Zellwanderung in dreidimensionales In Vitro Charakterisierung Wunde Umgebungen

Summary

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Wirkung der Pro und anti migratory Faktoren auf Zellwanderung innerhalb einer dreidimensionalen Fibrin-Matrix bewerten.

Abstract

Derzeit die meisten in-vitro- Modelle der Wundheilung, wie etablierte Scratch-Assays, Studium Zelle Migration und Wunde Schließung auf zweidimensionalen Flächen beinhalten. Allerdings ist die physiologische Umgebung welche in Vivo Wundheilung erfolgt dreidimensional als zweidimensionale. Es wird immer deutlicher, dass Zelle Verhalten unterscheidet sich stark in zweidimensionalen vs. dreidimensionale Umgebungen; Daher gibt es eine Notwendigkeit an mehr physiologisch relevanten in-vitro- Modelle für das Studium Zelle Migration Verhaltensweisen in Wundverschluss. Die hier beschriebene Methode ermöglicht das Studium der Zellwanderung in einem dreidimensionalen Modell, das physiologische Bedingungen besser als vorher festgelegten zweidimensionale Scratch Assays widerspiegelt. Dieses Modell soll Zelle Auswuchs über die Prüfung der Zellmigration Weg ein Sphäroid Körper eingebettet innerhalb einer Fibrin-Matrix im Beisein von Pro oder anti migratory Faktoren zu bewerten. Mit dieser Methode Zelle Auswuchs aus dem Sphäroid Körper in einer dreidimensionalen Matrix beobachtet werden und im Laufe der Zeit durch Brightfield Mikroskopie und Analyse von Sphäroid Körperbereich leicht quantifizierbar ist. Die Wirkung von Pro-wandernde oder hemmende Faktoren auf Zellwanderung kann auch in diesem System ausgewertet werden. Diese Methode bietet eine einfache Methode des Analysierens Zellwanderung in dreidimensionale Wunde verbunden Matrizen in-vitro-Forscher, wodurch sich die Relevanz der in-vitro- Studien Zelle vor der Verwendung von in-Vivo -Tier Modelle.

Introduction

Wundheilung ist ein komplexer Prozess, der die Wiederherstellung der Gewebe Integrität nach Verletzung führt. Dieser Prozess wird in vier überlappende Phasen Blutstillung, Entzündungen, Verbreitung und Umbau, umgeben aufgeteilt die jeweils geregelt sind durch eine komplexe Kombination von löslichen Queues, Zelle-Matrix Interaktionen und Zell-Zell-Kommunikation. ^{1 , 2} die Orchestrierung dieser Signale steuert eine Vielzahl von zellulären Reaktionen bei der Wundheilung einschließlich allem Zellmigration. ^{3 , 4} Zellwanderung ist ein sehr dynamischer Proze....

Protocol

1. Tag1: Zelle und Reagenz Vorbereitung

Hinweis: alle Zell- und Reagenz Vorbereitung sollte in einem biologischen Sicherheitsschrank gegen Kontamination der Proben durchgeführt werden.

1. Warm gefiltert Dulbecco ' s Modified Eagle ' s Medium (DMEM), fetale bovine Serum (FBS), L-Glutamin und Penicillin/Streptomycin in einem 37 ° C Wasserbad.
2. Vorbereiten Neugeborenen menschlichen dermalen Fibroblasten (HDFn) Medien durch Ergänzung erwärmt DMEM mit 10 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin und 1 % L-Glutamin.
3. Tauwetter ein Fläschchen mit gefrorenen HDFns und Zentrifuge für 8 min. bei 200 X g Kryokonservierung M....

Results

Sphäroid Kultur kann genutzt werden, um die Wirkung der pro und Anti-wandernde Agenten auf Fibroblasten Migration in-vitro-erfolgreich bewerten
3D Fibroblasten Sphäroide können gebildet werden, über hängende Tropfen Kultur über einen Zeitraum von 72 h (Abbildung 1). Im Anschluss an die Kulturdauer Sphäroide innerhalb der Gerinnsel-Matrix eingebettet sind und abgebildet mit Brightfield Mikroskopie (Abbildung 2).......

Discussion

Dieses Protokoll ermöglicht die Prüfung der Zellwanderung in der Wundheilung ECMs über eine in-vitro- 3D Modell zugeordnet. Ein entscheidender Schritt für die ordnungsgemäße Durchführung des Verfahrens ist die richtige Entwicklung der Fibroblasten Sphäroide; