Method Article

Hochdurchsatz-Screening für die Protein-basierten Vererbung in S. cerevisiae

DOI:

10.3791/56069

⸱

August 8th, 2017

 , 
1Department of Developmental Biology, Stanford University School of Medicine, 2Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt eine Hochdurchsatz-Methodik, funktionell für die Protein-basierten Vererbung in S. CerevisiaeBildschirm.

Abstract

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Die Codierung von biologischen Informationen, der für künftige Generationen zugänglich ist wird in der Regel über Änderungen an der DNA-Sequenz erreicht. Langlebige Vererbung in Protein Konformation (anstatt Sequenz) codiert wurde lange als Paradigma-Verschiebung, aber selten gesehen. Am besten charakterisiert Beispiele solcher epigenetische Elemente sind Prionen, die selbstorganisierende Verhalten besitzen, die die vererbbare Manifestation des neuen Phänotypen fahren können. Viele archetypische Prionen zeigt eine auffallende N/Q-reichen Sequenz Voreingenommenheit und montieren in eine Amyloid Falten. Diese Besonderheiten haben darüber informiert, dass die meisten Screening-Bemühungen um neue Prionproteine zu identifizieren. Mindestens drei bekannten Prionen (einschließlich der Gründung Prions, PrPSc) jedoch nicht diese biochemischen Eigenschaften Hafen. Deshalb haben wir eine alternative Methode, um die Reichweite der Protein-basierten Vererbung anhand einer Eigenschaft der Masse Sonde entwickelt: die transiente Überexpression von Prionproteinen erhöht die Frequenz bei dem erwerben sie eine selbst-Template-Konformation. Dieses Dokument beschreibt ein Verfahren zur Analyse der Fähigkeit der Hefe ORFeome, Protein-basierten Vererbung zu entlocken. Bei dieser Strategie wir zuvor gefunden, > 1 % Hefe Proteine könnte die Entstehung biologischer Merkmale, die langlebig, stabil, und häufiger als genetische Mutation entstanden Kraftstoff. Dieser Ansatz kann in hohem Durchsatz über gesamte ORFeomes oder als gezielte Screening Paradigma für spezifische genetische Netzwerke oder Reize aus der Umwelt eingesetzt werden. Ebenso wie vorwärts genetischer Bildschirme zahlreiche Entwicklungs- und Signalisierung Wege definieren, bieten diese Techniken eine Methode um den Einfluss von Protein-basierten Vererbung in biologischen Prozessen zu untersuchen.

Introduction

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Biologische Systeme erleben häufig vorübergehende Schwankungen in Protein Hülle und Fülle. Es bleibt unklar, ob diese einen bleibenden Eindruck bei der Gestaltung des Phänotyps eines Organismus oder zukünftiger Generationen haben. Die bekanntesten Fälle von diesem Biologie beinhalten eine seltene Klasse von Proteinen, Prionen, die die Entstehung von vererbbaren Merkmale ohne Änderung des Genoms zu fahren. Stattdessen übermitteln diese proTeinaceous und inFectious Partikel Phänotypen über selbsterhaltend Änderungen an Protein Konformation1,2. Diese Art der Vererbung wurde als Ursache für die ungewöhnliche Erbschaft-Muster einer verheerenden Neurodegenerative Krankheit entdeckt. Studien in Organismen von Pilzen bis hin zu Säugetieren3,4,5,6,7,8,9,10 haben da ergab jedoch, dass Prion-Elementen Anpassungswert verleihen können. Dennoch wurden Prionen als einen faszinierenden, aber selten biologische Kuriosität angesehen.

Diese vorherrschende Meinung ist teilweise statt, weil die Charakterisierung von Protein-basierten Vererbung von einer kleinen Gruppe von Beispielen lange eingeschränkt wurde. Die jüngsten Bemühungen der systematischen Screening haben dieses Bild erheblich ausgeweitet, durch die Identifizierung mehrere neue Bona Fide Prionen11 und fast zwei Dutzend Protein Domänen12 mit einer Kapazität von Prion-wie Konformationsänderungen Brennstoffumstellung. Da jedoch diese Ansätze in der Regel auf starke Aminosäure-Sequenz Vorurteile konzentriert haben, Austauschen der Prionen, die entdeckt wurden die biochemischen Eigenschaften der Gründung Hefe Prionen [PSI+]13,14, [URE3]15und [RNQ+]11,16. Dazu gehören: (1) modulare Domains, sind reich an lange Polymeren erstreckt sich von Asparagin (N) und Glutamin (Q), (2) Montage in ein Amyloid [PRION+] Konformation17,18,19, und 3) vollständige Abhängigkeit von Disaggregase Hsp104-Funktion für die treuen Vermehrung von Mutter zu Tochter13,20,21. In der Tat viele Bona Fide Prionen, einschließlich [GAR+], [Het-s] und sogar das original Prion (PrP-Sc), würde unter solchen strengen Kriterien verfehlt werden. Vielleicht noch wichtiger ist, wäre sie nicht in der Lage, neuartige Mechanismen von Protein-basierten Vererbung22zu erfassen. So kann die wahre biologische breite solcher Phänomene weitaus häufiger in der Natur als bisher angenommen sein.

