Methodenartikel

Ein modifiziertes Hefe-ein-Hybrid-System für Heteromere Protein-Komplex-DNA-Interaktionsstudien

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DOI:

10.3791/56080

⸱

24. Juli 2017

 ,  , 
1Department of Neurology, University of Southern California, 2Section of Cell and Developmental Biology, University of California San Diego

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Der hier beschriebene modifizierte Hefe-Ein-Hybrid-Assay ist eine Erweiterung des klassischen Hefe-Ein-Hybrid- (Y1H) -Assays, um die heteromere Protein-Komplex-DNA-Wechselwirkung in einem heterologen System für jede funktionelle Genomforschung zu untersuchen und zu validieren.

Zusammenfassung

Im Laufe der Jahre hat sich der Hefe-Ein-Hybrid-Assay als eine wichtige Technik zur Identifizierung und Validierung von physikalischen Wechselwirkungen zwischen Proteinen wie Transkriptionsfaktoren (TFs) und deren DNA-Ziel erwiesen. Die hier vorgestellte Methode nutzt das zugrunde liegende Konzept des Y1H, wird aber modifiziert, um Protein-Komplexe, die an ihre Ziel-DNA binden, zu untersuchen und zu validieren. Daher wird es als der modifizierte Hefe-Ein-Hybrid (Y1.5H) -Assay bezeichnet. Dieser Assay ist kostengünstig und kann in einem regelmäßigen Laboratorium leicht durchgeführt werden. Unter Verwendung eines heterologen Systems könnte die beschriebene Methode ein wertvolles Werkzeug sein, um den heteromeren Proteinkomplex zu testen und zu validieren, der an ihre DNA-Ziel (e) für die funktionelle Genomik in jedem System der Studie, insbesondere der Pflanzengenomik, bindet.

Einleitung

Im Allgemeinen, um Protein-DNA-Wechselwirkungen zu verstehen, ist der Y1H-Assay das bevorzugte System, das erfolgreich in einer Laboreinstellung verwendet wird 1 . Der basische Y1H-Assay umfasst zwei Komponenten: a) ein Reporter-Konstrukt mit DNA von Interesse erfolgreich kloniert stromaufwärts eines Gens, das für ein Reporterprotein kodiert; Und b) ein Expressionskonstrukt, das ein Fusionsprotein zwischen dem interessierenden TF und einer Hefe-Transkriptions-Aktivierungsdomäne (AD) erzeugt. Die DNA von Interesse wird gemeinhin als "Köder" bezeichnet, während das Fusionsprotein als "Beute" bekannt ist. In den vergangenen Jahren wurden mehrere Versionen des Y1H-Assays entwickelt, um den spezifischen Bedürfnissen mit ihren eigenen Vorteilen gerecht zu werden 2 . Der bestehende Y1H-Assay kann erfolgreich implementiert werden, um die Interaktion eines Proteins zu einem Zeitpunkt mit seinem DNA-Köder zu identifizieren und zu validieren, aber es fehlt die Fähigkeit, heterodimere oder multimere Protein-DNA-Wechselwirkungen zu identifizieren.

"> Die hier beschriebene Methode ist eine modifizierte Version der vorhandenen Y1H, die es Forschern ermöglicht, gleichzeitig mehrere Proteine ​​zu untersuchen, die an ihre Ziel-DNA-Sequenz (en) binden. Ziel dieses Assays ist es, das Protein von Interesse mit einer Aktivierungsdomäne (pDEST22: TF) und die Aktivierung der an einen Reporter fusionierten Kandidaten-DNA-Regionen in Gegenwart und / oder Abwesenheit des wechselwirkenden Protein-Partners (pDEST32ΔDBD-TF) im Hefe-System aus. Dieser Assay erlaubt es uns zu bestimmen, ob die Wechselwirkung zwischen diesen beiden ist Proteine ​​sind für die Aktivierung des Ziels erforderlich, ein GATEWAY Klonierungs-kompatibles System und daher in einer regelmäßigen Laborumgebung möglich. Das Thisprotokoll basiert auf einer direkten Transformation, die die Einfachheit der Co-Transformation verschiedener TFs in einem Hefe-System ermöglicht So ist es eine vorteilhafte Strategie, die Proteinkomplexe, die an ihre möglichen DNA-Targets binden, für die in vitro molekulare und funktionelle Validierung zu bestimmenOder irgendein System. Aktuelle Techniken wie Tandem Affinitätsreinigung (TAP) sind kostspielig und arbeitsintensiv, erlauben aber den Nachweis von Protein-Hetrocomplexen im großen Maßstab 3 , 4 , 5 . Dieser modifizierte Hefe-Ein-Hybrid kann in einer regelmäßigen Laboreinstellung im kleinen Maßstab erfolgreich durchgeführt werden ( Abbildung 1 ) und ist auch kostengünstig. Der Y1.5H-Assay kann Forschern in der gesamten Gemeinschaft helfen, ihre Hypothese zu testen und zu validieren, um die Rolle der multimeren Protein-Komplexbindung an ein gemeinsames DNA-Ziel unter Verwendung eines heterologen Systems zu definieren. Basierend auf den Befunden konnte die Hypothese in vivo im bevorzugten Studiensystem validiert werden . In letzter Zeit haben wir diesen Ansatz verwendet, um die Rolle eines TF und seiner Wirkungsweise zu definieren, um die Blüte in Arabidopsis zu regulieren 6 .

