Methodenartikel

Screening bioaktiver Nanopartikel in phagozytischen Immunzellen für Inhibitoren der Toll-like Receptor Signaling

DOI:

10.3791/56075

⸱

26. Juli 2017

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1Department of Respiratory Medicine, Shanghai First People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, 2Department of Pediatrics, BC Children's Hospital and University of British Columbia

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Maut-like Rezeptor (TLR) -Signalisierung spielt eine wichtige Rolle bei der Pathophysiologie vieler menschlicher entzündlicher Erkrankungen, und die Regulierung der TLR-Reaktionen durch bioaktive Nanopartikel wird in vielen entzündlichen Zuständen als vorteilhaft angesehen. THP-1 zellbasierte Reporterzellen bieten eine vielseitige und robuste Screening-Plattform zur Identifizierung neuer Inhibitoren der TLR-Signalisierung.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die pharmakologische Regulation von Toll-like Rezeptor (TLR) Reaktionen ist ein großes Versprechen bei der Behandlung von vielen entzündlichen Erkrankungen. Allerdings gab es bisher nur begrenzte Verbindungen, um die TLR-Signalisierung zu dämpfen, und es gab keine klinisch zugelassenen TLR-Inhibitoren (mit Ausnahme des Anti-Malaria-Arzneimittels Hydroxychloroquin) in der klinischen Anwendung. Angesichts der rasanten Fortschritte in der Nanotechnologie kann die Manipulation der Immunantwort unter Verwendung von Nano-Geräten eine neue Strategie zur Behandlung dieser Krankheiten darstellen. Hierin präsentieren wir eine Hochdurchsatz-Screening-Methode zur schnellen Identifizierung von neuartigen bioaktiven Nanopartikeln, die die TLR-Signalisierung in phagozytischen Immunzellen hemmen. Diese Screening-Plattform basiert auf THP-1 zellbasierten Reporterzellen mit Kolorimetrie- und Luciferase-Assays. Die Reporterzellen werden aus der humanen THP-1 monozytischen Zelllinie durch stabile Integration von zwei induzierbaren Reporterkonstrukten konstruiert. Man drückt ein sezerniertes embryonales alkalisches Phosphatase (SEAP) -Gen ausUnter der Kontrolle eines durch die Transkriptionsfaktoren NF- & kgr; B und AP-1 induzierbaren Promotors, und der andere exprimiert ein sezerniertes Luciferase-Reportergen unter der Kontrolle von durch Interferon-regulatorische Faktoren (IRFs) induzierbaren Promotoren. Bei der TLR-Stimulation aktivieren die Reporterzellen Transkriptionsfaktoren und produzieren anschließend SEAP und / oder Luciferase, die mit ihren entsprechenden Substratreagenzien nachgewiesen werden können. Unter Verwendung einer Bibliothek von Peptid-Gold-Nanopartikel (GNP) Hybriden, die in unseren früheren Studien als Beispiel etabliert wurden, identifizierten wir ein Peptid-GNP-Hybrid, das die beiden Arme der TLR4-Signalkaskade, die durch seinen prototypischen Liganden, Lipopolysaccharid (LPS) ausgelöst wurde, wirksam hemmen könnte. Die Ergebnisse wurden durch Standard-biochemische Techniken einschließlich Immunoblotting validiert. Eine weitere Analyse ergab, dass dieser Blei-Hybrid ein breites inhibitorisches Spektrum hatte, das auf mehrere TLR-Wege, einschließlich TLR2, 3, 4 und 5, einwirkt. Dieser experimentelle Ansatz ermöglicht eine rasche Bewertung vonNanopartikel (oder andere therapeutische Verbindungen) können spezifische TLR-Signalisierung in phagozytischen Immunzellen modulieren.

Einleitung

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Mautartige Rezeptoren (TLRs) sind eines der Schlüsselelemente des angeborenen Immunsystems, das zur ersten Verteidigungslinie gegen Infektionen beiträgt. TLRs sind verantwortlich für die Erfassung von eindringenden Pathogenen durch die Erkennung eines Repertoires von pathogen-assoziierten molekularen Mustern (oder PAMPs) und Montage von Verteidigungsreaktionen durch eine Kaskade der Signaltransduktion 1 , 2 . Es gibt 10 menschliche TLRs identifiziert; Außer TLR10, für die der Ligand (s) unklar bleibt, kann jeder TLR eine deutliche, konservierte Gruppe von PAMPs erkennen. Beispielsweise können TLR2 und TLR4, die sich primär auf der Zelloberfläche befinden, Lipoproteine ​​und Glycolipide aus Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien nachweisen; Während TLR3, TLR7 / 8 und TLR9, die hauptsächlich in den endosomalen Kompartimenten vorhanden sind, RNA- und DNA-Produkte aus Viren und Bakterien spüren können 3 . Wenn sie durch PAMPs stimuliert werden, lösen TLRs wesentliche Immunantworten aus, indem sie pro-inf freisetzenLammatorische Mediatoren, Rekrutierung und Aktivierung von Effektor-Immunzellen und koordinieren nachfolgende adaptive Immunereignisse 4 .