Um diese Frage zu untersuchen, wurde eine Hochdurchsatz-Proteom-weite Strategie eingesetzt. Ein Markenzeichen für alle Prionen, einschließlich PrPSc, [GAR+], und [Het-s], ist, dass die transiente Überexpression der kausalen Proteine stark erhöht die Rate der Prion Erwerb15,23,24,25,26. Wir nutzten diese Funktion, um systematisch Fragen, über die gesamte Hefe ORFeome, wenn stabile Protein-basierten, epigenetische Zustände durch Induktion vorübergehend die Überexpression von einzelnen Proteinen initiiert werden könnten. Es ist bekannt, dass das Protein-Überexpression Phänotypen27verändern kann. Prionproteine sind jedoch ungewöhnlich, weil ihre temporäre Überproduktion eine Änderung im Phänotyp produziert, die für viele Hunderte von Generationen nach der anfänglichen Überexpression vererbbar ist. Bisher haben wir dieses Feature sowie die ungewöhnliche Erbschaft-Muster von Protein-basierten genetischen Elementen, Dutzende von Proteinen dar, die in der Lage, haben Neuverkabelung phänotypische Landschaften ohne Veränderung der Genom-28sind. Obwohl einige identifiziert wurden Proteine vormals Prionen, die meisten waren nicht, unterstreicht die Kraft dieses Ansatzes um neue Formen der Protein-basierten Erbe zu entdecken.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Anfängliche Überexpression

