Methodenartikel

Screening bioaktiver Nanopartikel in phagozytischen Immunzellen für Inhibitoren der Toll-like Receptor Signaling

DOI:

10.3791/56075

⸱

26. Juli 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Respiratory Medicine, Shanghai First People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, 2Department of Pediatrics, BC Children's Hospital and University of British Columbia

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Maut-like Rezeptor (TLR) -Signalisierung spielt eine wichtige Rolle bei der Pathophysiologie vieler menschlicher entzündlicher Erkrankungen, und die Regulierung der TLR-Reaktionen durch bioaktive Nanopartikel wird in vielen entzündlichen Zuständen als vorteilhaft angesehen. THP-1 zellbasierte Reporterzellen bieten eine vielseitige und robuste Screening-Plattform zur Identifizierung neuer Inhibitoren der TLR-Signalisierung.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die pharmakologische Regulation von Toll-like Rezeptor (TLR) Reaktionen ist ein großes Versprechen bei der Behandlung von vielen entzündlichen Erkrankungen. Allerdings gab es bisher nur begrenzte Verbindungen, um die TLR-Signalisierung zu dämpfen, und es gab keine klinisch zugelassenen TLR-Inhibitoren (mit Ausnahme des Anti-Malaria-Arzneimittels Hydroxychloroquin) in der klinischen Anwendung. Angesichts der rasanten Fortschritte in der Nanotechnologie kann die Manipulation der Immunantwort unter Verwendung von Nano-Geräten eine neue Strategie zur Behandlung dieser Krankheiten darstellen. Hierin präsentieren wir eine Hochdurchsatz-Screening-Methode zur schnellen Identifizierung von neuartigen bioaktiven Nanopartikeln, die die TLR-Signalisierung in phagozytischen Immunzellen hemmen. Diese Screening-Plattform basiert auf THP-1 zellbasierten Reporterzellen mit Kolorimetrie- und Luciferase-Assays. Die Reporterzellen werden aus der humanen THP-1 monozytischen Zelllinie durch stabile Integration von zwei induzierbaren Reporterkonstrukten konstruiert. Man drückt ein sezerniertes embryonales alkalisches Phosphatase (SEAP) -Gen ausUnter der Kontrolle eines durch die Transkriptionsfaktoren NF- & kgr; B und AP-1 induzierbaren Promotors, und der andere exprimiert ein sezerniertes Luciferase-Reportergen unter der Kontrolle von durch Interferon-regulatorische Faktoren (IRFs) induzierbaren Promotoren. Bei der TLR-Stimulation aktivieren die Reporterzellen Transkriptionsfaktoren und produzieren anschließend SEAP und / oder Luciferase, die mit ihren entsprechenden Substratreagenzien nachgewiesen werden können. Unter Verwendung einer Bibliothek von Peptid-Gold-Nanopartikel (GNP) Hybriden, die in unseren früheren Studien als Beispiel etabliert wurden, identifizierten wir ein Peptid-GNP-Hybrid, das die beiden Arme der TLR4-Signalkaskade, die durch seinen prototypischen Liganden, Lipopolysaccharid (LPS) ausgelöst wurde, wirksam hemmen könnte. Die Ergebnisse wurden durch Standard-biochemische Techniken einschließlich Immunoblotting validiert. Eine weitere Analyse ergab, dass dieser Blei-Hybrid ein breites inhibitorisches Spektrum hatte, das auf mehrere TLR-Wege, einschließlich TLR2, 3, 4 und 5, einwirkt. Dieser experimentelle Ansatz ermöglicht eine rasche Bewertung vonNanopartikel (oder andere therapeutische Verbindungen) können spezifische TLR-Signalisierung in phagozytischen Immunzellen modulieren.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mautartige Rezeptoren (TLRs) sind eines der Schlüsselelemente des angeborenen Immunsystems, das zur ersten Verteidigungslinie gegen Infektionen beiträgt. TLRs sind verantwortlich für die Erfassung von eindringenden Pathogenen durch die Erkennung eines Repertoires von pathogen-assoziierten molekularen Mustern (oder PAMPs) und Montage von Verteidigungsreaktionen durch eine Kaskade der Signaltransduktion 1 , 2 . Es gibt 10 menschliche TLRs identifiziert; Außer TLR10, für die der Ligand (s) unklar bleibt, kann jeder TLR eine deutliche, konservierte Gruppe von PAMPs erkennen. Beispielsweise können TLR2 und TLR4, d....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Herstellung von Zellkulturmedien und Reagenzien

  1. Bereiten Sie das gesamte Zellkulturmedium R10 vor, indem Sie die Ergänzungen von 10% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin und 1 mM Natriumpyruvat in das RPMI-1640-Medium hinzufügen.
    1. Bereiten Sie das Selektionskulturmedium R10-Z vor, indem Sie die Antibiotika Zeocin (200 μg / ml) zu R10 addieren, um die Expression von SEAP unter der Kontrolle der NF- & kgr; B / AP-1-Aktivierung aufrechtzuerhalten. Zur Auswahl von Zellen, die sowohl SEAP- als auch Luciferase-Reportergene exprimieren, fügen Sie sowohl Zeocin (100 μg / ml) als auch Blasticidin (10 μg / ml) zu R10 (als R10-ZB) hi....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der gesamte experimentelle Ansatz ist in Abbildung 1 dargestellt . Die beiden THP-1-Reporterzelllinien THP-1-XBlue und THP-1-Dual werden verwendet, um die TLR-Antworten schnell zu screenen, indem sie die Aktivierung von NF-κB / AP-1 bzw. IRFs untersuchen. Die Aktivierung von NF-κB / AP-1 kann durch den SEAP-Kolorimetrie-Assay nachgewiesen werden, während die IRF-Aktivierung durch Luciferase-Lumineszenz überwacht wird. Die monozytischen THP-1-Zellen können le.......