Die TLR-Signalisierungstransduktion kann einfach in zwei Hauptwege 5 , 6 kategorisiert werden. Einer ist abhängig vom Adapterprotein myeloiden Differenzierungsfaktor 88 (MyD88) - dem MyD88-abhängigen Weg. Alle TLRs mit Ausnahme von TLR3 nutzen diesen Weg zur Aktivierung des Kappa-Light-Ketten-Enhancers von aktivierten B-Zellen (NF- & kgr; B) und Mitogen-assoziierten Proteinkinasen (MAPKs), was zur Expression von proinflammatorischen Mediatoren wie TNF- Α, IL-6 und IL-8. Der zweite Weg nutzt TIR-Domain-haltige Adapter-induzierende Interferon-β (TRIF) - den TRIF-abhängigen oder MyD88-unabhängigen Weg -, um Interferon (IFN) regulatorische Faktoren (IRFs) und NF-κB zu aktivieren, was zur Produktion von führt Typ I IFNs. Intakte TLR-SignalisierungIst entscheidend für unseren täglichen Schutz vor mikrobiellen und viralen Infektionen; Defekte in TLR-Signalwegen können zu Immunschwäche führen und sind oft schädlich für die menschliche Gesundheit. 7

Allerdings ist die TLR-Signalisierung ein "zweischneidiges Schwert" und eine übermäßige, unkontrollierte TLR-Aktivierung ist schädlich. Überaktive TLR-Antworten tragen zur Pathogenese bei vielen akuten und chronischen menschlichen entzündlichen Erkrankungen bei 8 , 9 bei . Zum Beispiel ist die Sepsis, die durch systemische Entzündungen und Multiorganverletzungen gekennzeichnet ist, vor allem auf akute, überwältigende Immunreaktionen auf Infektionen zurückzuführen, wobei TLR2 und TLR4 eine entscheidende Rolle bei der Sepsis-Pathophysiologie spielen 10 , 11 , 12 . Darüber hinaus wurde gefunden, dass TLR5 zur chronischen Lungenentzündung von Patienten mit zystischer Fibrose beiträgt 13, 14 Darüber hinaus ist die dysregulierte endosomale TLR-Signalisierung (zB TLR7 und TLR9) stark mit der Entwicklung und dem Fortschreiten mehrerer Autoimmunerkrankungen verbunden, einschließlich systemischer Lupus erythematodes (SLE) und rheumatoider Arthritis (RA) 15 , 16 . Diese konvergierenden Beweislinien identifizieren die TLR-Signalisierung als potentielles therapeutisches Ziel für viele entzündliche Erkrankungen 17 .

Obwohl die pharmakologische Regulation von TLR-Reaktionen in vielen entzündlichen Zuständen vorteilhaft ist, gibt es derzeit nur sehr wenige Verbindungen, die klinisch verfügbar sind, um die TLR-Signalisierung 9 , 17 , 18 zu hemmen. Dies ist teilweise auf die Komplexität und Redundanz der TLR-Wege in der Immun-Homöostase und Krankheit Pathologie beteiligt. Also suche nach neuem, potenT therapeutische Mittel, um mehrere TLR-Signalwege zu erreichen, könnten eine fundamentale Lücke überbrücken und die Herausforderung überwinden, TLR-Inhibitoren in die Klinik voranzutreiben.

Angesichts der rasanten Fortschritte in der Nanowissenschaften und der Nanotechnologie tauchen Nanodevices aufgrund ihrer einzigartigen Eigenschaften 19 , 20 , 23 als TLR-Modulatoren der nächsten Generation auf. Die nanoskalige Größe erlaubt diesen Nano-Therapeutika eine bessere Bioverteilung und nachhaltige Zirkulation 24 , 25 , 26 . Sie können weiter funktionalisiert werden, um die gewünschten pharmakodynamischen und pharmakokinetischen Profile 27 , 28 , 29 zu erfüllen. Aufregenderen entsteht die Bioaktivität dieser neuartigen Nanodonen aus ihren intrinsischen Eigenschaften, auf die man sich anpassen lässtSpezifische medizinische Anwendungen, anstatt einfach als Lieferwagen für ein therapeutisches Mittel zu wirken. Zum Beispiel wurde ein hochdichtes Lipoprotein (HDL) -ähnliches Nanopartikel zur Hemmung der TLR4-Signalisierung durch Spülen des TLR4-Liganden LPS 23 entwickelt . Darüber hinaus haben wir ein Peptid-Gold-Nanopartikel-Hybridsystem entwickelt, bei dem die dekorierten Peptide die Oberflächeneigenschaften der Goldnanopartikel verändern und ihnen verschiedene Bioaktivitäten 30 , 31 , 32 , 33 ermöglichen können . Dies macht sie zu einer besonderen Klasse von Medikamenten (oder "Nano-Drogen") als die nächste Generation Nano-Therapeutika.

