Methodenartikel

Bildgebung des primären Hirnrinde Zellen unter Verwendung einer 2D Kultursystem zu leben

DOI:

10.3791/56063

⸱

9. August 2017

 ,  ,  ,  , 
1Brain Institute, Federal University of Rio Grande do Norte, 2Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich, 3The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Live Imaging ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur zelluläre Verhaltensweisen in Echtzeit zu studieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Time-Lapse Video-Mikroskopie des primären Hirnrinde Zellen, die eine detaillierte Untersuchung der Phasen verordnet während der Linie Weiterentwicklung von primäre neurale Stammzellen zu differenzierten Neuronen und Glia ermöglichen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Während der Großhirnrinde Entwicklung durchlaufen Vorläuferzellen mehrere Runden von symmetrischen und asymmetrischen Zellteilungen, neue Vorfahren oder postmitotischen Neuronen zu generieren. Später wechseln Sie einige Stammväter in ein Gliogenic Schicksal, Hinzufügen der Astrozyten und Oligodendrozyt Bevölkerung. Mit Time-Lapse Video-Mikroskopie von primären Hirnrinde Zellkulturen, ist es möglich, die zellulären und molekularen Mechanismen, die Kontrolle der Zellteilung und Zellzyklus-Parameter der Vorläuferzellen zu studieren. In ähnlicher Weise kann das Schicksal der postmitotischen Zellen mit fluoreszierenden Reporter zellspezifische Proteine oder Post-imaging Immunocytochemistry untersucht werden. Noch wichtiger ist, können alle diese Funktionen Ebene der einzelligen, ermöglicht die Identifizierung von Vorfahren verpflichtet die Generation von bestimmten Zelltypen analysiert werden. Manipulation der gen-Expression kann auch mit viral-vermittelte Transfektion, ermöglicht die Untersuchung der Zelle-autonome und Zelle-nichtautonomen Phänomene durchgeführt werden. Schließlich ermöglicht die Verwendung von fluoreszierenden Fusionsproteine die Studie von symmetrischen und asymmetrischen Verteilung der ausgewählten Proteine während der Teilung und die Korrelation mit dem Schicksal der Tochterzellen. Hier beschreiben wir die Time-Lapse Video-Mikroskopie-Methode, um Bild primären Hirnrinde murinen Zellen für bis zu mehreren Tagen und die Art der Zellteilung, Zellzyklus Länge und Schicksal der neu erzeugten Zellen zu analysieren. Wir beschreiben auch eine einfache Methode um transfizieren Vorläuferzellen, die Gene von Interesse zu manipulieren oder einfach beschriften Zellen mit Reporter Proteine angewendet werden können.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurale Stammzellen (NSC) generieren Neuronen und Macroglial Zellen während der Entwicklung der Großhirnrinde. Am Anfang-Kortikogenese NSCs durchlaufen mehrere Runden der symmetrischen Zellteilung, und erweitern Sie den Stammvater Pool. Teilen Sie dann die NSCs asymmetrisch um Neuronen direkt oder indirekt über Zwischenprodukte1zu generieren. Nur bei wechseln Mitte - zu spät-Kortikogenese, Stammväter um Astrozyten und Oligodendrozyten2,3,4zu generieren. Die komplette Mechanismen, die Zell-Proliferation und Differenzierung sowie der Beitrag der Schicksal eingeschränkt Stammväter zur Generation der einzigartige Arten von Neuronen oder Macroglial Zellen steuern bleiben jedoch eine Angelegenheit der intensiven Debatte4,5,6. Das Potenzial der einzelnen kortikalen NSCs, Neuronen und Astrozyten, Oligodendrozyten generieren wurde ausgiebig studiert in Vitro und in Vivo mit einer Vielzahl von Techniken wie: live-imaging in einzellige Kulturen7,8,9,10,11,12,13; Live-imaging in hoher Dichte Kulturen Kulturen3,14,15; Live-imaging Slice Kulturen16,17,18; klonale Analyse mit viralen Vektor-vermittelte genetische Kennzeichnung in hoher Dichte Kulturen14,15,19,20,21; klonale Analyse in Vivo mit Retroviren22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33; und klonale Analyse in Vivo mit transgenen Tieren34.