  1. Transformieren Sie die zuvor in YPD-Flüssigkeit gezüchteten Hefezellen (in diesem Fall BY4741 MAT a haploids) (10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton und 20 g Glukose pro 1 L) mit den gewünschten Kandidatenkonstrukten aus der FLEXGene ORFeome-Bibliothek (Hefe-ORFs unter der Kontrolle eines Galaktose-induzierbaren Promotors im URA3-markierten zentromerenPlasmidrückgrat, pBY011<sup class="xref">29).
  2. Verwenden Sie autoklavierte Zahnstocher, um vier separate Kolonien aus diesen Transformationen auszuwählen, die als biologische Replikate dienen. Züchten Sie sie 48-72 h lang in 150 μl SRaffinose-URA (0,74 g CSM-URA, 6,7 g Hefestickstoffbase ohne Aminosäuren und 20 g Raffinose pro 1 l) in 96-Well-Platten. Beimpfen Sie Völker aus dem ersten ORF in Vertiefung A1 aller Platten, Völker aus dem zweiten ORF in A2 aller Platten, etc.
    HINWEIS: Alle Wachstumsschritte werden bei 30 °C und atmosphärischen CO2 -Werten (407,05 ppm) durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.
  3. Vergewissern Sie sich, dass die Kulturen gesättigt sind (mit dem Auge sichtbare Zellen am Boden jeder Vertiefung) und impfen Sie mit einem Liquid-Handling-Roboter ein 1:4-Array von 1 μl aus jeder 96-Well-Plattenvertiefung in 4 separate Vertiefungen einer 384-Well-Platte, die mit 45 μl SGal-URA (0,74 g CSM-URA, 6,7 g Hefestickstoffbase ohne Aminosäuren und 20 g Galaktose pro 1 L) pro Well.
    HINWEIS: Dadurch entsteht eine Kompositplatte, in der 4 biologische Repliken jedes ORF in einem quadratischen Muster angeordnet sind.
  4. Bereiten Sie gleichzeitig separate 384-Well-Platten vor, die 45 μl SGal-URA mit den interessierenden Stressoren (z. B. Manganchlorid bei 20 mM) pro Well enthalten. Diese Platte wird auf die gleiche Weise wie in Schritt 1.3.
    inokuliert. HINWEIS: Um den größten Dynamikbereich für die phänotypische Detektion zu erreichen, wird eine 2-fache Verdünnungsreihe um die LD50-Konzentration eines gegebenen Stressors empfohlen. Dies kann im Voraus erfolgen, um die optimale Konzentration zu bestimmen, bei der sowohl ein verstärktes als auch ein reduziertes Wachstum beobachtet werden kann.
  5. Als abschließende parallele Kontrolle inokulieren Sie eine dritte 384-Well-Platte auf die gleiche Weise, wobei derselbe Stressor im Medium enthalten ist, das keine Plasmidexpression induziert. Stellen Sie sicher, dass die Platte 45 μl SD-URA (0,74 g CSM-URA, 6,7 g Hefestickstoffbase ohne Aminosäuren und 20 g Glukose pro 1 l) pro Vertiefung enthält und wie in den Schritten 1.3 und 1.4 inokuliert ist.
  6. Legen Sie die Platten mit den Zellen sofort auf einen Mikroplatten-Stapler und stellen Sie das Protokoll auf eine 72-Stunden-Endlosschleife ein, indem Sie den OD600 mit einem Mikroplatten-Reader mit Staplern bei Raumtemperatur und atmosphärischem CO2 (407,05 ppm) messen.
    Hinweis: Die Häufigkeit der Wachstumsmessung hängt von der Anzahl der Platten ab (die letztendlich durch die Anzahl der Gene und Bedingungen bestimmt wird, die der Prüfer untersuchen möchte), die im Lauf verwendet werden. Je mehr Platten verwendet werden, desto länger dauert es, bis der Plattenleser eine Schleife abgeschlossen hat, und desto länger dauert es zwischen den Messungen (die Messzeit pro Platte beträgt ~45 s, abhängig von der verwendeten Instrumentierung).
  7. Nach den Wachstumsmessungen verwenden Sie denselben Liquid-Handling-Roboter, um 1 μl pro Well der SGal-URA-induzierten Kulturen (d. h. derjenigen, die eine Proteinüberexpression aufwiesen) auf neue 384-Well-Platten mit 45 μl SD-URA pro Well (Medium, das keine Proteinexpression des Plasmids zulässt) zu übertragen.
