-Resektionen

DOI:

10.3791/56025

⸱

31. Juli 2017

 , 
1Biomedical Engineering, University of Virginia

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Tumor-Mikroumgebungs-Komponenten in Glioblastom-Patienten-Resektionen mit chromogener Immunhistochemie und ImageJ quantitativ zu identifizieren.

Zusammenfassung

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Mit dem wachsenden Interesse an der Tumor-Mikroumgebung haben wir uns bemüht, eine Methode zur spezifischen Bestimmung der Mikroumgebungskomponenten innerhalb von Patientenproben von Glioblastom, dem tödlichsten und am meisten invasiven Hirntumor, zu entwickeln. Es sind nicht nur quantitative Methoden, die für die genaue Beschreibung von erkrankten Geweben von Vorteil sind, sondern auch potenziell zu einer genaueren Prognose, Diagnose und Entwicklung von gewebetechnischen Systemen und Ersetzungen beitragen. Im Glioblastom wurden Gliazellen, wie Mikroglia und Astrozyten, unabhängig mit einer schlechten Prognose auf der Grundlage der Pathologieabstufung korreliert. Der Zustand dieser Zellen und anderer Gliazellenkomponenten ist jedoch nicht quantitativ gut beschrieben worden. Dies kann aufgrund der großen Prozesse, die diese Gliazellen markieren, schwierig sein. Darüber hinaus konzentrieren sich die meisten histologischen Analysen auf die gesamte Gewebeprobe oder nur innerhalb der Masse des Tumors, im Gegensatz zu der Abgrenzung von Quantifizierungen, die auf Regionen basierenHin das sehr heterogene Gewebe. Hier beschreiben wir eine Methode zur Identifizierung und quantitativen Analyse der Populationen von Gliazellen innerhalb der Tumormasse und angrenzenden Regionen der Tumorresektionen von Glioblastompatienten. Wir verwendeten die chromogene Immunhistochemie, um die Gliazellpopulationen bei Patienten-Tumor-Resektionen und ImageJ zu identifizieren, um die prozentuale Abdeckung der Färbung für jede Glia-Population zu analysieren. Mit diesen Techniken sind wir in der Lage, die Gliazellen in allen Regionen der Gliom-Tumor-Mikroumgebung besser zu beschreiben.

Einleitung

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Glioblastom (GBM), der häufigste und bösartige Hirntumor, zeichnet sich durch eine stark diffuse Invasion aus der primären Tumormasse in das umgebende gesunde Gehirnparenchym 1 , 2 aus . Diese diffuse Invasion macht den Tumor besonders schwierig, vollständig zu resezieren, und die eindringenden Krebszellen, die nach der Therapie bleiben, ist der häufigste Grund für unvermeidliches Rezidiv 2 , 3 , 4 . Bisher fanden wir die diffuse Gliom Zellinvasion Hemmung therapeutisch vorteilhaft 5, wird jedoch wenig über die komplexen Mechanismen bekannt ist GBM Invasion beitragen. Die Tumor-Mikroumgebung oder das Gewebe, das den Krebs umgibt, wurde in die Progression von Tumoren in mehreren Krebsarten 6 , 7 verwickelt. Die Glioblastom-Tumor-Mikroumgebung, in pArtikulär, ist relativ unter- charakterisiert und ist eindeutig komplex und komponiert mehrere Gliazellen wie Astrozyten, Mikroglia und Oligodendrozyten sowie extrazelluläre Matrix, lösliche Faktoren und biophysikalische Faktoren. Experimentell wurde gezeigt, dass Astrozyten und Mikroglia die Gliomprogression und Invasion 8 , 9 , 10 erhöhen, aber die Zusammensetzung aller Gliazellen in der nativen menschlichen Gehirnmikroumgebung ist unbekannt.

Wir haben zuvor gezeigt, dass mikroumweltliche Komponenten das Überleben des Patienten durch quantitative Analyse der zellulären Komponenten der Glioblastom-Mikroumgebung vorhersagen und unsere Analysen in ein proportionales Gefahrenmodell 11 einbinden können. Hier beschreiben wir die quantitative Analyse Methode zur Identifizierung der Populationen von Gliazellen innerhalb der Tumor-Masse und angrenzenden Regionen der Tumor-Resektionen von Glioblastom-PatientenS. Wir verwendeten die chromogene Immunhistochemie, um die Gliazellpopulationen und ImageJ zu identifizieren, um die prozentuale Abdeckung der Färbung für jede Gliapopulation zu analysieren. Die Beurteilung der prozentualen Abdeckung schafft eine einfache Messung zur Bestimmung der morphologischen Unterschiede der Zellen, insbesondere derjenigen, die durch Wechselwirkungen mit Krebszellen betroffen sind. Frühere Studien zur Quantifizierung der histopathologischen Färbung verwenden Standardfärbung wie Hämatoxylin und Eosin 12 oder Masson's Trichrom 13 , die nicht die Spezifität der Antikörper-basierten Immunhistochemie-Färbung nutzen. Unsere Methode wurde entwickelt, um die Gliapopulationen innerhalb der Glioblastom-Patienten-Tumor-Resektionen direkt zu quantifizieren, die wir zur Aufklärung der komplexen Glioblastom-Mikroumgebung anstreben.