Jede dieser Techniken stellt vor- und Nachteile. Zum Beispiel ist in Vivo Linie Ablaufverfolgung anfällig für die ZUSAMMENGEFASSUNG und splitting Fehler3, führt zu widersprüchlichen Schlussfolgerungen über das Potenzial der einzelnen kortikalen Vorfahren. Darüber hinaus sowohl in Vitro und in Vivo Studien anhand der Kennzeichnung von Vorläuferzellen zu frühen Zeitpunkten und posterior Analyse der Zelle Linien kann durch das unerkannt Auftreten von Zelltod während Abstammung-Progression35beeinflusst werden. Daher darf ein geeignetes System, das Potenzial der einzelnen NSCs zu analysieren die Identifikation aller Zellen generiert sowie die entsprechenden Charakterisierung der Zelle Schicksale innerhalb der Linie. Kombination von primären Zellkulturen und live Imaging ermöglicht diese Einstellung. Mit einzelligen Kultur und Time-Lapse video-Mikroskopie, zeigten Tempel Et Al. den Schalter in der Abstammung der einzelnen Großhirnrinde Stammväter von Neurogenese, Gliogenesis11. Später benutzt sie das gleiche System um zu zeigen, dass verschiedene Arten von Neuronen aus einer einzigen kortikalen Stammvater12generiert werden. Dieses System stellt jedoch eine wichtige Einschränkung: nur 1 % der kortikalen Vorfahren isoliert am frühen Kortikogenese Klone von 4 oder mehr Nachkommen9generieren. Nach der Zugabe von FGF2 erhöht die Frequenz der Zellen, die Erzeugung von 4 oder mehr Zellen auf ca. 8-10 %9. Dennoch ist diese Zahl zu klein, man bedenkt, dass praktisch alle kortikalen Stammväter proliferative in diesem Stadium. Darüber hinaus können nicht die möglichen Auswirkungen der FGF2 auf Schicksal-Spezifikation36auszuschließen. Um diese Einschränkungen zu umgehen, verwendet wir High-Density-Zellkulturen, die unterstützen die Verbreitung beider ventrikuläre (Pax6-Ausdruck) und subventricular (Tbr2-Ausdruck) kortikale Stammväter15. Darüber hinaus hat die Echtzeit-Beobachtung dieser Kulturen gezeigt, dass einige Funktionen der NSC Abstammung Progression unter diesen Bedingungen, wie z. B. Art der Zellteilung, Verlängerung des Zellzyklus, Potenzial einzelner Zellen, Neuronen und Glia, unter anderem zu generieren3,15reproduziert werden. Vor kurzem haben wir auch dieses System verwendet, um zu zeigen, dass das Überleben der Zellen von unreifen Großhirnrinde Neuronen in Mäusen37CREB-Signalisierung beeinflusst werden. So glauben wir, dass Time-Lapse Video-Mikroskopie des primären murinen Großhirnrinde Zellen in hoher Dichte angebaut ist ein leistungsstarkes und zugänglichen Tool, zellulären und molekularen Mechanismen der Zellzyklus Progression, Zellteilung, Überleben der Zellen und Zellen Schicksal Spezifikation zu studieren. Letzteres kann erreicht werden mit transgenen Tieren, so dass die Identifizierung von spezifischen Zelle Schicksale auf Echtzeit38,39,40 oder die Verwendung von Post-imaging Immunocytochemistry3,38,41,42.

Hier bieten wir eine Schritt für Schritt Protokoll zur primären Hirnrinde Zellkultur Unterstützung der Verbreitung von NSCs und die nachfolgende Generation von Neuronen und Macroglial Zellen vorbereiten. Wir diskutieren auch die Verwendung von Retroviren vermittelte Transfektion, Genexpression einzelner Zellen zu manipulieren, die identifiziert und Ebene der Einzeller mit Time-Lapse video Mikroskopie nachverfolgt werden können. Dieses Protokoll kann zur primären Hirnrinde Zellen isoliert vom Anfang bis zum Ende des Kortikogenese bei Nagetieren zu studieren können, ein paar Anpassungen jedoch nach der Stufe14. NSCs, die isoliert von anderen Quellen können auch mit Time-Lapse video Mikroskopie 2D Kulturen studiert werden, aber das geeignete Kultivierung System festgelegt werden, durch den Vergleich der Zelle Verhalten in Vitro und in Vivo38,43.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Versuche mit lebenden Tieren, die in diesem Protokoll beschrieben werden, werden gemäß den nationalen und internationalen Gesetzen durchgeführt und wurden vom lokalen University Animal Care and Use Committee (CEUA/UFRN) unter der Lizenz 009/2014 genehmigt. Das folgende Protokoll wird in einer sterilen Umgebung durchgeführt. Vertrautheit mit grundlegenden Zellkulturen wird erwartet.