In diesem Protokoll präsentieren wir einen Ansatz zur Identifizierung einer neuartigen Klasse von Peptid-Gold-Nanopartikel (Peptid-GNP) -Hybriden, die mehrere TLR-Signalwege in phagozytischen Immunzellen 32 , 33 Der Ansatz basiert auf handelsüblichen THP-1-Reporterzelllinien. Die Reporterzellen bestehen aus zwei stabilen, induzierbaren Reporterkonstrukten: Man trägt ein sekretiertes embryonales alkalisches Phosphatase (SEAP) -Gen unter der Kontrolle eines durch die Transkriptionsfaktoren NF-κB und Aktivatorprotein 1 (AP-1) induzierbaren Promotors; Die andere enthält ein sezerniertes Luciferase-Reporter-Gen unter der Kontrolle von Promotoren, die durch Interferon-regulatorische Faktoren (IRFs) induzierbar sind. Bei der TLR-Stimulation führt die Signaltransduktion zur Aktivierung von NF- & kgr; B / AP-1 und / oder IRFs, die die Reportergene zu geheimem SEAP und / oder Luciferase einschalten; Solche Ereignisse können mit ihren entsprechenden Substratreagenzien mit einem Spektrophotometer oder Luminometer leicht nachgewiesen werden. Mit diesem Ansatz, um unsere bisher etablierte Bibliothek von Peptid-GNP-Hybriden zu screenen, identifizierten wir Lead-Kandidaten, die TLR4-Signalwege stark hemmen können. Die inhibitorische Aktivität der Blei-Peptid-GNP-Hybriden wurden dann mit einem anderen biochemischen Ansatz des Immunoblottings validiert und auf anderen TLR-Wegen bewertet. Dieser Ansatz ermöglicht ein schnelles, effektives Screening von neuartigen Agenten, die auf TLR-Signalwege abzielen.

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Protokoll

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1. Herstellung von Zellkulturmedien und Reagenzien

  1. Bereiten Sie das gesamte Zellkulturmedium R10 vor, indem Sie die Ergänzungen von 10% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin und 1 mM Natriumpyruvat in das RPMI-1640-Medium hinzufügen.
    1. Bereiten Sie das Selektionskulturmedium R10-Z vor, indem Sie die Antibiotika Zeocin (200 μg / ml) zu R10 addieren, um die Expression von SEAP unter der Kontrolle der NF- & kgr; B / AP-1-Aktivierung aufrechtzuerhalten. Zur Auswahl von Zellen, die sowohl SEAP- als auch Luciferase-Reportergene exprimieren, fügen Sie sowohl Zeocin (100 μg / ml) als auch Blasticidin (10 μg / ml) zu R10 (als R10-ZB) hinzu.
  2. Die SEAP-Substratlösung durch Auflösen eines Beutels des Substratpulvers (z . B. QUANTI-Blue) in 100 ml hochreines, endotoxinfreies Wasser in einem sauberen 125 ml-Glaskolben vorbereiten.
    1. Die Lösung vorsichtig umdrehen und 1 Stunde bei 37 ° C inkubieren, um die vollständige Auflösung der Substrate zu gewährleisten.
    2. Die Lösung mit einer 0,2 μm Membran filtrieren, um ihre Sterilität (optional) zu gewährleisten und sie bei 4 ° C bis zu 2 Wochen vor Gebrauch zu lagern.
  3. Vorbereitung der Luciferase-Substratlösung durch Auflösen eines Beutels des Substratpulvers ( z. B. QUANTI-Luc) in 25 ml hochreines, endotoxinfreies Wasser in einem sterilen 50 ml-Zentrifugenröhrchen.
    1. Nach dem vollständigen Auflösen des Pulvers sofort die Lösung verwenden. Alternativ die Lösung bei 4 ° C (bis zu einer Woche) oder bei -20 ° C (bis zu einem Monat) vor Gebrauch aufbewahren.
      ACHTUNG: Beide Substratlösungen sind lichtempfindlich und sollten bei gleichzeitiger Belichtung vermeiden. Mehrere Gefrier-Tau-Zyklen der Lösung können Instabilität des Substrats verursachen und seine Haltbarkeit verkürzen.
  4. Bereiten Sie die Stammlösung von Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) in Dimethylsulfoxid mit molekularem Dimethylsulfoxid (DMSO) vor, um eine Konzentration von 500 μg / ml zu erhalten. Machen Sie Aliquots der Stammlösung (10 μl in einem 500 μl Röhrchen) und bei -20 ° C aufbewahren.
  5. LPS (E-coli K12) Stammlösung in sterilem, endotoxinfreiem Wasser in einer Konzentration von 5 mg / ml vorbereiten und Aliquots zur Langzeitlagerung bei -20 ° C herstellen. Bereiten Sie eine funktionierende LPS-Lösung vor, indem Sie das LPS in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einer Konzentration von 100 μg / ml verdünnen und vor der Verwendung bei -20 ° C aufbewahren.
    ACHTUNG: Die Reagenzzubereitung für Kulturzwecke sollte in einem Biosicherheitsschrank durchgeführt werden, und alle Behälter sollten vor der Verwendung sterilisiert werden. Wiederholte Frost-Tau-Zyklen von PMA- und LPS-Lösungen sollten vermieden werden.