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Protokoll

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Dieses Protokoll identifiziert zelluläre Komponenten in Formalin-fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Proben, wie es für klinische Patientenproben typisch ist. Paraffin Einbettung ermöglicht die beste Aufrechterhaltung der Zell-und Gewebe-Morphologie sowie eine bessere Langlebigkeit der Abschnitte. Die Proben für diese Analyse wurden durch die University of Virginia Biorepository und Tissue Research Facility zugegriffen. Patientenproben wurden von einem Neuropathologen ausgewählt, der auf einer endgültigen Diagnose des Glioblastoms (Astrozytom, WHO-Grad IV) basierte, der zwischen 2010 und 2013 an der Universität von Virginia Tumorresektionen abgeschlossen hatte und vor dieser Analyse entdeckt wurde 11 .

1. FFPE-Probenentparaffinierung und Rehydratation

HINWEIS: Dieser Teil des Protokolls ist spezifisch für FFPE-Proben. Während Paraffin-eingebettete Proben für diese Analyse aufgrund der Konservierung von zellulären und t nützlicher sein könnenIssue Morphologie, diese Analyse kann auch mit eingefrorenen Abschnitten durchgeführt werden. Bei Verwendung von gefrorenen Abschnitten kann dieser Teil weggelassen werden und gehen direkt zur chromogenen Immunhistochemie über.

  1. Führen Sie die folgenden Waschungen für jeweils 5 min aus: Xylol, Xylol, 100% Ethanol, 100% Ethanol, 95% Ethanol, 95% Ethanol, 70% Ethanol, entionisiertes Wasser, entionisiertes Wasser

2. Antigen Retrieval

HINWEIS: Dieser Teil des Protokolls ist notwendig, um die bei der Formalin-Fixierung von FFPE-Proben gebildeten Methylenbrücken zu brechen und Antigen-Stellen für Antikörper zu binden.

  1. Verdünnen Sie die Tris-basierte Hoch-pH-Antigen-Entmaskungslösung bei der Herstellerempfehlung in destilliertem Wasser.
  2. Führen Sie eine wärmevermittelte Antigen-Retrieval mit einer Mikrowelle durch. Andere Formen der wärmevermittelten Retrieval (wie Dampfkochtopf, Gemüsedampfer oder kochendes Wasser) würden ebenfalls ausreichen.
    1. Die verdünnte Entlüftungslösung in eine nicht versiegelte mikrowellengeeignete gebenSchiff. Legen Sie die Schienen in das Gefäß. Legen Sie Dias in Mikrowelle.
    2. Kochen für 20 min bei hoher Leistung. Überwachen Sie die Flüssigkeitsspiegel für die Verdunstung und füllen Sie mit destilliertem Wasser nach Bedarf.
  3. Proben in 1 Stunde bei Raumtemperatur abkühlen lassen.

3. Chromogene Immunhistochemie

  1. Umrisse Gewebeprobe mit einem hydrophoben Stift, um das Volumen der Reagenzien zu minimieren, die notwendig sind, um die Probe zu bedecken.
    HINWEIS: Seien Sie sicher, dass die Gewebeproben hydratisiert werden und lassen Sie sie nicht austrocknen, da dies die Verfärbungswirkung beeinträchtigen wird.
  2. Pipet genug Permeabilisierungslösung (Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) + 0,01% Triton-X) zur Deckung der Gewebeprobe (typischerweise etwa 100 - 200 μl).
  3. Entfernen und verwerfen Sie die Lösung und wiederholen Sie Schritt 3.2.
  4. Inkubieren von Proben bei Raumtemperatur mit Blockierungslösung (2,5% Pferdeserum + Permeabilisierungslösung).
  5. Inkubieren Sie Proben über Nacht in 4 ºC mit primären Antikörpern verdünntIn Blockierlösung
    HINWEIS: Alle hier verwendeten Primärantikörper werden bei 1: 200 verdünnt, aber optimale Verdünnungen können mit seriellen Verdünnungen beginnend mit Herstellerempfehlung bestimmt werden. Detaillierte Informationen zu den in diesem Protokoll verwendeten Antikörpern wurden zuvor veröffentlicht 11 .
  6. Detektion von primären Antikörpern unter Verwendung eines Meerrettich-Peroxidase-Polymerreagenzes, das dem primären Antikörper-Wirtstier entspricht, nach dem Herstellerprotokoll.
  7. Pipet genug Permeabilisierungslösung zur Deckung der Gewebeprobe und inkubieren für 5 min.
  8. Entfernen und entwerfen Lösung und wiederholen Sie Schritt 3.7.
  9. Inkubieren von Objektträgern in 0,3% H 2 O 2 in 1x TBS für 15 min.
  10. Entwickeln Sie Proben mit einem Peroxidase-Diaminobenzidin (DAB) -Substrat für 2 - 10 min, bis die gewünschte Fleckenintensität erreicht ist.
  11. Gegenstichproben zur Identifizierung von Zellkernen, wie z. B. mit Hämatoxylin, nach Herstellerprotokoll.
  12. Proben mit 100%Ethanol und Xylol.
  13. Befestigen Sie die Proben dauerhaft mit dem Montagemedium.