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Protokoll

1. Konstruieren und Reporter Plasmid Vorbereitung

  1. PCR amplifizieren die Promotorregionen / "Fragmente" (vorzugsweise ~ 250 - 500 bp) der zu analysierenden Ziel-DNA zur weiteren Klonierung in den Eingangsvektor unter Verwendung von E. coli (TOP10).
  2. Nach der Sequenzierungsbestätigung subclonieren Sie den positiven Klon in einem kompatiblen pGLacZi-Expressionsvektor 7 wie zuvor beschrieben 8 , 9 , 10 , 11 .
  3. Verwandeln Sie den Hefestamm für die Promotorintegration (YM4271) durch homologe Rekombination von pGLacZi, um einen Hefe-Reporter-Stamm zu erzeugen, wie zuvor beschrieben 12 , 13 . Die Transformations- und Bestätigungsschritte des Hefestammes mit dem DNA-Bereich zusammen mit dem Rezept des Mediums werden hier nicht beschrieben, da die Schritte dem klassischen Y1H-Protokoll ähnlich sindAss = "xref"> 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Die pEXP-AD502 Kontrollplasmid für Normalisierungszwecke verwendet werden , während β-Galactosidase - Aktivität , wie zuvor quantifiying 8 beschrieben.
  4. Klonen Sie das TF oder Protein von Interesse und klonieren Sie anschließend den interagierenden Protein-Partner in pDEST22 und pDEST32ΔDBD (pDEST32 minus DNA Binding Domain) Expressionsvektoren. Die transformierten Hefe-Promotor-Fragmente und die TF-Klone werden anschließend weiter im Protokoll verwendet.