2. Kultur von THP-1-Reporterzellen-abgeleiteten Makrophagen

  1. Verwenden Sie zwei THP-1 Reporterzelllinien: THP-1-XBlue und THP-1-Dual Zellen. Das erstere hat ein SEAP-Reportergen, das durch NF-κB / AP-1 gesteuert wird, und das letztere hat ein Dual-Reporter-Gensystem, das gleiche SEAP-Reportergen und ein IRF-kontrolliertes Luciferase-Gen. DasIr Kulturverfahren sind identisch mit Ausnahme der Auswahl Kulturmedien.
    1. Tauen Sie eine Arbeitszelle (~ 5 x 10 6 Zellen) in 10 ml R10-Medium auf, spinnen Sie die Zellen bei 300 xg für 5 min ab. Zellen in 10 ml R10-Medium resuspendieren und in einen T75-Kulturkolben überführen. Tauschen Sie das Kulturmedium alle 2-3 Tage , bis die Zellen mit einer Dichte von 1 x 10 6 Zellen / ml erreichen.
    2. Wenn das Zellwachstum seine Kapazität erreicht hat , Durchgangszellen , die Zelldichte im Bereich von 2-5 x 10 5 Zellen / ml, zu reduzieren , so können die Zellen weiter wachsen.
    3. Nach mindestens 1 Passage beginnen sie, die Zellen im Selektionskulturmedium zu kultivieren: R10-Z für THP-1-XBlue und R10-ZB für THP-1-Dual. Nach dem Kultivieren der Zellen mit Selektionskulturmedium für mindestens 1 Durchgang sind die Zellen für den Versuch bereit.
      ACHTUNG: Zellüberwachsen kann zu signifikantem Zelltod führen Die Zelllebensfähigkeit sollte> 98% beibehalten. Halten Sie eine Aufzeichnung der Passage Nummer als celIch kann sich nach vielen Passagen (> 20 Passagen) anders verhalten.
      ANMERKUNG: Zellkulturflaschen können mehrmals wiederverwendet werden, um Kosten zu sparen; Diese Praxis kann jedoch das Risiko einer allgemeinen Kontamination und Kreuzkontamination zwischen verschiedenen Flaschen erhöhen (bei gleichzeitiger Handhabung unterschiedlicher Zelllinien). Während des Medienaustauschs und des Zelldurchgangs wird die Zentrifugation für 5 min auf 300 xg eingestellt.
  2. Um Reporter-Zell-Assay, Samen-Zellen in eine 96-Well-Flat-Bottom-Zell-Kultur-Platte und differenzieren sie in Makrophagen. Die Vorgehensweisen werden im Folgenden beschrieben.
    1. Die Zellen aus dem Kolben in ein Zentrifugenröhrchen geben, die Zellen bei 300 xg für 5 min abreiben und im R10-Medium in einer Konzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml resuspendieren. Fügen Sie Aliquots der PMA-Lösung in die Zellsuspensionen mit einer Endkonzentration von 50 ng / ml hinzu.
    2. Übertragen Sie 100 μl der Zellsuspensionen in jede Vertiefung der 96-wirLl Platte mit einer Mehrkanalpipette. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C (in einem Zellkulturinkubator) für 24 h.
    3. Nach der Inkubation das Kulturmedium vorsichtig mit einem Vakuumsauger (oder mit einer Mehrkanalpipette) entfernen und die Zellen vorsichtig mit PBS (100 μl / Vertiefung) zweimal waschen; 100 μl frisches R10-Medium in jede Vertiefung geben. Rest die Zellen für 2 Tage in einem Inkubator vor der Durchführung der Reporter-Assay.
      ACHTUNG: Der Ruheschritt ist sehr wichtig, damit sich die Zellen nach der PMA-Stimulation auf ihren normalen Ruhezustand beruhigen können. Dies kann die Hintergrundsignale der Reportergene unter unstimulierten Bedingungen signifikant reduzieren.
      ANMERKUNG: Nach 24 Stimulation mit PMA werden die Zellen in den Makrophagen-ähnlichen Phänotyp unterschieden, mit einer Charakteristik der Zelladhäsion am Boden des Brunnens und einem morphologischen Merkmal von Pseudopodien.

3. Screening auf Potential TLR4 Nano-Inhibitoren mit den Reporterzellen

HINWEIS: Da die TLR4-Signalisierung sowohl MyD88-abhängige als auch TRIF-abhängige Pfade verwendet, wird sie als primäres Ziel ausgewählt, um eine breite Palette von TLR-Signalwegen zu umfassen. THP-1-XBlue-Reporterzellen werden verwendet, um hauptsächlich die NF- & kgr; B / AP-1-Aktivierung zu untersuchen, während THP-1-Dual-Zellen für die IRF-Aktivierung aus der TRIF-abhängigen Signaltransduktion sind.

