Epidermale Keratinozyten bilden eine funktionelle Hautbarriere und sind an der Frontlinie der Wirtsverteidigung gegen äußere Umweltbeleidigungen positioniert. Hier beschreiben wir Methoden zur Isolierung und Primärkultur von epidermalen Keratinozyten aus neonataler und erwachsener Maushaut und Induktion der terminalen Differenzierung und UVB-ausgelösten Entzündungsreaktionen von Keratinozyten.
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Methodenartikel
Isolierung und Kultur der primären Maus Keratinozyten aus neonatalen und erwachsenen Maus Haut
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der Keratinozyt (KC) ist der vorherrschende Zelltyp in der Epidermis, der äußersten Schicht der Haut. Epidermale KCs spielen eine entscheidende Rolle bei der Bereitstellung von Hautverteidigung durch die Bildung einer intakten Hautbarriere gegen Umwelt-Beleidigungen, wie UVB-Bestrahlung oder Pathogene, und auch durch die Einleitung einer entzündlichen Reaktion auf diese Beleidigungen. Hier beschreiben wir Methoden, um KCs von der neonatalen Maushaut und von der erwachsenen Mausschwanzhaut zu isolieren. Wir beschreiben auch Kultivierungsbedingungen mit definierten Wachstumsergänzungen (dGS) im Vergleich zu Chelex-fötalem Rinderserum (cFBS). Funktionell zeigen wir, dass sowohl neonatale als auch erwachsene KCs in hohem Maße auf eine hohe Calcium-induzierte terminale Differenzierung, eine enge Kreuzungsbildung und -schichtung ansprechen. Darüber hinaus sind kultivierte erwachsene KCs anfällig für UVB-ausgelösten Zelltod und können große Mengen an TNF bei UVB-Bestrahlung freisetzen. Gemeinsam sind die hier beschriebenen Methoden für Forscher für den Aufbau des In-vitro- Modells von NutzenS, um die epidermale Biologie in der neonatalen Maus und / oder der erwachsenen Maus zu studieren.
Einleitung
Die Haut ist das größte Organ im Körper mit der Epidermis als die äußerste Schicht. Die Epidermis spielt eine entscheidende Rolle bei der Bildung einer intakten epidermalen Barriere, um den Körper von der Umwelt zu trennen und verhindert so Wasserverlust und schützt vor Umweltbeleidigungen wie Allergenen, Krankheitserregern und UVB-Exposition. Die Epidermis entwickelt sich aus einer einzigen Schicht von undifferenzierten basalen Keratinozyten (KCs) zu einem mehrschichtigen, geschichteten Epithel, bestehend aus einer Basalschicht, gefolgt von einer Dornschicht, einer körnigen Schicht und einem Stratum corneum. Basale KCs, bestehend aus epidermalen Stammzellen und tran....
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Protokoll
Alle Tierversuche werden vom UCSD Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt.
1. Primäre Maus KC Isolierung und Kultur aus neonatalen Haut
- Opfer der postnatalen Tag 0-2 Neugeborenen aus dem C57B / 6 Wildtyp-Maus-Stamm durch Enthauptung mit Schere. Schneide die Glieder kurz über dem Handgelenk und den Knöchelgelenken ab, schneide dann den Schwanz ab und läßt ein kleines Loch zu.
- Um die ganze Haut abzuschälen, schlage die scharfe Schere durch das Loch am Schwanz und schneide die Haut entlang der dorsalen Mittellinie des Körpers auf die Öffnung am Hals. Als nächstes verwenden Sie eine Pinzette, um den ....
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Ergebnisse
Hohe Calcium-induzierte terminale Differenzierung von neonatalen und erwachsenen KCs. Die primäre Maus epidermalen KCs ausplattiert und gehalten bei 0,06 mM CaCl 2 wuchs als Monoschicht, und einzelne Zellen hatten eine polygonale Form mit deutlichen Interzellularraum, zeigt einen Pflasterstein Aussehen , wenn konfluent (1A und 2A). Anheben des CaCl 2 bis 0,2 mM induziert eine rasche Änderun.......
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Diskussion
Die Haut-Epidermis fungiert als eine kritische Barriere, um den Körper von der äußeren Umgebung zu trennen und zu schützen und Schäden durch Wasserverlust, Krankheitserreger, Hitze und UV-Bestrahlung. Die KCs sind die vorherrschende Zelllinie der Epidermis, und die Primärkultur der epidermalen KCs ist ein nützliches Werkzeug, um die biologischen Prozesse der Barrierebildung und die Reaktion von KCs auf Umweltbeleidigungen in vitro zu untersuchen und zu verstehen.
Hier beschreiben wi.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von NATIONAL INSTITUTE OF ARTHRITIS UND MUSKULOSKELETAL UND HAUTKRANKHEITEN gewährt (R01AR069653 bis Zhang LJ) und National Institutes of Health Support (5T32AR062496-03 bis CA).
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| C57BL/6 Neugeborene oder adulte Wildtyp-Mäuse | Jackson Laboratory | 000664 | Wildtyp-Mäuse (ursprünglich vom Jackson Laboratory gekauft) werden an der UCSD in tierischen Vivarien gezüchtet und gepflegt. |
| KC Basalmedium (EpiLife) | Invitrogen, Carlsbad, CA | MEPICF500 | Basalmedium für Keratinozytenkulturen mit 0,06 mM CaCl2 |
| Defined Growth Supplement (dGS) | Invitrogen, Carlsbad, CA | S0125 | definierte Wachstumszusätze für Kulturmedium |
| Dispase-Pulver | Invitrogen, Carlsbad, CA | 17105041 | Enzym zur Dissoziation der Epidermis von der Dermis |
| Attachment Factor | Invitrogen, Carlsbad, CA | S006100 | Beschichtungsmaterial auf Gelatinebasis |
| Beschichtungsmatrix | Invitrogen, Carlsbad, CA | R011K | Beschichtungsmaterial auf Kollagenbasis |
| TrypLE | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12604-013 | Ein schonendes Trypsin-ähnliches Enzym zur Dissoziation von Keratinozyten aus der Epidermisschicht |
| 100 μm m Zellsieb Nylonnetz | Corning | 352360 | |
| CCK-8 Zellviabilitätskit | Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD | CK04-11 | |
| Maus TNF (Mono/Mono) ELISA Set II | BD Biosciences, San Jose, CA | 555268 | |
| kabelgebundene tragbare UV-Lampen | Spectronics, Westbury, NY | EB-280C | |
| 8-Watt UV-Röhren | Spectronics, Westbury, NY | BLE-8T312 | |
| Inverses Lichtmikroskop für Zellkulturen | ZEISS, Jena, Deutschland | Axio Observer | |
| Fluoreszenzmikroskop | Olympus | BX41 |
Referenzen
- Mauro, T., et al. Acute barrier perturbation abolishes the Ca2+ and K+ gradients in murine epidermis: quantitative measurement using PIXE. J Invest Dermatol. 111 (6), 1198-1201 (1998).
- Menon, G. K., Grayson, S., Elias, P. M.
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Nachdrucke und Genehmigungen