1. Dorsolaterale Telencephalon-Mikrodissektion

  1. Bereiten Sie das Seziermedium (100 mL) vor: 98,5 mL Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), 0,5 mL 5 M HEPES pH 7,4, 1 mL Penicillin/Streptomycin (10.000 Einheiten/mL und 10.000 μg/mL).
  2. Sterilisieren Sie das Dissektionsmedium mit einem Filter.
  3. Entnahme von embryonalen Embryonen am Tag 14 (E14) einer trächtigen Maus C57/Bl6 (Mus musculus) unter Narkose mit Isofluran.
    HINWEIS: Betrachten Sie E0 als den Tag der Erkennung des Vaginalplugs. Die Dissektion sollte spätestens 1 Stunde nach der Entnahme aus der trächtigen Maus abgeschlossen sein. Dieses Protokoll gilt auch für die Embryonen E11-E17.
  4. Entnahme der Embryonen durch Hysterektomie unter sterilen Bedingungen.
  5. Übertragen Sie die Embryonen in eine Petrischale mit kaltem Präpariermedium (4 °C).
  6. Entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel, indem Sie entlang der Längsfissur schneiden. Die Anzahl der Embryonen variiert in der Regel zwischen fünf und zehn. Jedes E14-Gehirn liefert etwa 2 x 106 Zellen, einschließlich Vorläuferzellen und postmitotischer Neuronen (Verhältnis 1:1)
    HINWEIS: Verwenden Sie das Stereomikroskop für die folgenden Schritte.
  7. Entfernen Sie die Hirnhäute mit einer Präparierzange. Teile das Telencephalon in der Mitte, um die Hemisphären zu trennen. Um das dorsolaterale Telencephalon zu isolieren, schneiden Sie mit einer Dissektionszange entlang der dorsomedialen Kurve und der pallial-subpallialen Grenze. Das dorsolaterale Telencephalon wird in ein 2-ml-Röhrchen mit Kaltdissektionsmedium (4 °C) überführt, bis alle Gehirne präpariert sind.

2. Zelldissoziation und Beschichtung

  1. Bereiten Sie das Proliferationsmedium vor (50 ml DMEM + 10 % FCS): 44 ml Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), 5 ml fötales Kälberserum (FCS), 0,5 ml 40 % Glukose, 0,5 ml Penicillin/Streptomycin (10.000 Einheiten/ml und 10.000 μg/ml). Sterilisieren Sie das Proliferationsmedium.
  2. Bereiten Sie das Differenzierungsmedium vor (50 mL DMEM + 2 % B27): 48 mL DMEM, 1 mL B27, 0,5 mL 40 % Glucose, 0,5 mL Penicillin/Streptomycin (10.000 Einheiten/ml und 10.000 μg/ml). Filtrieren Sie das Differenzierungsmedium.
  3. Nach der Mikrodissektion des dorsolateralen Telencephalons von E14-Mäusen wird das Röhrchen mit dem gesammelten Gewebe und dem Kaltdissektionsmedium (für 5 min bei 4 °C, 340 x g) zentrifugiert, um das Gewebe auszufällen.
  4. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und fügen Sie 1 ml vorgewärmtes (37 °C) Trypsin-EDTA (0,05 %) für den chemischen Aufschluss hinzu. 15 Minuten bei 37 °C inkubieren. 2 ml Proliferationsmedium hinzufügen, um die Trypsinaktivität zu stoppen.
  5. Polieren Sie die Spitze einer Pasteurpipette aus Glas über einem Gasbrenner oder Bunsenbrenner einige Sekunden lang, um die Öffnung etwas zu verkleinern. Waschen Sie die Pipette, indem Sie FCS absaugen, um die Spitze zu beschichten. Um Blasen zu vermeiden, dissoziieren Sie die Zellen mechanisch mit einer feuerpolierten und FCS-beschichteten Pasteur-Pipette.
  6. Die Zellen zentrifugieren (5 min bei 4 °C, 340 x g). Überstand mit einer Pipette entfernen. Geben Sie 1 ml Proliferationsmedium hinzu und resuspendieren Sie die Zellen mit einer Pipette. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
  7. Bereiten Sie eine 1:1-Verdünnung der Zellsuspension mit einer 0,4%igen Trypanblau-Lösung vor. Nicht lebensfähige Zellen werden blau angezeigt. Zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen (ungefärbt) mit einer Neubauer-Kammer.
  8. Verdünnen Sie die Zellen in Proliferationsmedium, um 106 Zellen/ml zu erhalten. Geben Sie 500 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte (ca. 2,5 × 105 Zellen/cm2). Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5 % CO2,
    HINWEIS: Verwenden Sie keine Abdeckgläser aus Glas, da diese sich während des Versuchs bewegen und das Betrachtungsfeld verändern können. Alternativ können Sie auch Gewebekulturplatten mit Glasboden verwenden.
    HINWEIS: Wenn Sie keine mit Zellkulturen behandelten multidished Platten verwenden, ist es wichtig, Ihre Platten 2 h bei 37 °C mit Poly-D-Lysin (50 μg/ml) vorzubehandeln. PDL-behandelte Platten können nach dem Waschen mit destilliertem Wasser bei 4 °C gelagert werden.