2. Modifiziertes Y1.5H-Protokoll

  1. Am Tag 1 (Nachmittag) beginnen Sie mit 5 ml Kultur in SD-Ura aus einer Petrischale oder Glycerin-Stamm und über Nacht in einem 30 ° C-Shaker inkubieren.
    ANMERKUNG: Diese Kultur kann von einer frisch gestreiften Platte oder direkt von einem 25% oder 30% Glycerinbestand der Hefe gestartet werdenKlon mit dem DNA-Fragment.
  2. Am Tag 2 (Nachmittag) werden 10 ml YPDA-Medium mit 500 & mgr; l der Übernachtkultur inokuliert und über Nacht in einem 30 ° C-Schüttler inkubiert.
  3. Tag 3 (früh am Morgen und ganzer Nachmittag): Bereiten Sie kompetente Zellen (früh am Morgen) vor.
    1. 100 ml YPDA-Medium mit den 2 ml der Übernachtkultur inokulieren und in einem 30 ° C-Schüttler inkubieren. Diese frische Kultur wachsen, bis die OD 600 0,4-0,8 (3-5 h) erreicht.
      HINWEIS: Überprüfen Sie die OD 600 der Übernachtkultur und stellen Sie sicher, dass der Startpunkt OD 600 für diesen Schritt 0,1 - 0,2 beträgt. Die Verwendung von über- oder untergewachsenen Kultur kann das Experiment verlängern.
    2. 5 min bei 1000 xg und 21 ° C zentrifugieren. Den Überstand verwerfen.
    3. Reagenzgläser in 10 ml sterilem Wasser unter Verwendung eines Wirbels oder Pipettierens auf und ab.
    4. 5 min bei 1000 xg und 21 ° C zentrifugieren. Den Überstand verwerfen.
    5. RekonstituierenPellets in 2 ml Tris-Ethylendiamintetraessigsäure (TE) / Lithiumacetat (LiAc) unter Verwendung eines Wirbels oder Pipettierens nach oben und unten.
      HINWEIS: Bitte beachten Sie das Rezept für TE / LiAc in Tabelle 1 .
    6. Zentrifuge für 5 min 1000 xg und 21 ° C. Den Überstand verwerfen.
    7. Pellet in 4 ml TE / LiAc + 400 μl Lachssperma-DNA (10 mg / mL) nach oben und unten pipettieren und mit dem nächsten Schritt fortfahren.
  4. Co-Transformation: Hitze schock die Zellen (spät am Nachmittag)
    1. 20 μl Zellen pro Vertiefung in einer 96-Well-Mischplatte (U-Boden) verteilen.
    2. Zugabe von 150 ng (~ 1,5 μL) des pDEST22: TF-Plasmids, pDEST32ΔDBD: TF-Plasmid und pEXP-AD502 plus pDEST32ΔDBD: TF (Normalisierungskontrolle) zu den Vertiefungen.
      HINWEIS: Es werden optimale Ergebnisse mit ~ 150 ng von jeweils pDEST22: TF und pDEST32ΔDBD: TF-Plasmid für eine erfolgreiche Co-Transformation erwartet. Kann mit Konstrukt- und Plasmidausdrücken variierenMuss bei jedem experiment optimiert werden Eine weitere Steuerung pDEST22-TF plus pDEST32deltaDBD kann auch nach eigenem Ermessen aufgenommen werden.
    3. 100 μl TE / LiAc / Polyethylenglykol (PEG) pro Vertiefung zugeben ( dreimal mischen ).
      HINWEIS: Bitte beachten Sie das Rezept für TE / LiAc / PEG in Tabelle 1 .
    4. Die Platte mit einer atmungsaktiven Dichtung bedecken und für 20 - 30 min (länger dauern) bei 30 ° C inkubieren (keine Rührung erforderlich).
    5. Hitzeschock für 20 min ( genau ) bei 42 ° C.
  5. Tafeln Sie die Zellen.
    1. 5 min bei 1000 xg und 21 ° C zentrifugieren. Den Überstand mit einer Mehrkanalpipette entfernen. Zugabe von 110 μl TE und mischen.
    2. 5 min bei 1000 xg und 21 ° C zentrifugieren. 100 μl des Überstandes mit einer Mehrkanalpipette entfernen. Das Pellet mit dem Puncher wieder suspendieren.
    3. Übertragen von Zellen auf SD-Trp-Leu- Agarplatten. Inkubieren von PlattenBei 30 ° C bis zum nächsten Schritt
  6. Tag 5 (nachmittags): Übertragen Sie die Zellen auf neue Platten mit Puncher / Mikroplattenreplikator.
    1. Füllen Sie eine sterile 96-Well-Mischplatte (U-Boden) mit 50 μl TE mit einer Mehrkanalpipette. Den Puncher in TE vornässen
      HINWEIS: Der Puncher oder der Mikroplattenreplikator sollte vor diesem Schritt und anschließend später im Protokoll sterilisiert werden. Die übliche Art des Sterilisierens des Punchers, wie das Eintauchen in Ethanol (100%, nicht molekularbiologischer Grad) und dann das Brennen in die Flamme, kann angewendet werden. Warten Sie 1 min, um die Puncher-Stifte abzukühlen.