    1. Führen Sie parallel dazu analoge Inokulationen eines zweiten Satzes von 384-Well-Platten durch, die 45 μl SD-URA pro Well aus den Kulturen enthalten, die in SD-URA in Gegenwart der Stressoren (d. h. denen aus Schritt 1.5) gezüchtet wurden.
    2. Lass die Platten 48 Stunden lang bei 30 °C in einer befeuchteten Kammer (d. h. einem verschließbaren Plastikbehälter mit einem feuchten Papiertuch darin) wachsen.
  8. Nehmen Sie die Platten aus dem vorherigen Schritt und inokulieren Sie 1 μl pro Vertiefung in 384-Well-Platten, die 45 μl SD-URA enthalten. Führen Sie dann eine separate Reinokulation von 1 μl pro Vertiefung von derselben Quellplatte in eine separate 384-Well-Platte mit 45 μl SD-URA mit dem Stressor durch.
    HINWEIS: Dadurch wird festgestellt, ob die Sensitivitäts-/Resistenzphänotypen gegenüber einem Stressor bestehen bleiben, nachdem die Proteinüberexpression aufgehört hat.
  9. Legen Sie sofort Platten mit Zellen auf einen Mikroplatten-Stapler und stellen Sie das Protokoll für eine 48-stündige Endlosschleife ein, in der der OD600 mit einem Mikroplatten-Reader bei Raumtemperatur und atmosphärischem CO2 (407,05 ppm) gemessen wird.
  10. Exportieren Sie die Zeit- und DA600-Messungen als XY-Tabelle mit der Plattenleser-Software. Gruppieren Sie die Spalten des OD600 für jedes biologische Replikat zusammen und berechnen Sie den Mittelwert. Erstellen Sie ein XY-Diagramm der Zeit im Vergleich zu OD600, um Wachstumskurven zu generieren.
    1. Vergleichen Sie die Wachstumsraten von Kulturen, die in der Vergangenheit einer Überexpression unterzogen wurden (d. h. solche, die ursprünglich in galaktosehaltigem Medium induziert wurden, bevor sie in SD-URA reinokuliert wurden), mit Kulturen, die dies nicht getan haben (d. h. solche, die in Glukose vermehrt wurden), wie zuvor beschrieben30.
  11. Bei Kulturen, die signifikante Wachstumsunterschiede als Reaktion auf einen bestimmten Stressor aufweisen, die von der Überexpression des angestammten Proteins abhängen, nehmen Sie 1 μl von jedem biologischen Replikat, verdünnen Sie es in 10 ml Wasser und plattieren Sie dann 50 μl auf Platten, die 5-FOA enthalten (0,74 g CSM-URA, 1 g 5-FOA, 50 mg Uracil, 6,7 g Hefestickstoffbase ohne Aminosäuren, 20 g Glukose und 20 g Agar pro Liter). Anbau bei 30 °C für 3 Tage.
    1. Ergeben sich dadurch zu viele oder zu wenige Kolonien pro Platte, ist der Verdünnungsfaktor entsprechend anzupassen.
      Hinweis: 5-FOA wird durch den Uracil-Biosyntheseweg in ein toxisches Zwischenprodukt umgewandelt. Dies führt zu einem Verlust des URA3-markierten Expressionsplasmids, das im ersten Schritt transformiert wurde.
  12. Entnehmen Sie 8-32 einzelne Kolonien mit autoklavierten Zahnstochern und stecken Sie sie auf 96-Well-Platten mit 150 μl SD-CSM. Wachsen Sie 48-72 Stunden lang in einer befeuchteten Kammer bei 30 °C bis zur Sättigung. Verwenden Sie diese Kulturen, um zwei neue Sätze von 96-Well-Platten mit 150 μl SD-CSM zu beimpfen, sowohl mit als auch ohne die Stressoren aus Schritt 1.11.
  13. Legen Sie die Platten auf einen Mikroplatten-Stapler und stellen Sie das Protokoll so ein, dass der OD600 in einer 48-Stunden-Endlosschleife gemessen wird.
  14. Analysieren Sie die Daten wie in Schritt 1.10 und bestätigen Sie, dass die signifikanten Wachstumsunterschiede, die in Schritt 1.10 beobachtet wurden, nach dem Plasmidverlust erhalten bleiben.
    HINWEIS: Diese Zellen beherbergen stabile phänotypische Zustände, die auf eine proteinbasierte Vererbung hinweisen könnten.
  15. Testen Sie die Zellen, die die induzierten Phänotypen beibehielten, auf klassische Kennzeichen der proteinbasierten Vererbung (siehe unten).