3. Retrovirale vermittelte Transfektion

HINWEIS: Dies ist eine einfache Methode, um nur Vorläuferzellen zu transfizieren. Es können jedoch auch andere virale Vektoren oder chemische/elektrische Transfektion verwendet werden, um Gene von Interesse in kultivierte Zellen einzufügen.

  1. Um die Genexpression zu manipulieren und Zellen mit fluoreszierenden Reporterproteinen zu markieren, fügen Sie Retroviren hinzu, die Plasmide mit Genen von Interesse tragen, 2 h nach der Zellbeschichtung.
    HINWEIS: Retrovirale Vektoren integrieren sich nur in das Genom von sich teilenden Zellen. Daher ist es wichtig, Zellen zu infizieren, wenn die Proliferation hoch ist.
    HINWEIS: Wir verwendeten ein Plasmid, das die Beta-Aktin/CMV-Fusionssequenz (CAG) und eine interne ribosomale Eintrittsstelle (IRES) enthält, gefolgt von der kodierenden Sequenz für das grün fluoreszierende Protein (GFP), die als pCAG-IRES-GFP44 bezeichnet wird. Gene von Interesse konnten zwischen dem CAG-Promotor und der IRES-Sequenz kloniert werden37.
  2. Verdünnen Sie das Retrovirus in einem Differenzierungsmedium, um die gewünschte Anzahl von Partikeln pro ml zu erhalten. In jede Vertiefung werden 500 μl Differenzierungsmedium mit Retrovirus gegeben.
    HINWEIS: Die Menge der verwendeten Retroviren hängt von seinem Titer ab und sollte so berechnet werden, dass 50 bis 100 infizierte Zellen pro Vertiefung erhalten werden. Dieser Titer ermöglicht die Identifizierung isolierter GFP-exprimierender Klone, deren Verwandtschaft durch die Verfolgung von Phasenkontrastbildern weiter bestätigt werden kann (siehe Abschnitt 6). Die Titration des Retrovirus sollte mit der gleichen Zellpopulation durchgeführt werden45.

4. Zeitraffer-Videomikroskopie

HINWEIS: Dieser Schritt erfordert ein inverses Fluoreszenzmikroskop mit Inkubationskammer (siehe Materialtabelle).

  1. Nach der Retrovirus-Infektion wird die Gewebekulturplatte in einen Inkubator gestellt, der mit Temperatur- und CO2 -Reglern verbunden ist.
    HINWEIS: Das Vorheizen der Kammer für 3 Stunden vor Beginn der Bildgebung kann dazu beitragen, Drift und Unschärfe während der Aufnahme zu minimieren.
    HINWEIS: Die Kammer sollte die Zellen unter konstanten Bedingungen von 37 °C und 5 % CO2 halten.
  2. Wählen Sie eine Position in der XY-Achse, die als Nullpunkt dienen soll (XY = 0). Dies ermöglicht eine Referenz, um die Positionen in Zukunft wieder zu finden, z.B. nach einer post-imagingären Immunzytochemie (siehe Abschnitt 5).
    HINWEIS: Es ist ratsam, ein Zeichen in die Platte zu zeichnen, das als Referenz für die Bestimmung des Nullpunkts verwendet werden kann.
  3. Wählen Sie die Positionen aus, die mit 10-facher Vergrößerung abgebildet werden sollen.
    HINWEIS: Wählen Sie 10-15 Positionen pro Vertiefung, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, retroviral transfizierte Zellen zu beobachten.
    HINWEIS: Objektive mit großer Reichweite (20x oder 40x) können verwendet werden, um Bilder mit höherer Auflösung zu erhalten. Abhängig vom Arbeitsabstand der Objektive können Glasbodenplatten erforderlich sein.
  4. Nehmen Sie alle 5 Minuten Phasenkontrastbilder und alle 3 Stunden Fluoreszenzbilder auf, um die Phototoxizität zu verringern. Überprüfen und justieren Sie den Fokus in den ersten 3 Stunden des Experiments, da er sich ändern kann, während sich die Temperatur ausgleicht. Überprüfen und justieren Sie den Fokus täglich.
    HINWEIS: Wir beobachten, dass der Fokus nach den ersten 24 Stunden stabil wird. Es empfiehlt sich jedoch, den Fokus zu überwachen. Alternativ können Sie auch ein softwarebasiertes Autofokus-System verwenden.
  5. Nach 7 Tagen beenden Sie die Erfassung und fahren Sie mit der Immunzytochemie nach der Bildgebung fort (siehe Abschnitt 5).
  6. Nach der Immunzytochemie setzen Sie die Platte wieder in den Mikroskop-Inkubator ein, finden den Nullpunkt, setzen XYZ = 0 zurück und laden das Experiment mit gespeicherten Positionen neu. Erfassen Sie die Fluoreszenzbilder jeder Position mit geeigneten Fluoreszenzfiltern.