      Achtung: Bei der Sterilisation auf der Bank; Sicherstellen, dass die Bank mit Ethanol vorgereinigt und frei von brennbaren Stoffen ist. Tragen Sie eine persönliche Schutzausrüstung (PSA).
    2. Stanzkolonien und wieder suspendieren in TE-gefüllte Platte.
      HINWEIS: Wenn es ein glattes Wachstum auf der Platte gibt, können Kolonien direkt gestanzt werdenAuf die TE-gefüllte Platte oder alternativ sollte einzelne Kolonie (bei mehreren Kolonien) mit einem sterilisierten Zahnstocher auf die TE-gefüllte Platte gepickt werden und anschließend kann der Puncher für den nächsten Schritt verwendet werden.
    3. Übertragen Sie sie auf neue SD-Trp-Leu- Agarplatten für optimale Flächendeckung. Inkubieren Sie die Platten bei 30 ° C bis zum nächsten Schritt.
  7. Tag 7 (Nachmittag): Kultur starten, um die β-Galactosidase-Aktivität zu messen.
    1. Füllen Sie eine sterile 96-Well-Mischplatte (U-Boden) mit 50 μl SD-Trp-Leu- Medium mit einer Mehrkanalpipette.
    2. Füllen Sie einen sterilen 96-tiefen Brunnenblock mit 180 μl SD-Trp-Leu- Medien mit einer Mehrkanalpipette.
    3. Den Puncher in den Medien vorbereiten und die Kolonien von der Platte auf die 50 μl Medien auftragen.
    4. Übertragen Sie 20 μl Hefe auf die 180 μl SD-Trp-Leu- Medien und versiegeln den Block mit einer atmungsaktiven Dichtung. InkubierenFür 36 h bei 30 ° C Schüttler.
  8. Tag 9 (Morgen): Beginne die Kultur für die enzymatische Messung.
    1. Übertragen Sie 100 & mgr; l Kultur auf 500 & mgr; l YPDA-Medium in einem sterilisierten 96-tiefen Bohrlochblock.
    2. Die sterilisierte Tiefbrunnenplatte mit einer atmungsaktiven Dichtung abdecken und für 3 - 5 h bei 30 ° C unter Rühren bei 200 U / min (bis OD 600 0,3-0,6) inkubieren.
    3. Kultur erneut suspendieren und 125 μL unter Verwendung einer Mehrkanalpipette auf einer Spektrophotometerplatte (Maß OD 600 ) übertragen.
      HINWEIS: Achtung: Vermeiden Sie den letzten Tropfen, um Blasen zu vermeiden, wenn der OD 600 unter 0,3 - 0,6 liegt, inkubieren Sie die restlichen Zellen für 1 - 2 h mehr, je nach dem Lesen. Die bei diesem Schritt verwendete 125 & mgr; l-Kultur kann nach dem Ermessen des Benutzers verworfen oder auf den ursprünglichen Tiefbrunnenblock zurückgeführt werden.
    4. Die restlichen Zellen im Tiefbrunnenblock 10 min bei 3000 xg und 21 ° C zentrifugieren. Supernatan entfernenT durch invertieren.
    5. 200 μl Z-Puffer zugeben und vortexen.
      HINWEIS: Bitte beachten Sie das Rezept für Z-Puffer in Tabelle 1 .
    6. 5 min bei 3000 xg und 21 ° C zentrifugieren. Den Überstand durch Invertieren entfernen.
    7. 20 μL Z-Puffer hinzufügen und vortexen.
    8. Die Platte mit Dichtfolie abdecken, die Frost-Tau-Zyklen widerstehen kann. Führen Sie 4 Zyklen von Frost / Tauwetter mit flüssigem Stickstoff in einem Dunstabzug und dann 42 ºC in einem Wasserbad (jeweils 2 min).
    9. Zugabe von 200 μl Z-Puffer / Beta-Mercaptoethanol (β-ME) / Ortho-Nitrophenyl-β-galactosid (ONPG) (12 ml, 21 μl, 8,4 mg ergeben 20 ml Lösung, immer frisch zubereiten ).
      HINWEIS: ONPG wird sich etwas Zeit nehmen, um sich richtig aufzulösen, so dass die Lösung eine Stunde vor dem Erreichen dieses Schrittes vorbereitet wird. ONPG dient als Substrat für die Messung der β-Galactosidase-Aktivität.
    10. Inkubieren Sie bis zu 17 - 24 h bei 30 ° C (Check-in, wenn die Farbe früher entwickelt wirdWeiter zum nächsten Schritt).
  9. Tag 10 (Morgen): Stoppen Sie die Reaktion und messen Sie.
    1. Füge 110 μl 1M Na 2 CO 3 hinzu , um die Reaktions- und Aufzeichnungszeit zu stoppen.
    2. Vortex und 10 min bei 3000 xg und 21 ° C zentrifugieren.
    3. Nehmen Sie 125 μl Überstand mit Mehrkanal und messen Sie OD 420 .
      HINWEIS: Achtung, den letzten Tropfen nicht abgeben, um Blasen zu vermeiden.
    4. Berechnen Sie die β-gal-Aktivität: 1000 x OD 420 / (Zeit (min) x Volumen (mL) x OD 600 in einer Kalkulationstabelle.

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Ergebnisse

Das allgemeine Plattenaufbauprozess für die Co-Transformation von DNA-Regionen in den Hefezellen mit Protein von Interesse ( Abbildung 2 ). Der Plattenaufbau kann entsprechend der Notwendigkeit des Experiments und der Anzahl der untersuchten DNA-Regionen / Fragmente modifiziert werden. Nach dem Tag-5 des Protokolls sollte eine gut gewachsene und positive Platte sichtbar sein wie in Abbildung 3 . In unserer Studie wurde die Promo...

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Diskussion

Das bestehende Y1H-Standardverfahren eignet sich zur Identifizierung einer einzigen Protein-Beute-Bindung an seinen DNA-Köder. Mit verschiedenen technischen Modifikationen wurde das bestehende System zur Definition von Transkriptionsregulierungsnetzwerken eingesetzt. Es ist jedoch bekannt, dass TFs als Teil von Komplexen mit zwei oder mehr TFs oder Proteinen fungieren, wobei nur ein Teil der TF an die DNA binden kann. Proteine ​​oder TFs, die nur die Protein-bindenden Domänen besitzen und die Fähigkeit besitzen, an DNA ...

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Offenlegungen

Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

Wir danken SS Wang, M. Amar und A. Galla für die kritische Lektüre des Manuskripts. Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde vom Nationalen Institut für Allgemeine Medizinische Wissenschaften der National Institutes of Health unter den Auszeichnungsnummern RO1GM067837 und RO1GM056006 (an SAK) unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health dar.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
pDEST22 vectorInvitrogenPQ1000101Pro-Quest Two Hybrid-System-Kit
pDEST32delatDBDInvitrogenPQ1000102Pro-Quest Two Hybrid-System-Kit; dieses Vecor ist modifiziert. Es handelt sich um pDEST32 minus DNA-Bindung Domäne
pENTR/D-TOPO KlonierungskitInvitrogenK240020
YM4271 StammClontechK1603-1MATCHMAKER One-Hybrid System
pEXP-AD502InvitrogenPQ1000101Pro-Quest Two Hybrid System Kit
GATEWAY LR Clonase II EnzymmixInvitrogen11791020
YPDA MedienClontech630410
SD-AgarClontech630412
SD minimal mediaClontech630411
Uracil DO SupplementClontech630416
Tryptophan Do SupplementClontech630413
Tris BaseFisherScientific BP152-1
EDTAFisher ScientificS311-500
LiAcSigma-AldrichL4158
Saplmon Sperma (10mg/ml)Invitrogen15632011
96 Well runde BodenplatteGreiner bio-one650101 PEG3350
Sigma-Aldrich1546547
96 Deep Well BlockUSA Scientific1896-2000
Siegelbare FolieUSA Scientific2923-0110
ArasealExcel ScientificB-100
2-MercaptoethanolFisher Scientific034461-100
ONPGSigma-Aldrich73660
Na2CO3Sigma-Aldrich223484
Na2HPO4 Sigma-AldrichS3264
NaH2PO4 Sigma-AldrichS3139
KCLFisher ScientificBP366-500
MgSO4 Sigma-Aldrich83266
HCLFisher ScientificSA54-4
TrockenbadThermo Fischer
VoretxThermo Fischer
ZentrifgeEppendorfCentrifuge 5810R
Plate ReaderMolekulares GerätSPECTRAMAX PLUS Mikrotiterplatten-Spektralphotometer
InkubatorThermo FisherModell Nr. 5250- 37 Grad, 6250-30 Grad
Shaker InkubatorNew Brunswick
WasserbadThermo FisherIsoTemp 205
Puncher
50 ml FalocnBD Falcon
BecherNalgene
FlascheNalgene
Petriplatten (150mm)Greiner bio-one

Referenzen

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Schlagwörter

TranskriptionsfaktorbindungHefetransformationBeta Galactosidase AssaySD Medium DropoutCo TransformationsprotokollFrost Tau ZyklenFunktionelle Genomik

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