2. Tests auf Prionen-ähnliche Vererbung

  1. Chaperon-vermittelte "Aushärtung"
    1. Test Hsp104 Chaperonabhängigkeit.
      1. Wählen Sie eine Kolonie eines Hefestammes mit einem stabilen phänotypischen Zustand, streifen Sie zu einzelnen Kolonien auf einer YPD-Platte (10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, 20 g Glukose und 20 g Agar pro 1 L), die 3 mM GdnHCl enthält, und wachsen Sie 3 Tage lang bei 30 °C. Parallel dazu wird eine Kolonie von einem naiven Stamm auf einzelne Kolonien auf YPD+ 3 mM GdnHCl als Kontrolle auf die gleiche Weise ausgestreckt.
      2. Wiederholen Sie den Vorgang noch 2 Mal auf frischen YPD-Platten mit 3 mM GdnHCl.
      3. Da die GdnHCl-Exposition die Häufigkeit erhöhen kann, mit der zierliche Zellen entstehen, wählen Sie mehrere Kolonien aus, die 3 Passagen auf GdnHCl durchlaufen haben, und überprüfen Sie die funktionelle mitochondriale Atmung, indem Sie ihre Fähigkeit untersuchen, nach 7 Tagen auf YP-Glycerin-Platten zu sichtbaren Kolonien zu wachsen (10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, 20 ml Glycerin und 20 g Agar pro 1 l).
      4. Entnehmen Sie mehrere Kolonien aus den YP-Glycerin-Platten und testen Sie die Aufrechterhaltung stabiler phänotypischer Zustände durch Wachstum in Gegenwart des Stressors im Vergleich zu nicht "geheilten" und naiven (d.h. isogenen Zellen, die den phänotypischen Zustand nicht beherbergen, wie z.B. BY4741 MATa haploide) Kontrollen auf ähnliche Weise, wie in Schritt 1.13 beschrieben.
    2. Testen Sie die Abhängigkeit von Hsp70 Chaperon.
      1. "Aushärten" über ein Plasmid.
        1. Transformieren Sie sowohl naive Zellen als auch Zellen mit stabilen phänotypischen Zuständen mit URA3-markierten Plasmiden, die ein dominantes negatives Allel von Hsp70 (K69M) exprimieren25,31 von einem starken konstitutiven Promotor (GPD).
        2. Wählen Sie jeweils einzelne Transformanten, streifen Sie auf einer SD-URA-Platte zu einzelnen Kolonien (0,74 g CSM-URA, 6,7 g Hefestickstoffbase ohne Aminosäuren, 20 g Glukose und 20 g Agar pro 1 l) und züchten Sie 3 Tage lang bei 30 °C und atmosphärischem CO2.
        3. Wiederholen Sie diese Passage noch 2 Mal auf SD-URA-Platten.
        4. Wählen Sie mehrere Kolonien aus und streichen Sie auf 5-FOA-Platten zu einzelnen Kolonien, um das Plasmid zu eliminieren.
        5. Wählen Sie mehrere Einzelkolonien für jedes Isolat aus und testen Sie auf die Beibehaltung (oder den Verlust) der stabilen phänotypischen Zustände auf ähnliche Weise, wie in Schritt 1.13 beschrieben.
      2. "Heilung" durch genetische Kreuzung.
        1. Kreuzen Sie BY4741 MAT, a-haploide Stämme, die stabile phänotypische Zustände aufweisen, und naive Stämme des entgegengesetzten Paarungstyps (in diesem Fall BY4742 MAT,α), die genetische Deletionen in zwei der vier Hefe-Hsp70-Paraloge (ssa1Δ, ssa2Δ) aufweisen.
          HINWEIS: Diesem Stamm fehlt die Hsp70-Chaperonfunktion.
        2. Selektieren Sie für das Wachstum von Diploiden durch Streifen zu einzelnen Kolonien auf SD-LYS-MET (0,74 g CSM-LYS-MET, 6,7 g Hefestickstoffbase ohne Aminosäuren, 20 g Glukose und 20 g Agar pro 1 L) Double-Dropout-Medium.
        3. Pflücken Sie einzelne diploide Kolonien und züchten Sie 24 Stunden lang bei 30 °C in 8 mL Vorsporulationsmedium (0,8 % Hefeextrakt, 0,3 % Pepton, 10 % Dextrose und 100 mg/l Adeninsulfat).
        4. Schleudern Sie die Kulturen 3 Minuten lang bei 3.000 xg, aspirieren Sie das Prä-Sporulationsmedium (Prä-SPO) und waschen Sie die Pellets einmal mit sterilem Wasser.
        5. Resuspendieren Sie die Pellets in 2 ml Sporulationsmedium (1 % Kaliumacetat, 0,1 % Hefeextrakt, 0,05 % Glukose und 0,01 % Aminosäure-Add-Back-Mix (2 g Histidin, 10 g Leucin, 2 g Lysin und 2 g Uracil)). Anbau bei 25°C für 5 Tage.
        6. Die Kulturen auf 30 °C bringen und weitere 48 Stunden inkubieren.
        7. Beurteilen Sie die Effizienz der Sporulation, indem Sie mit einem Lichtmikroskop nach dem Vorhandensein von Tetraden suchen32.
        8. Nehmen Sie 40 μl Kultur, schleudern Sie sie für 1 Minute bei 3.000 xg in einem 1,5-ml-Röhrchen herunter und re-suspendieren Sie sie in einem gleichen Volumen der Zymolyase-Enzymmischung (1 M Sorbit, 0,1 M EDTA und 10 mg/ml Zymolyase 100T)