  1. Identifizieren Sie die optimale LPS-Dosis durch Erzeugen einer Dosis-Wirkungs-Kurve vor dem Screening.
    1. Verdünnen Sie die Arbeits-LPS-Lösung auf eine Endkonzentration von 0,01 - 100 ng / ml in R10-Medium (Verdünnung in log10-Skala). Layout der Platten-Design und verdünnen in einer 96-Well-Runde-Boden-Kulturplatte. Stellen Sie sicher, dass jede Vertiefung nach der Verdünnung mindestens 110 μl Lösung hat.
    2. Entfernen Sie vorsichtig das Kulturmedium aus der zellbetonten Platte (ab 2.2.3) mit einem Vakuumsauger.
    3. Übertragen Sie das LPS, das R10-Medium enthält, das in der Verdünnungsplatte (3.1.1) hergestellt wurdeNto der Kulturplatte nach dem Layout der Proben. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C (in einem Zellkulturinkubator) für 24 h.
    4. Nach 24 h die Überstände (80 μl / well) sorgfältig in eine neue 96-Well-Rundbodenplatte überführen. Den kolorimetrischen und / oder Luciferase-Lumineszenz-Assay sofort auf diese Lösungen durchführen oder bei 4 ° C (mehrere Stunden) oder -20 ° C (Tage) vor der Assay-Entwicklung aufbewahren.
      HINWEIS: Die Gestaltung des Plattenlayouts sollte für Experimente und Datenanalysen einfach und klar sein. Für jede Bedingung sollten 2-4 Wiederholungen berücksichtigt werden. Immer eine negative Kontrollgruppe (LPS null) einschließen. Es wird empfohlen, THP-1-XBlue-Zellen für die NF- & kgr; B / AP-1-Aktivierung zu verwenden, da die Dualzellen einen relativ hohen Hintergrund der NF-κB / AP-1-Aktivierung aufweisen, nachdem sie in Makrophagen unterschieden wurden. Es ist jedoch möglich, die Dual-Zellen für die Meldung von NF-κB / AP-1 und IRF-Aktivierung zu verwenden.
  2. Entwickeln Sie die FarbeImetric Assay für die NF- & kgr; B / AP-1-Aktivierung und den Luciferase-Lumineszenz-Assay für die IRF-Aktivierung.
    1. Zur Beurteilung der NF- & kgr; B / AP-1-Aktivierung werden 20 & mgr; l des Überstandes jeder Probe in eine neue 96-Well-Flachboden-Kulturplatte übertragen; Und füge 180 μl vorgewärmte SEAP-Substratlösung in jede Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für 1 - 2 h, um die Farbentwicklung zu ermöglichen (rosa bis dunkelblau). Sammle die Absorption bei 655 nm auf einem Plattenleser.
      ACHTUNG: Die Inkubationszeit kann auf Basis der Farbentwicklung (30 min bis zur Inkubation über Nacht) variiert werden. Es wird empfohlen, zu warten, bis die optische Dichte (OD) der dunkelsten Farbe über 1 reicht, während die Sättigung der Farbentwicklung (OD> 3) vermieden wird.
    2. Für die Analyse der IRF-Aktivierung werden 10 & mgr; l des Überstandes jeder Probe in eine 96-Well-Clear-Flat-Bottom-Weißplatte gegeben. Füge die Luciferase-Lösung (50 μl) hinzu und sammle sofort die Lumineszenz wEll von gut
      HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, einen Lumineszenz-Plattenleser mit einer Auto-Injection-Funktion zu verwenden, um die Konsistenz in der Lumineszenzmessung von gut bis gut und von Platte zu Platte zu gewährleisten. Wenn die Substratlösungen manuell injiziert werden, stellen Sie bitte eine konsistente Inkubationszeit und Leseeinstellung für jede Vertiefung sicher.
  3. Führen Sie den Screening-Assay auf verschiedene Peptid-GNP-Hybriden mit 10 ng / mL LPS-Stimulation (basierend auf 3.1) durch. Befolgen Sie das gleiche Verfahren in 3.2 für die Reporter-Assay-Entwicklung.
    1. Konzentrieren Sie die Peptid-GNP-Hybride auf 200 nM in R10-Medium unter Verwendung des Zentrifugationsverfahrens. 20 Volumina der Hybridlösung (10 nM) bei 18.000 xg für 30 min zentrifugieren und die Überstände sorgfältig verwerfen. Sammeln Sie die Hybriden (am Boden des Röhrchens) in ein Röhrchen, waschen Sie sie mit PBS zweimal und setzen Sie die Hybriden in einem Volumen des R10-Mediums wieder auf.
    2. Mischen Sie gleiche Volumina der konzentrierten Hybriden und derLPS (20 ng / ml), das R10-Medium enthält, um eine Endkonzentration der Hybride und LPS zu 100 nM bzw. 10 ng / ml zu haben.
    3. Das Kulturmedium aus der kultivierten Platte (2.2.3) entfernen und 100 μl der gemischten Lösung in jede Vertiefung geben (3 repliziert für jede Bedingung); Eine negative Kontrolle (nur Medium) und eine LPS-Kontrolle (10 ng / mL LPS ohne Hybriden).
    4. Nach 24 h Inkubation bei 37 ° C wird das Medium jeder Vertiefung in ein Röhrchen gegeben und die Röhrchen bei 18.000 xg, 4 ° C für 30 min zentrifugiert. Sammeln Sie die Überstände (50-80 μl / Tube) in eine 96-Well-Round-Bottom-Platte und führen Sie den Reporter-Assay wie in 3.2 beschrieben durch.
      ACHTUNG: Beim Verwerfen der Überstände nach der Zentrifugation dürfen die Hybriden nicht an der Unterseite des Röhrchens gerührt werden.
      HINWEIS: Die Zentrifugation im Schritt 3.3.4 ist sehr wichtig, um die nicht internalisierten Nanopartikel-Hybride aus dem Kulturmedium zu entfernen und die Interferenz der Hybriden mit dem Co zu vermeidenLorimetrische / lumineszenzwerte. Dies liegt daran, dass die Gold-Nanopartikel je nach Größe und Agglomeration breite Lichtwellenlängen aufnehmen können.