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Da TLRs an der Pathogenese vieler entzündlicher Erkrankungen beteiligt sind, haben sie sich als therapeutische Ziele für die Modulation von Immunantworten und entzündlichen Zuständen entwickelt. Allerdings hat die klinische Entwicklung von Therapeutika, um TLR-Signalwege zu hemmen, bisher nur begrenzten Erfolg. Das Antimalarialmedikament Hydroxychloroquin, das TLR7 und TLR9 hemmt, ist in der klinischen Anwendung 35 , 36 . Ähnlich ist nur eine begrenzte Anzahl vo.......

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren möchten die Unterstützung des Programms für Professor für Sonderveranstaltung (Eastern Scholar) bei Shanghai Institutionen of Higher Learning (HY), dem Startfonds von Shanghai First People's Hospital (HY), Gaofeng Clinical Medicine Grant Unterstützung von Shanghai Jiaotong anerkennen University School of Medicine (HY), und die Finanzierung von der Crohn und Colitis Foundation of Canada (CCFC) (SET und HY).

....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
THP-1-XBlue ReporterzelleInvivoGenthpx-sphält die Zellkulturpassage unter 20
THP-1-Dual Repoter cellInvivoGenthpd-nfishält die Zellkulturpassage unter 20
RPMI-1640 (kein L-Glutamin)GE Health CareSH30096.02Aufwärmen auf 37 &de; C vor dem Gebrauch; Fügen Sie Nahrungsergänzungsmittel hinzu, um ein vollständiges Medium R10
Fötales Rinderserum (qualifiziert)Thermo Fisher Scientific12484028Hitze inaktiviert; 10% in RPMI-1640
L-GlutaminThermo Fisher ScientificSH30034.022 mM im vollständigen Medium R10
NatriumpyruvatThermo Fisher Scientific11360-0701 mM im vollständigen Medium R10
Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 1X, ohne Calcium, MagnesiumGE Health CareSH30028.02Verwendung zum Waschen von Zellen und zur Vorbereitung von Reagenzien
QUANTI-BlueInvivoGenrep-qb1SEAP-Substrat
QUANTI-LucInvivoGenrep-qlc2Luziferase-Substrat
ZeocinInvivoGenant-zn-1Auswahl Antibiotika für Reporterzellen
BlasticidinInvivoGenanti-bl-1Selektion Antibiotika für Reporterzellen
Dimethylsulfoxid (DMSO) für die MolekularbiologieSigmal-AldrichD8418-100MLVerwendung für die Reagenzienherstellung
Phorbol 12-Myristat-13-acetat (PMA) für die MolekularbiologieSigmal-AldrichP1585-1MGVerwendung für die Zelldifferenzierung
Lipopolysaccharid (LPS) aus E. coli K12InvivoGentlrl-eklpsTLR4-Ligand
Pam3CSK4InvivoGentlrl-pmsTLR2/1-Ligand
Poly (I:C) HMWInvivoGentlrl-picTLR3-Ligand
Flagellin aus S. Typhimurium (FLA-ST), hochreinerInvivoGentlrl-epstflaTLR5-Ligand
SpectraMax Plus 384 Mikroplatten-ReaderMolecular DevicesN/AKolorimetrischer Assay lesen
Infinite M200 Pro Multimode-Mikroplatten-Reader mit InjektorenTecanN/ARead luminiscience
Microfuge 22R ZentrifugeBeckman CoulterN/ATemperaturgesteuerter Mikrozentrifugator (bis zu 18.000 g)
Allegra X-15R ZentrifugeBeckman CoulterN/ATemperaturgesteuerter Allzweckzentrifugator (für den Einsatz in Zellkulturen)
Costar Assay-Platte, 96-Well-Weiß, mit klarem, flachem Boden, mit Gewebekultur behandeltCorning Costar3903Wird für Luminiszenz-Assays verwendet

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol. 4 (7), 499-511 (2004).
  2. Beutler, B. A. TLRs and innate immunity. Blood. 113 (7), 1399-1407 (2009).
  3. Gay, N. J., Symmons, M. F., Gangloff, M., Bryant, C. E.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Nanopartikel ScreeningTHP 1 ReporterzellenSEAP Luciferase AssayPeptid Gold Nanopartikel HybridNF kappaB AP1 AktivierungIRF Luciferase AssayImmunoblotting ValidierungTherapie entz ndlicher Erkrankungen

Verwandte Artikel