        9. Bei 25 °C 5 min inkubieren.
        10. 10 μl der verdauten Kultur auf eine sehr trockene, sehr ebene YPD-Agarplatte geben und die Kultur langsam in einer geraden Linie auf der Platte verteilen lassen.
        11. Lassen Sie die Platten mindestens 30 min in einer Laminar-Flow-Haube trocknen.
        12. Trennen Sie die Sporen mit einem Präpariermikroskop in Tetraden und ordnen Sie sie auf der Platte an.
        13. Lassen Sie die einzelnen haploiden Sporen zu Kolonien heranwachsen und testen Sie ihre Fähigkeit, auf SD-HIS-LEU (0,67 g CSM-HIS-LEU, 6,7 g Hefestickstoffbase ohne Aminosäuren, 20 g Glukose und 20 g Agar pro 1 l) Platten zu wachsen, was darauf hinweist, dass sie beide genetischen Deletionen (ssa1Δ ssa2Δ) beherbergen.
        14. Es wird jeweils auf die Aufrechterhaltung des phänotypischen Zustands im Hsp70-defizienten Hintergrund auf ähnliche Weise getestet, wie in Schritt 1.13.
          beschrieben. HINWEIS: Die Rückkreuzung dieser Sporen mit einem Wildtyp-Stamm mit wiederhergestellter Hsp70-Funktion sollte den Prionen-Phänotyp nicht wiederherstellen.
  2. Prüfung auf nicht-Mendelsche Vererbung.
    1. Kreuzen Sie BY4741 MAT, einen haploiden Stamm mit stabilen phänotypischen Zuständen und isogenen naiven Kontrollen, mit einem isogenen naiven Stamm des entgegengesetzten Paarungstyps (in diesem Fall BY4742 MATα).
    2. Selektieren Sie für das Wachstum von Diploiden durch Streifen zu einzelnen Kolonien auf SD-LYS-MET-Double-Dropout-Medium.
    3. Pflücken Sie einzelne diploide Kolonien und züchten Sie 24 Stunden lang bei 30 °C in 8 mL Vorsporulationsmedium.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.2.3-2.2.2.12 wie oben beschrieben.
    5. Lassen Sie die einzelnen haploiden Sporen zu Kolonien heranwachsen und testen Sie jede auf Aufrechterhaltung des phänotypischen Zustands durch Meiose mit dem Wachstumsassay, wie in Schritt 1.13.
      Hinweis: Ein weiteres definierendes Merkmal von Prionen ist, dass sie durch die Entfernung des ursprünglichen zufälligen Proteins erblich eliminiert werden können. Analog dazu wird die Kreuzung eines Prionenstammes mit einem Stamm, der eine genetische Deletion des ursprünglich induzierten Proteins beherbergt, die Prionenphänotypen in den Sporen, die die Deletion erben, aufheben. Beachten Sie auch, dass es möglich ist, dass das Prion in einer solchen Mutante in einem "kryptischen" Zustand gehalten wird, wenn das deletierte Gen benötigt wird, um den Prionenphänotyp zu manifestieren, aber nicht, um das Prion selbst zu vermehren. Um zwischen diesen beiden Möglichkeiten zu unterscheiden, kreuzen Sie die Sporen zurück zu einem naiven Wildtyp-Stamm und testen, ob der Prionen-Phänotyp in einem diploiden genetischen Hintergrund wieder auftaucht, wo die Funktion des Gens wiederhergestellt wurde.
  3. Zytoduktion.
    1. Generieren Sie den anfänglichen Empfängerstamm BY4742.
      1. Durch Transformation wird ein defektes KAR-Allel (kar1-15) eingeführt, das die Kernfusion während der Paarung verhindert23.
      2. Machen Sie diesen Stamm "zierlich" (d. h. inkompetent für die mitochondriale Atmung), indem Sie eine einzelne Kolonie in YPD-Bouillon mit 0,25 % Ethidiumbromid impfen.
      3. Züchten Sie die Kultur bei 30 °C bis zur späten exponentiellen/stationären Phase (OD600 ~1).
      4. 1:1.000 in frischem YPD mit 0,25 % Ethidiumbromid verdünnen und zweimal wiederholen.
      5. Sobald die Kultur die späte exponentielle/frühe stationäre Phase (OD600 0,8-1,2) erreicht hat, wird die Platte in einzelne Kolonien umgewandelt, indem 1:10.000 in sterilem Wasser verdünnt und 50 μl auf einer YPD-Platte plattiert werden. Nach 3 Tagen Anbau bei 30 °C wählen Sie mehrere Völker aus und testen Sie jede auf Atmungsinkompetenz, indem Sie ihre Fähigkeit untersuchen, nach 7 Tagen auf YP-Glycerin-Platten zu sichtbaren Kolonien heranzuwachsen.
    2. Führen Sie die erste Zytoduktion in BY4742 durch.
      1. Mischen Sie Zellen des Spenderstammes BY4741, die einen stabilen phänotypischen Zustand aufweisen, mit Zellen des naiven Empfängerstamms BY4742 kar1-15 auf der Oberfläche einer YPD-Agarplatte.