5. Immunzytochemie nach der Bildgebung

  1. Nach 7 Tagen in Kultur fixieren Sie die Zellkultur mit 4 % Paraformaldehyd (PFA)-Fixiermittel für 15 min bei Raumtemperatur.
    ACHTUNG: PFA ist giftig und sollte in einem chemischen Abzug gehandhabt werden.
  2. Mit 0,5 mL PBS 0,1 M 5 Min. spülen. 3 Mal wiederholen.
  3. Inkubieren Sie über Nacht in Primärantikörpern bei 4 °C in 0,5 % Triton und 10 % normalem Ziegenserum in PBS 0,1 M.
    HINWEIS: Verwenden Sie einen Anti-Microtubulie Associated Protein 2 (MAP2)-Antikörper, um den neuronalen Phänotyp zu bestätigen (Maus-IgG1, 1:1.000) und Anti-GFP, um die transduzierten Zellen zu markieren (Hühner-Antikörper, 1:500). Andere Antikörper können zum Nachweis von Vorläuferzellen oder Gliazellen verwendet werden.
  4. Mit 0,5 mL PBS 0,1 M 5 Min. spülen. 3 Mal wiederholen.
  5. Sekundärantikörper in 0,5 % Triton und 10 % normalem Ziegenserum in PBS 0,1 M verdünnen und 2 h bei Raumtemperatur inkubieren. Empfohlene Verdünnung: 1:1.000.
  6. Mit 0,5 mL PBS 0,1 M 5 Min. spülen. 3 Mal wiederholen.
  7. Für die Zellkernfärbung inkubieren Sie die Zellen 5 Minuten lang mit 0,1 μg/ml 4′6′-diamino-2-phenylindon (DAPI) in PBS 0,1 M.
  8. Mit 0,5 mL PBS 0,1 M 5 Min. spülen. 3 Mal wiederholen.
  9. Bewahren Sie die Zellen in PBS 0,1 M auf und schützen Sie sie vor Licht (z. B. wickeln Sie die Platte mit Folie ein).

6. Verfolgung von Zellen

HINWEIS: Hier beschreiben wir kurz die Hauptschritte zur Analyse von Zeitraffer-Videomikroskopie-Daten mit der Software The Tracking Tool (tTt), die unter dem Link in der Materialtabelle verfügbar ist.

HINWEIS: Wenn die Bildaufnahme mit einer anderen Software durchgeführt wird, importieren Sie die Bilddaten mit dem tTt Converter, der im tTt-Installationsprogramm verfügbar ist (Link in der Materialtabelle). Es werden nur die Bildformate png, tif oder jpg akzeptiert. Befolgen Sie die Schritte unter Abbildung 1 A - B, nachdem Sie den tTt-Konverter gestartet haben.

  1. Starten Sie die Software tTt und wählen Sie einen Benutzernamen aus. Klicken Sie auf die Schaltflächen "Benutzer hinzufügen" und "Weiter" (Abbildung 2A). Durchsuchen Sie den "TTTWorkFolder" (Abbildung 2B) und wählen Sie ihn aus. Abstammungsbäume, Statistiken und exportierte Bilder werden in diesem Ordner gespeichert. Wählen Sie anschließend das zu analysierende Experiment aus und laden Sie es (Abbildung 2B).
  2. Wenn die Bilder zuvor vom tTt Converter konvertiert wurden, klicken Sie auf "LogFileConverter" (Abbildung 3A) und geben Sie die Anzahl der Sekunden zwischen zwei aufeinanderfolgenden Zeitpunkten im LogFileConverter-Fenster an. Klicken Sie auf "Protokolldateien für gesamtes Experiment konvertieren" (Abbildung 1C).
  3. Wählen Sie in einer Liste von Bildern, die im tTt-Fenster angezeigt werden, die gewünschten Bilder aus, indem Sie sie manuell laden oder die im Programm angezeigte Option verwenden. Laden Sie Bilder (Abbildung 3).
  4. Wählen Sie Datei > Öffnen Sie > Neue Kolonie. Klicken Sie auf "Tracking", gefolgt von "Tracking starten", um das Tracking an einer ausgewählten Position zu starten.
  5. Ein Filmfenster wird angezeigt (Abbildung 4). Markieren Sie die Zelle mit dem Tracking-Kreis und drücken Sie die Taste 0. Die Software wechselt zum nächsten Frame. Positionieren Sie den Tracking-Kreis weiterhin mit der Maus um die getrackte Zelle und klicken Sie in jedem Frame auf 0, um eine Spurmarkierung auf der Zelle hinzuzufügen.
  6. Verwenden Sie die Tasten 1 und 3, um zum vorherigen bzw. nächsten Frame zu wechseln. Um eine Spurmarkierung zu löschen, klicken Sie einfach auf die richtige Position zum Markieren und drücken Sie 0.
  7. Wenn die Zelle geteilt ist, wählen Sie die Schaltfläche "Division" (rotes Rechteck bei Abbildung 4). Fahren Sie mit der Verfolgung einer Tochterzelle fort, indem Sie Umschalt+D drücken. Um die zweite Tochterzelle zu verfolgen, wählen Sie sie im Zelleditor aus und drücken Sie F2.
  8. Wenn die Zelle während der Videomikroskopie abgestorben ist, wählen Sie "Apoptose" (blaues Rechteck bei Abbildung 4).
    HINWEIS: Obwohl die Software das Ereignis als "Apoptose" bezeichnet, können andere Mechanismen für den Zelltod verantwortlich sein.
  9. Wenn die Zelle das Beobachtungsfeld verlässt oder sich mit benachbarten Zellen vermischt, was eine Verfolgung ausschließt, wählen Sie "verloren" (grünes Rechteck bei Abbildung 4).
  10. Um die Verfolgung zu stoppen und später fortzusetzen, klicken Sie auf "interrupt" (violettes Rechteck bei Abbildung 4).
    HINWEIS: Im Fenster des Zelleneditors wird während der Verfolgung ein Baum generiert. Um den Herkunftsbaum zu speichern, wählen Sie Datei > > aktuellen Baum speichern (im Fenster Zelleneditor).
  11. Um die Verfolgung einer anderen Zelle zu starten, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Zelle oder wählen Sie die Zelle mit der linken Maustaste aus und klicken Sie auf Tracking > Tracking starten.
  12. Um den Film mit den Tracking-Daten zu exportieren, sollte sich die Software nicht im "Tracking-Modus" befinden. Um den Tracking-Modus zu deaktivieren, führen Sie Schritt 6.10 aus. Wählen Sie im Fenster "Film" die Option "> Film exportieren" aus. Richten Sie das Format, den Bereich der Frames, die Anzahl der Frames pro Sekunde und die Bitrate ein. Klicken Sie auf "Export starten".

7. Quantifizierungen

HINWEIS: Mit den Videomikroskopiedaten können mehrere Messungen durchgeführt werden46. Hier beschreiben wir drei Möglichkeiten, die später im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" beispielhaft dargestellt werden.

  1. Quantifizieren Sie das Zellüberleben für jede Zelllinie, indem Sie die Anzahl der zu verschiedenen Zeitpunkten lebenden Zellen durch die Gesamtzahl der Zellen dividieren, die vor Erreichen dieser Zeitpunkte innerhalb einzelner Klone erzeugt wurden37.
  2. Quantifizieren Sie den Anteil des symmetrischen Vorläufers (SP, beide Tochterzellen vermehren sich weiter), des asymmetrischen (A, eine Tochterzelle vermehrt sich weiter und die andere wird postmitotisch) oder des symmetrischen Terminals (ST, beide Tochterzellen werden postmitotisch)15,38.
  3. Messen Sie die Länge des Zellzyklus, indem Sie die Zeitspanne der proliferierenden Zellen zwischen ihrer Entstehung und Teilung berechnen15.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Primärkulturen von Großhirnrindenzellen, die aus Embryonen E14 isoliert wurden, enthalten sowohl Vorläuferzellen als auch neuronale Zellen. Während der Bildgebung durchlaufen die Vorläuferzellen mehrere Runden der Zellteilung, wodurch sich die Anzahl der Zellen erhöht (Abbildung 5 und Video Abbildung 1).

Die retrovirale Transfektion einiger Vorläuferzellen erleichtert die Identifizi...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Echtzeit-Beobachtung der primären Hirnrinde Zellen ermöglicht die Analyse der Zellproliferation, Zellteilung, Zellzyklus Länge, Zelldifferenzierung und Zelle überleben3,14,15,37. Noch wichtiger ist, ermöglicht es das Studium der einzelligen Abstammungen, führt zur Identifizierung von den Zwischenphasen während der Progression von NSCs auf Neuronen3erlassen. Schließlich i...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde unterstützt von CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) und FAPERN (Fundação de Amparo eine Pesquisa Do Rio Grande do Norte).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Invitrogen Life Technologies14175129
HEPESSigma-AldrichH3375-25G
Penicillin/StreptomycinGibco15140122
Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM)Gibco12400-024
Fötales Kälberserum (FCS)Gibco10437028
GlukoseGibcoA2494001
B27Gibco17504044
Trypsin-EDTA (0,05%)Gibco25300054
ParaformaldehydSigma16005
ZiegenserumSigma-Aldrich69023
Triton X-100VWR International Ltd.306324N
IsofluranSigma792632
MausSigmaM4403
Anti-GFP HuhnAves0511FP12
DAPISigmaD9542
Ziege Anti-Maus Alexa 594InvitrogenA11005
Ziege Anti-Huhn Alexa 488InvitrogenA11039
ImageJNIH
tTtETH Zürich
ZellbeobachtermikroskopZeiss
Pasteur Pipette
PBS
The Tracking Tool (tTt) Softwarehttps://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html Download-Link
Anti-MAP2,