4. Validierung der Hemmwirkung der potentiellen Kandidaten

HINWEIS: Um die Hemmwirkung der potentiellen Kandidaten vom Screening zu bestätigen, werden zwei Ansätze angewendet. Man soll die Dosisreaktionen der Stimulanzien (LPS) bei einer festen Hybridkonzentration (oder umgekehrt) untersuchen; Die andere ist, die Hemmung der NF-κB / AP-1 und IRF3 Signale direkt über Immunoblotting zu betrachten.

  1. Im Ansatz 1, führen Sie den Reporter-Assay mit 100 nM der Blei-Hybriden und zwei LPS-Konzentrationen bei 1 ng / ml und 10 ng / mL nach den gleichen Verfahren wie in 3.3 beschrieben. Include ein inaktives Hybrid (basierend auf den Screening-Ergebnissen) als Hybrid-Kontrolle zum Vergleich.
  2. Für den Immunoblotting-Ansatz folgen Sie bitte dem Standard eXperimentales Verfahren.
    1. Kultur THP-1 - Zellen in R10 - Medium, Samen , die Zellen in eine 12-Well - Kulturplatte (2 x 10 6 Zellen / Vertiefung), und in Makrophagen differenzieren , indem die Zellen mit 50 ng / ml PMA Behandlung für 24 h , gefolgt von Ruhe 2 Tage lang.
    2. Nach der Zelldifferenzierung stimulieren die Zellen mit 10 ng / ml LPS mit / ohne Hybriden (100 nM) über die Zeit (bis zu 4 h). Zu verschiedenen Zeitpunkten (0, 5, 15, 30, 60, 120 und 240 min) bereiten die Zelllysate für das Immunoblotting vor. Füge einen inaktiven Hybrid als Kontrolle ein.
    3. Sonden die Signale von IκBα, phosphoryliertem p65 und phosphoryliertem IRF3, um die hemmende Wirkung der Blei-Hybride auf die Aktivierung von NF-κB und IRF3 zu untersuchen. Sonde die β-Aktin- und Total-IRF3-Signale als interne Kontrollen.
      HINWEIS: Die Signaltransduktion tritt oft viel schneller auf (in wenigen Stunden), dann wird die Expression des Reporters SEAP und Luciferase (24 h). Es wird dringend empfohlen, auch perforMaisierbarkeitstest der getesteten Hybriden um 24 h als weitere Validierungsmethode.

5. Auswertung der TLR-Spezifität

HINWEIS: Um die TLR-Spezifität des Blei-Peptid-GNP-Hybrids zu untersuchen, werden andere TLR-Signalwege getestet, einschließlich TLR2, TLR3 und TLR5. TLR7, 8 und 9 sind ausgeschlossen, da die von THP-1 abgeleiteten Makrophagen aufgrund der fehlenden TLR7-, 8- und 9-Expression in Makrophagen 34 nicht gut auf die Stimulation dieser TLRs reagieren.

  1. Testen Sie verschiedene Konzentrationen (1 ng / ml bis 25 μg / ml) der für TLR2 (Pam3CSK4), TLR3 (Poly I: C) und TLR5 (Flagellin) spezifischen Liganden auf beiden Reporterzellen, die Makrophagen abgeleitet haben, um die optimale Konzentration nach demselben zu erhalten Verfahren in 3.1 und 3.2.
  2. Behandeln Sie die Zellen mit den Mischungen des Bleihybrids (100 nM) und jedes TLR-Liganden in der aus 5.1 erhaltenen Konzentration, um die inhibitorische Spezifität des Blei h zu bewertenYbrid nach dem in 3.3 beschriebenen experimentellen Verfahren. Füge den inaktiven Hybrid als Kontrolle zum Vergleich ein.

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Ergebnisse

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Der gesamte experimentelle Ansatz ist in Abbildung 1 dargestellt . Die beiden THP-1-Reporterzelllinien THP-1-XBlue und THP-1-Dual werden verwendet, um die TLR-Antworten schnell zu screenen, indem sie die Aktivierung von NF-κB / AP-1 bzw. IRFs untersuchen. Die Aktivierung von NF-κB / AP-1 kann durch den SEAP-Kolorimetrie-Assay nachgewiesen werden, während die IRF-Aktivierung durch Luciferase-Lumineszenz überwacht wird. Die monozytischen THP-1-Zellen können le...