      2. 24 h bei 30 °C und atmosphärischem CO2 (407,05 ppm) anbauen und in Methionin-Dropout-Medium umfüllen, das Glycerin enthält (SGly-MET: 0,74 g CSM-MET, 6,7 g Hefestickstoffbase ohne Aminosäuren, 20 mL Glycerin und 20 g Agar pro 1 L).
        HINWEIS: Dies wählt beide BY4742-Kernmarker aus und ermöglicht die Wiederherstellung funktioneller Mitochondrien durch zytoplasmatischen Austausch.
      3. Nach 3-5 Tagen wählen Sie mehrere Einzelkolonien aus und führen Sie eine weitere Selektionsrunde für SD-MET durch (0,74 g CSM-MET, 6,7 g Hefestickstoffbase ohne Aminosäuren, 20 g Glukose und 20 g Agar pro 1 L).
      4. Parallel dazu ist zu bestätigen, dass es sich bei den Kolonien nicht um diploide Völker handelt, indem auf SD-LYS-MET-Medium passiert wird.
    3. Führen Sie umgekehrte Zytoduktionen durch.
      1. Mischen Sie die neuen Donorstämme (diesmal die erfolgreichen BY4742 kar1-15 Zytoduktanten) mit zierlichen naiven BY4741-Zellen (wie oben erzeugt) auf YPD-Agar.
      2. Wiederholen Sie die Zytoduktionen, wie zuvor beschrieben (Schritte 2.3.2.1-2.3.2.4), mit Ausnahme der Selektion von BY4741-Empfänger-Kernmarkern auf Glycerinmedium, dem Lysin fehlt (SGly-LYS: 0,74 g CSM-LYS, 6,7 g Hefestickstoffbase ohne Aminosäuren, 20 ml Glycerin und 20 g Agar pro 1 l).
      3. Wählen Sie mehrere Zytoduktivitäten aus und testen Sie mit dem Wachstumsassay auf die Aufrechterhaltung stabiler phänotypischer Zustände, wie zuvor in Schritt 1.13.
  4. Protein-Transformation.
    1. Bereiten Sie das Lysat vor.
      1. Züchten Sie 50 ml Zellen mit stabilen phänotypischen Zuständen bei YPD für 18 Stunden bei 30 °C.
      2. Pelletieren Sie die Kulturen bei 3.000 x g für 4 min und waschen Sie sie dann zweimal: einmal in autoklaviertem H2O und dann in 1 M Sorbit.
      3. Resuspendieren Sie die Zellen in 200 ml SCE-Puffer (1 M Sorbit, 10 mM EDTA, 10 mM DTT, 100 mM Natriumcitrat und 1 Mini-EDTA-freie Proteasehemmer-Tablette pro 50 ml, pH 5,8) mit 50 U/ml Hefelytisches Enzym 100T.
      4. Die Mischung bei 35 °C 30 min inkubieren.
      5. Beschallen Sie die Zellen bei 20 kHz und 20 % Intensität für 10 s auf Eis mit einem Schalldismembrator.
      6. Entfernen Sie die Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 10.000 x g für 15 min bei 4 °C.
      7. Die Überstände werden in ein sauberes Röhrchen gebracht, RNase I und biotinylierte DNase mit einem 3-fachen Überschuss (je nach Aktivitätseinheiten) zugegeben und 1 h lang bei 37 °C inkubiert.
      8. Entfernen Sie die DNase I, indem Sie überschüssige Streptavidin-Agarose-Kügelchen hinzufügen, 5 min inkubieren und durch Zentrifugation bei 10.000 x g für 1,5 min pelletieren.
      9. Den Überstand in ein frisches Röhrchen umfüllen.
    2. Bereiten Sie den Empfänger-Sphäroplasten vor.
      1. Züchten Sie 5 ml naiver Empfängerzellen in der YPD bis zur mittleren exponentiellen Phase (OD600 im Bereich von 0,5-1).
      2. Ernte durch Zentrifugation (3.000 x g für 4 min) und 4 Mal waschen: zweimal in H2O und zweimal in 1 M Sorbit.
      3. Die Zellen werden in 1 M Sorbit mit 200 U/ml Hefelytischem Enzym resuspendiert und 15 Minuten bei 35 °C inkubiert, um die Zellwände zu verdauen.
      4. Ernten Sie die resultierenden Sphäroplasten mit schonender Zentrifugation bei 600 x g für 5 min und waschen Sie sie mit 1 mL 1 M Sorbit und dann erneut mit 1 mL STC-Puffer (1 M Sorbit, 10 mM Tris pH 7,5 und 10 mM CaCl2).
      5. Die gewaschenen Sphäroplasten werden in 50 μl STC-Puffer resuspendiert.
        HINWEIS: Schneiden Sie mit einer Schere die letzten ~0,7 cm einer Pipettenspitze ab; Dies führt zu einem breiteren Mund und verhindert die Lyse der Sphäroplasten.
    3. Transformieren Sie die naiven Zellen mit Protein.
      1. Transformieren Sie 50 μl Sphäroplasten-Aliquots mit 50 μl Donorlysat, 20 μl Lachsspermien-DNA (2 mg/ml) und 5 μl eines URA3-markierten Selektionsplasmids (z. B. pAG426-GFP)28,33.
      2. Die Mischung bei 25 °C 30 min inkubieren.
      3. 5 min bei 600 x g zentrifugieren, um die Sphäroplaste zu sammeln und in 150 μl SOS-Puffer (1 M Sorbit, 7 mM CaCl2, 0,25 % Hefeextrakt und 0,5 % Pepton) wieder zu suspendieren.