4. Zinsanweisungen

  1. Bild-Dias unter Hellfeld-Mikroskopie in der Lage, hochauflösende Bilder.
    HINWEIS: Verwenden Sie bildgebende zellulare Komponenten mit einer Auflösung von mindestens 20x.
  2. Bewegen Sie die Kamera zu bestimmten Regionen von Interesse in Gewebeproben.
  3. Bilder als TIFF-Dateien zur Quantifizierung speichern

5. Bildanalyse

  1. Öffnen Sie Bilder in ImageJ für die Quantifizierung der prozentualen Abdeckung.
  2. Verwenden Sie das Threshold Color Plugin, um die lila Farbe von Hämatoxylin-gefärbten Kernen zu entfernen.
  3. Bild in 8-Bit umwandeln.
  4. Schwellenwert ohne dunklen Hintergrund hinzufügen.
  5. Prozessbild unter Verwendung eines der 17 vorgespannten ImageJ-Schwellenfilter ( dh MaxEntropy), so dass nur DAB-gefärbte Teile in der Schwelle enthalten sind.
    HINWEIS: Wählen Sie den optimierten vorgespannten Schwellenfilter, der minimiertEs Einbeziehung der Hintergrundfärbung. Dies kann von der Qualität der Färbung und Spezifität des Antikörpers abhängen. Verwenden Sie die gleiche Schwelle für alle technischen Replikate innerhalb jeder Patientenprobe.
  6. Schwellenwert anwenden
  7. Messen Sie den prozentualen Bereich des Schwellenwertes.
  8. Durchschnittliche prozentuale Flächendeckung für mehrere Regionen innerhalb jeder Probe.

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Ergebnisse

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Für diese Analyse wurden zwei Interessenbereiche innerhalb unserer Tumorresektionen - die primäre Tumormasse und die angrenzenden Regionen, die in erster Linie aus gesundem Gewebe mit diffus eindringenden Krebszellen zusammengesetzt waren ( Abbildung 1A , 1B ) - durch die Zusammenarbeit von Neuropathologen an Hämatoxylin- und Eosin-gefärbten Patienten identifiziert Proben. Innerhalb jeder Patientenprobe wurde eine positive Färbung für Astroz...

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Diskussion

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Unsere hier vorgeschlagene Methode ist ein quantitativer Ansatz zur Analyse von histologischen Proben, die mit der traditionellen chromogenen Immunhistochemie gefärbt wurden. Die aktuelle Methodik für diese Art von Analyse umfasst ähnliche Färbeprotokolle, gefolgt von der Einstufung durch unabhängige Pathologen. Diese Methode ist zuverlässig, aber für eine Reihe von Anwendungen ist ein präziseres Verständnis der zellulären Make-up erforderlich, wie ein besseres Verständnis der Heterogenität im Zusammenhang mit Tumoren u...

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Danksagungen

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Die Autoren danken Drs. Fahad Bafakih und Jim Mandell für die Erfassung und Identifizierung von Patientenproben, Garrett F. Beeghly für die Unterstützung der Immunhistochemie sowie die Biorepository und Tissue Research Facility, das Herz-Kreislauf-Forschungszentrum Histology Core und die Biomolekulare Analyse-Fazilität an der University of Virginia für die Unterstützung mit Probenerfassung, Immunhistochemie und Bildgebung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
XylolFisher ChemicalX3P
Ethanol
Antigen-Demaskierungslösung mit hohem pH-WertVector LabsH-3301
TBS
Triton-XAmresco9002-93-1
Pferdeserum
Anti-ALDH1L1 abcam ab56777
Anti-Iba1 abcam ab5076
Anti-Oligodendrozyten-spezifisches Protein1 abcam ab53041
ImmPRESS Anti-ZiegeVector LabsMP-7405
ImmPRESS Universal (Anti-Maus/Kaninchen)Vector LabsMP-7500
WasserstoffperoxidSigma AldrichDAB-Substrat
Vector LabsSK-4105
Hämatoxylin-GegenfärbungThermoScientific72404
Histochoice EindeckmedienAmrescoH157-475
Aperio ScanscopeLeica Biosystems
Image ScanscopeLeica Biosystems
Super HT PAP PenResearch Products International195506
216763 ImmPACT

Referenzen

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