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
  2. Miller, F. D., Gauthier, A. S. Timing is everything: making neurons versus glia in the developing cortex. Neuron. 54 (3), 357-369 (2007).
  3. Costa, M. R., Bucholz, O., Schroeder, T., Götz, M. Late Origin of Glia-Restricted Progenitors in the Developing Mouse Cerebral Cortex. Cereb Cortex. 19 (Suppl 1), i135-i143 (2009).
  4. Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
  5. Costa, M. R., Müller, U. Specification of excitatory neurons in the developing cerebral cortex: progenitor diversity and environmental influences. Front Cell Neurosci. 8, 449(2015).
  6. Schitine, C., Nogaroli, L., Costa, M. R., Hedin-Pereira, C. Astrocyte heterogeneity in the brain: from development to disease. Front Cell Neurosci. 9, 76(2015).
  7. Temple, S. Division and differentiation of isolated CNS blast cells in microculture. Nature. 340 (6233), 471-473 (1989).
  8. Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372 (6503), 263-266 (1994).
  9. Qian, X., Davis, A. A., Goderie, S. K., Temple, S. FGF2 concentration regulates the generation of neurons and glia from multipotent cortical stem cells. Neuron. 18 (1), 81-93 (1997).
  10. Qian, X., Goderie, S. K., Shen, Q., Stern, J. H., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125 (16), 3143-3152 (1998).
  11. Qian, X., et al. Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells. Neuron. 28 (1), 69-80 (2000).
  12. Shen, Q., et al. The timing of cortical neurogenesis is encoded within lineages of individual progenitor cells. Nat Neurosci. 9 (6), 743-751 (2006).
  13. Ravin, R., et al. Potency and fate specification in CNS stem cell populations in vitro. Cell Stem Cell. 3 (6), 670-680 (2008).
  14. Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Götz, M., Hedin-Pereira, C. The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex. J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).
  15. Costa, M. R., Wen, G., Lepier, A., Schroeder, T., Götz, M. Par-complex proteins promote proliferative progenitor divisions in the developing mouse cerebral cortex. Development. 135 (1), 11-22 (2008).
  16. Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
  17. Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Kriegstein, A. R. Distinct behaviors of neural stem and progenitor cells underlie cortical neurogenesis. J Comp Neurol. 508 (1), 28-44 (2008).
  18. Bultje, R. S., Castaneda-Castellanos, D. R., Jan, L. Y., Jan, Y. N., Kriegstein, A. R., Shi, S. H. Mammalian Par3 regulates progenitor cell asymmetric division via notch signaling in the developing neocortex. Neuron. 63 (2), 189-202 (2009).
  19. Williams, B. P., Read, J., Price, J. The generation of neurons and oligodendrocytes from a common precursor cell. Neuron. 7 (4), 685-693 (1991).
  20. Williams, B. P., Read, J., Price, J. Evidence for multiple precursor cell types in the embryonic rat cerebral cortex. Neuron. 14 (6), 1181-1188 (1995).
  21. Heins, N., et al. Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6. Nat Neurosci. 5 (4), 308-315 (2002).
  22. Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a recombinant retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
  23. Luskin, M. B., Parnavelas, J. G., Barfield, J. A. Neurons, astrocytes, and oligodendrocytes of the rat cerebral cortex originate from separate progenitor cells: an ultrastructural analysis of clonally related cells. J Neurosci. 13 (4), 1730-1750 (1993).
  24. Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104 (3), 473-482 (1988).
  25. Walsh, C., Cepko, C. L. Clonally related cortical cells show several migration patterns. Science. 241 (4871), 1342-1345 (1988).
  26. Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-440 (1992).
  27. Parnavelas, J. G., Barfield, J. A., Franke, E., Luskin, M. B. Separate progenitor cells give rise to pyramidal and nonpyramidal neurons in the rat telencephalon. Cereb Cortex. 1 (6), 463-468 (1991).
  28. Grove, E. A., Williams, B. P., Li, D. Q., Hajihosseini, M., Friedrich, A., Price, J. Multiple restricted lineages in the embryonic rat cerebral cortex. Development. 117 (2), 553-561 (1993).
  29. Mione, M. C., Danevic, C., Boardman, P., Harris, B., Parnavelas, J. G. Lineage analysis reveals neurotransmitter (GABA or glutamate) but not calcium-binding protein homogeneity in clonally related cortical neurons. J Neurosci. 14 (1), 107-123 (1994).
  30. Mione, M. C., Cavanagh, J. F., Harris, B., Parnavelas, J. G. Cell fate specification and symmetrical/asymmetrical divisions in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 17 (6), 2018-2029 (1997).
  31. Reid, C. B., Liang, I., Walsh, C. Systematic widespread clonal organization in cerebral cortex. Neuron. 15 (2), 299-310 (1995).
  32. McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic neural progenitors appear to be restricted to regional and glial fates before the onset of neurogenesis. J Neurosci. 21 (17), 6772-6781 (2001).
  33. Reid, C. B., Walsh, C. A. Evidence of common progenitors and patterns of dispersion in rat striatum and cerebral cortex. J Neurosci. 22 (10), 4002-4014 (2002).
  34. Gao, P., et al. Deterministic progenitor behavior and unitary production of neurons in the neocortex. Cell. 159 (4), 775-788 (2014).
  35. Schroeder, T. Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals. Nature. 453 (7193), 345-351 (2008).
  36. Morrow, T., Song, M. R., Ghosh, A. Sequential specification of neurons and glia by developmentally regulated extracellular factors. Development. 128 (18), 3585-3594 (2001).
  37. Landeira, B. S., et al. Activity-Independent Effects of CREB on Neuronal Survival and Differentiation during Mouse Cerebral Cortex Development. Cereb Cortex. , 1-11 (2016).
  38. Costa, M. R., et al. Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro. Development. 138 (6), 1057-1068 (2011).
  39. Pilaz, L. J., et al. Prolonged Mitosis of Neural Progenitors Alters Cell Fate in the Developing Brain. Neuron. 89 (1), 83-99 (2016).
  40. Hoppe, P. S., et al. Early myeloid lineage choice is not initiated by random PU.1 to GATA1 protein ratios. Nature. 535 (7611), 299-302 (2016).
  41. Gomes, F. L., et al. Reconstruction of rat retinal progenitor cell lineages in vitro reveals a surprising degree of stochasticity in cell fate decisions. Development. 138 (2), 227-235 (2011).
  42. Ortega, F., Berninger, B., Costa, M. R. Primary culture and live imaging of adult neural stem cells and their progeny. Methods Mol Biol. 1052, 1-11 (2013).
  43. Ponti, G., Obernier, K., Guinto, C., Jose, L., Bonfanti, L., Alvarez-Buylla, A. Cell cycle and lineage progression of neural progenitors in the ventricular-subventricular zones of adult mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (11), E1045-E1054 (2013).
  44. Jagasia, R., et al. GABA-cAMP response element-binding protein signaling regulates maturation and survival of newly generated neurons in the adult hippocampus. J Neurosci. 29 (25), 7966-7977 (2009).
  45. Costa, M. R., Jagasia, R., Berninger, B. Directed Neuronal Differentiation of Embryonic and Adult-Derived Neurosphere Cells. Protocols for Neural Cell Culture. Doering, L. C. , Humana Press. New York. 29-49 (2009).
  46. Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
  47. Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6 (12), 1847-1859 (2011).
  48. Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. Jr The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15 (9), 6046-6057 (1995).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Zeitraffer VideomikroskopieZellteilungsanalyseZellzyklusdauerSchicksal von Vorl uferzellenvirusvermittelte Transfektionfluoreszierende Reporterproteinesymmetrische und asymmetrische TeilungAnalyse auf Einzelzellebeneneurale Stammzellen

Verwandte Artikel