      4. 30 min bei 30 °C erholen.
      5. Plattieren Sie die gesamte Kultur auf SD-URA-Platten.
      6. Überlagern Sie die plattierte Kultur schnell mit warmem (~45 °C) SD-URA mit 0,8 % Agar.
        Hinweis: Dadurch wird verhindert, dass die Sphäroplasten platzen
      7. Inkubieren Sie die Transformationsplatten 2-3 Tage lang bei 30 °C.
      8. Entnehmen Sie mit einem Zahnstocher erfolgreich wachsende Zellen aus der überlagerten Platte und ziehen Sie sie auf SD-URA-Platten wieder zu einzelnen Kolonien.
      9. Wählen Sie Dutzende von Kolonien für jede und streichen Sie sie auf 5-FOA-Platten, um das URA3-markierte Trägerplasmid zu eliminieren.
      10. Wählen Sie Kolonien aus, die auf den 5-FOA-Platten wachsen, und testen Sie wie zuvor (Schritt 1.13) mit dem Wachstumsassay auf den Transfer stabiler phänotypischer Zustände.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Es ist bekannt, dass eine Proteinüberexpression zelluläre Phänotypen dramatisch verändert27. Tatsächlich wurden mit einem ersten Screening-Ansatz Hunderte von neuen Phänotypen reproduzierbar aus der Überexpression von Klonen aus der Hefe ORFeome unter Verwendung von nur zehn Stressoren gewonnen. Die oben beschriebenen Assays ermöglichen jedoch die Beurteilung, ob Zellen nach dieser Überexpression langzeitstabile Phänotypen beibehalten. Ein Protein, das in der Lage ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die erste Hefe Prionen wurden durch ihre ungewöhnliche Phänotypen und verwirrenden Muster der Vererbung identifiziert. Die Merkmale der diese Prionen wurden dann verwendet, um Algorithmen und Berechnungswerkzeuge zum Bildschirm für zusätzliche Prionproteine zu bauen. Die hier beschriebene Methode dagegen ist experimentell und stützt sich auf vorübergehende Überexpression erstelle ich eine dauerhafte Veränderung-eine stabile Zustand in Konformation Protein kodiert. Wenn die Effizienz der "Aussaat" Prion Montage durch Über...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Sohini Chakrabortee, Sandra Jones, David Garcia, Bhupinder Bhullar, Amelia Chang, Richard She und Susan Lindquist für ihre Unterstützung bei der Entwicklung der Assays in diesem Papier sowie die Gutachter für ihre nachdenklichen Kommentaren verwendet.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
GuanidinhydrochloridSigmaCat#G3272-25GChemikalie
ManganchloridSigmaCat#M8054-100GChemikalie
EthidiumbromidSigmaE1510Chemikalie
5-FluororotinsäureSigmaCat#F5013-50MGChemikalie
BY4741 MATa (his3Δ 1 leu2Δ 0 LYS2 met15Δ 0 ura3Δ 0)Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998N/AHefestamm
BY4741 MATα (sein3Δ 1 leu2Δ 0 lys2Δ 0 MET15 ura3Δ 0)Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998N/AHefestamm
Hsp70 (K69M) Jarosz et al., 2014bN/APlasmid
FLEXGene-BibliothekHu et al., 2007N/APlasmid-Bibliothek
Dextrose (Glukose)Fisher ScientificD16-3Medienkomponente
RaffinoseSigmaR0250-25GMedienkomponente
Galaktose FisherScientificBP656-500Medienkomponente
CSMSunrise Science1001-100Medienkomponente
CSM-URASunrise Science1004-100Medienkomponente
CSM-LYSSunrise Science1032-100Medienkomponente
CSM-METSunrise Science1019-100Medienkomponente
CSM-LYS-METSunrise Science1035-100Medienkomponente
HefeextraktFisher ScientificBP1422-2Medienkomponente
PeptonResearch Products InternationalP20240-5000Medienkomponente
Bacto-PeptonBD211677Medienkomponente
GlycerinEMD MilliporeGX0185-2Medienkomponente
Hefe Stickstoffbase ohne AminosäurenBD291920Medienkomponente
AgarIBI ScientificIB49172Medienkomponente
AdeninsulfatSigmaA3159-25GMedienkomponente
KaliumacetatSigmaP1190-500GMedienkomponente
UracilSigmaU0750-100GMedienkomponente
HistidinSigmaH8000-100GMedienkomponente
LeucinSigmaL8000-25GMedienkomponente
LysinSigmaL5501-25GMedienkomponente
RNase I Thermo Fisher ScientificEN0601Enzym
biotinyliertes DNaseThermo Fisher ScientificAM1906Enzym
Zymolyase 100T (Hefelytisches Enzym)Sunrise ScienceN0766555Enzym
Mikroplatten-ReaderBioTekSynergy H1Ausrüstung
Mikroplatten-StaplerBioTekBioStack3Ausrüstung
Platte FüllerBiotTekEL406Ausrüstung
Liquid-Handling-RoboterBeckman CoulterBiomek FXEquipment

References

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