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Diskussion

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Da TLRs an der Pathogenese vieler entzündlicher Erkrankungen beteiligt sind, haben sie sich als therapeutische Ziele für die Modulation von Immunantworten und entzündlichen Zuständen entwickelt. Allerdings hat die klinische Entwicklung von Therapeutika, um TLR-Signalwege zu hemmen, bisher nur begrenzten Erfolg. Das Antimalarialmedikament Hydroxychloroquin, das TLR7 und TLR9 hemmt, ist in der klinischen Anwendung 35 , 36 . Ähnlich ist nur eine begrenzte Anzahl vo...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren möchten die Unterstützung des Programms für Professor für Sonderveranstaltung (Eastern Scholar) bei Shanghai Institutionen of Higher Learning (HY), dem Startfonds von Shanghai First People's Hospital (HY), Gaofeng Clinical Medicine Grant Unterstützung von Shanghai Jiaotong anerkennen University School of Medicine (HY), und die Finanzierung von der Crohn und Colitis Foundation of Canada (CCFC) (SET und HY).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
THP-1-XBlue ReporterzelleInvivoGenthpx-sphält die Zellkulturpassage unter 20
THP-1-Dual Repoter cellInvivoGenthpd-nfishält die Zellkulturpassage unter 20
RPMI-1640 (kein L-Glutamin)GE Health CareSH30096.02Aufwärmen auf 37 &de; C vor dem Gebrauch; Fügen Sie Nahrungsergänzungsmittel hinzu, um ein vollständiges Medium R10
Fötales Rinderserum (qualifiziert)Thermo Fisher Scientific12484028Hitze inaktiviert; 10% in RPMI-1640
L-GlutaminThermo Fisher ScientificSH30034.022 mM im vollständigen Medium R10
NatriumpyruvatThermo Fisher Scientific11360-0701 mM im vollständigen Medium R10
Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 1X, ohne Calcium, MagnesiumGE Health CareSH30028.02Verwendung zum Waschen von Zellen und zur Vorbereitung von Reagenzien
QUANTI-BlueInvivoGenrep-qb1SEAP-Substrat
QUANTI-LucInvivoGenrep-qlc2Luziferase-Substrat
ZeocinInvivoGenant-zn-1Auswahl Antibiotika für Reporterzellen
BlasticidinInvivoGenanti-bl-1Selektion Antibiotika für Reporterzellen
Dimethylsulfoxid (DMSO) für die MolekularbiologieSigmal-AldrichD8418-100MLVerwendung für die Reagenzienherstellung
Phorbol 12-Myristat-13-acetat (PMA) für die MolekularbiologieSigmal-AldrichP1585-1MGVerwendung für die Zelldifferenzierung
Lipopolysaccharid (LPS) aus E. coli K12InvivoGentlrl-eklpsTLR4-Ligand
Pam3CSK4InvivoGentlrl-pmsTLR2/1-Ligand
Poly (I:C) HMWInvivoGentlrl-picTLR3-Ligand
Flagellin aus S. Typhimurium (FLA-ST), hochreinerInvivoGentlrl-epstflaTLR5-Ligand
SpectraMax Plus 384 Mikroplatten-ReaderMolecular DevicesN/AKolorimetrischer Assay lesen
Infinite M200 Pro Multimode-Mikroplatten-Reader mit InjektorenTecanN/ARead luminiscience
Microfuge 22R ZentrifugeBeckman CoulterN/ATemperaturgesteuerter Mikrozentrifugator (bis zu 18.000 g)
Allegra X-15R ZentrifugeBeckman CoulterN/ATemperaturgesteuerter Allzweckzentrifugator (für den Einsatz in Zellkulturen)
Costar Assay-Platte, 96-Well-Weiß, mit klarem, flachem Boden, mit Gewebekultur behandeltCorning Costar3903Wird für Luminiszenz-Assays verwendet

