Wir beschreiben ein HPLC-basiertes Verfahren zur Bestimmung von N-Acetylneuraminsäure und N-Glykolylenuraminsäure in Mausleber und Milch.
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Methodenartikel
Bestimmung von Sialinsäuren in Leber- und Milchproben von Wildtyp und
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
CMAH (Cytidinmonophosphat-N-acetylneuraminsäure-hydroxylase) ist verantwortlich für die Oxidation von Cytidinmonophosphat-N-acetylneuraminsäuren bei Säugetieren. Jedoch kann der Mensch Cytidinmonophosphat-N-acetylneuraminsäure nicht zu Cytidinmonophosphat-N-glykolylneuraminsäure aufgrund einer primären Exon-Deletion des CMAH- Gens oxidieren. Um die Effekte und Implikationen des Mangels an CMAH-Aktivität genauer zu verstehen, ist ein Cmah- Knock-out-Modell bei Mäusen von großem Interesse an Grund- und angewandter Forschung. Das Analyseverfahren zur Bestimmung des Phänotyps dieses Mausmodells wird hier im Detail beschrieben und basiert auf dem Nachweis sowohl der N-Acetylneuraminsäure als auch der N-Glykolylenuraminsäure in der Leber und der Milch von Wildtyp- und Cmah- Knock-out-Mäusen. Endogene Sialinsäuren werden freigesetzt und mit o-Phenylendiamin derivatisiert, um fluorogene Derivate zu erzeugen, die anschließend mittels HPLC analysiert werden können. Das vorgestellte Protokoll kann seinAuch für die Analyse von Milch und Gewebeproben aus verschiedenen anderen Ursprüngen angewendet und kann von Nutzen sein, um die ernährungs- und gesundheitlichen Auswirkungen von N-Glykolylneuraminsäure zu untersuchen.
Einleitung
N-Acetylneuraminsäure (Neu5Ac) und N-Glykolylneuraminsäure (Neu5Gc) sind die häufigsten Sialinsäuren bei den meisten Säugetieren 1 . Obwohl es in der Lage ist, Neu5Ac endogen zu synthetisieren, sind die Menschen nicht in der Lage, Neu5Gc aufgrund einer primären Exon-Deletion auf dem CMAH- Gen, das für eine CMP-Neu5Ac-Hydroxylase 2 , 3 kodiert , zu produzieren . Allerdings können tierische Lebensmittelprodukte diätetische Quellen von Neu5Gc 4 , 5 , 6 sein , was zur Herstellu....
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Protokoll
Verfahren, die Tierfächer betreffen, wurden vom Ethischen Komitee des Experimentellen Tierzentrums der Nanjing Agricultural University im Einklang mit den nationalen Richtlinien für das experimentelle Tierschutz (Ministerium für Wissenschaft und Technologie, PR von China, 2006) mit den Tieren, die in einem SPF untergebracht wurden, genehmigt (Berechtigungs-ID: SYXK-J-2011-0037).
1. Cmah Knock-out Maus Modell
- Verwenden Sie Wildtyp-C57Bl / 6-Mäuse aus dem Vergleichsmedizinzentrum der Universität von Yangzhou (China).
HINWEIS : Cmah- Knock-out-Mäuse wurden basierend auf den Informationen aus frühe....
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Ergebnisse
Ein schematischer Überblick über das beschriebene Analyseverfahren ist in Abbildung 1 dargestellt und beinhaltet die Isolierung von Sialinsäuren aus Milch- und Leberproben von Wildtyp- und Cmah- Knockout-Mutanten-Mäusen sowie die Fluoreszenz-Derivatisierung und HPLC-Analyse dieser Komponenten. Abbildung 2 und Abbildung 3 zeigen repräsentative HPLC-Chromatogramme von derivatisierten Sialinsä.......
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Diskussion
Das hier beschriebene Protokoll erlaubt die phänotypische Beurteilung von homozygoten Cmah- Knock-out-Mäusen durch Analysieren und Quantifizieren der relativen Mengen an Neu5Gc Milch und Leberproben. Die Analyse wurde unter Verwendung eines Standard-HPLC-Setups mit Fluoreszenzdetektion durchgeführt. Der wichtigste Schritt dieses Verfahrens ist die Herstellung der Anionenaustauschsäulen und die Durchführung der Anionenaustauschchromatographie; Um das Harz richtig zu regeln und die richtigen Wasch- und Elutionsfr.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde zum Teil von der Naturwissenschaftlichen Stiftung von China (Zuschussnummern 31471703, A0201300537 und 31671854 an JV und LL) und dem 100 Foreign Talents Plan (Zuschussnummer JSB2014012 an JV) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Chemikalien: | |||
| N-Acetylneuraminsäure | Sigma | A0812 | |
| N-Glykolylneuraminsäure | Sigma | 50644 | 1 mg Aliquot sollte ausreichend sein |
| o-Phenylendiamin | Sigma | 694975 | |
| Natriumhydrogensulfit | J& K Scientific Ltd | 75234 | |
| Werkzeuge/Materialien: | |||
| Supelco | Sigma 57024 | leere Festphasen-Extraktionssäulen | |
| Luer-Absperrhahn | Sigma | S7396 | zum Stoppen des Durchflusses des SPE-Röhrchens |
| Dowex 1X8 | Dow Chemicals | Sigma 44340 | 200 - 400 mesh |
| Dounce Gewebeschleifer | Sigma | D8938 | tight fit |
| HPLC Analyse: | |||
| High-Recovery HPLC Fläschchen | Agilent Technologies | #5188-2788 | |
| HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
| Fluoreszenzdetektor für HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
| HPLC Säule | Phenomenex | Hyperclone ODS | 250 x 4,6 mm |
| LCMS-Qualität H2O | Merck Millipore | #WX00011 | |
| LCMS-Qualität Acetonitril | Merck Millipore | #100029 | Hypergrade |
| Ammoniumhydroxidlösung | Fluka | #44273 | puriss. |
Referenzen
- Lamari, F. N., Karamanos, N. K. Separation methods for sialic acids and critical evaluation of their biologic relevance. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 781 (1-2), 3-19 (2002).
- Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A.
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Nachdrucke und Genehmigungen