Referenzen

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  1. Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol. 4 (7), 499-511 (2004).
  2. Beutler, B. A. TLRs and innate immunity. Blood. 113 (7), 1399-1407 (2009).
  3. Gay, N. J., Symmons, M. F., Gangloff, M., Bryant, C. E. Assembly and localization of Toll-like receptor signalling complexes. Nat Rev Immunol. 14 (8), 546-558 (2014).
  4. Palm, N. W., Medzhitov, R. Pattern recognition receptors and control of adaptive immunity. Immunol Rev. 227 (1), 221-233 (2009).
  5. Kawasaki, T., Kawai, T. Toll-like receptor signaling pathways. Front Immunol. 5, 461(2014).
  6. Uematsu, S., Akira, S. Toll-like receptors and Type I interferons. J Biol Chem. 282 (21), 15319-15323 (2007).
  7. Maglione, P. J., Simchoni, N., Cunningham-Rundles, C. Toll-like receptor signaling in primary immune deficiencies. Ann N Y Acad Sci. 1356, 1-21 (2015).
  8. Drexler, S. K., Foxwell, B. M. The role of toll-like receptors in chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 506-518 (2010).
  9. O'Neill, L. A., Bryant, C. E., Doyle, S. L. Therapeutic targeting of Toll-like receptors for infectious and inflammatory diseases and cancer. Pharmacol Rev. 61 (2), 177-197 (2009).
  10. Harter, L., Mica, L., Stocker, R., Trentz, O., Keel, M. Increased expression of toll-like receptor-2 and -4 on leukocytes from patients with sepsis. Shock. 22 (5), 403-409 (2004).
  11. Roger, T., et al. Protection from lethal gram-negative bacterial sepsis by targeting Toll-like receptor 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (7), 2348-2352 (2009).
  12. Tsujimoto, H., et al. Role of Toll-like receptors in the development of sepsis. Shock. 29 (3), 315-321 (2008).
  13. Blohmke, C. J., et al. TLR5 as an anti-inflammatory target and modifier gene in cystic fibrosis. J Immunol. 185 (12), 7731-7738 (2010).
  14. Hartl, D., et al. Innate immunity in cystic fibrosis lung disease. J Cyst Fibros. 11 (5), 363-382 (2012).
  15. Celhar, T., Fairhurst, A. M. Toll-like receptors in systemic lupus erythematosus: potential for personalized treatment. Front Pharmacol. 5, 265(2014).
  16. Chen, J. Q., Szodoray, P., Zeher, M. Toll-Like Receptor Pathways in Autoimmune Diseases. Clin Rev Allergy Immunol. 50 (1), 1-17 (2016).
  17. Hennessy, E. J., Parker, A. E., O'Neill, L. A. Targeting Toll-like receptors: emerging therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (4), 293-307 (2010).
  18. Hedayat, M., Netea, M. G., Rezaei, N. Targeting of Toll-like receptors: a decade of progress in combating infectious diseases. Lancet Infect Dis. 11 (9), 702-712 (2011).
  19. Huang, L., et al. Engineering DNA nanoparticles as immunomodulatory reagents that activate regulatory T cells. J Immunol. 188 (10), 4913-4920 (2012).
  20. Lemos, H., et al. Activation of the STING adaptor attenuates experimental autoimmune encephalitis. J Immunol. 192 (12), 5571-5578 (2014).
  21. Hess, K. L., Andorko, J. I., Tostanoski, L. H., Jewell, C. M. Polyplexes assembled from self-peptides and regulatory nucleic acids blunt toll-like receptor signaling to combat autoimmunity. Biomaterials. 118, 51-62 (2017).
  22. Tostanoski, L. H., et al. Design of Polyelectrolyte Multilayers to Promote Immunological Tolerance. ACS Nano. , (2016).
  23. Foit, L., Thaxton, C. S. Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles potently inhibit cell signaling and production of inflammatory mediators induced by lipopolysaccharide binding Toll-like receptor 4. Biomaterials. 100, 67-75 (2016).
  24. He, C., Hu, Y., Yin, L., Tang, C., Yin, C. Effects of particle size and surface charge on cellular uptake and biodistribution of polymeric nanoparticles. Biomaterials. 31 (13), 3657-3666 (2010).
  25. Hirn, S., et al. Particle size-dependent and surface charge-dependent biodistribution of gold nanoparticles after intravenous administration. Eur J Pharm Biopharm. 77 (3), 407-416 (2011).
  26. Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nat Biotechnol. 33 (9), 941-951 (2015).
  27. Arvizo, R. R., et al. Modulating pharmacokinetics, tumor uptake and biodistribution by engineered nanoparticles. PLoS One. 6 (9), e24374(2011).
  28. Ernsting, M. J., Murakami, M., Roy, A., Li, S. D. Factors controlling the pharmacokinetics, biodistribution and intratumoral penetration of nanoparticles. J Control Release. 172 (3), 782-794 (2013).
  29. Lin, P. J., Tam, Y. K. Enhancing the pharmacokinetic/pharmacodynamic properties of therapeutic nucleotides using lipid nanoparticle systems. Future Med Chem. 7 (13), 1751-1769 (2015).
  30. Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (41), 9643-9646 (2011).
  31. Yang, H., et al. Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. Particle & Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).
  32. Yang, H., et al. Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).
  33. Yang, H., et al. Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells. Biomaterials. 111, 90-102 (2016).
  34. Ospelt, C., Gay, S. TLRs and chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 495-505 (2010).
  35. Kuznik, A., et al. Mechanism of endosomal TLR inhibition by antimalarial drugs and imidazoquinolines. J Immunol. 186 (8), 4794-4804 (2011).
  36. Lee, S. J., Silverman, E., Bargman, J. M. The role of antimalarial agents in the treatment of SLE and lupus nephritis. Nat Rev Nephrol. 7 (12), 718-729 (2011).
  37. Mullarkey, M., et al. Inhibition of endotoxin response by e5564, a novel Toll-like receptor 4-directed endotoxin antagonist. J Pharmacol Exp Ther. 304 (3), 1093-1102 (2003).
  38. Barochia, A., Solomon, S., Cui, X., Natanson, C., Eichacker, P. Q. Eritoran tetrasodium (E5564) treatment for sepsis: review of preclinical and clinical studies. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 7 (4), 479-494 (2011).
  39. Rossignol, D. P., et al. Safety, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and plasma lipoprotein distribution of eritoran (E5564) during continuous intravenous infusion into healthy volunteers. Antimicrob Agents Chemother. 48 (9), 3233-3240 (2004).
  40. Rossignol, D. P., Wong, N., Noveck, R., Lynn, M. Continuous pharmacodynamic activity of eritoran tetrasodium, a TLR4 antagonist, during intermittent intravenous infusion into normal volunteers. Innate Immun. 14 (6), 383-394 (2008).
  41. Tidswell, M., et al. Phase 2 trial of eritoran tetrasodium (E5564), a toll-like receptor 4 antagonist, in patients with severe sepsis. Crit Care Med. 38 (1), 72-83 (2010).
  42. Opal, S. M., et al. Effect of eritoran, an antagonist of MD2-TLR4, on mortality in patients with severe sepsis: the ACCESS randomized trial. JAMA. 309 (11), 1154-1162 (2013).
  43. Fung, S. Y., et al. Unbiased screening of marine sponge extracts for anti-inflammatory agents combined with chemical genomics identifies girolline as an inhibitor of protein synthesis. ACS Chem Biol. 9 (1), 247-257 (2014).

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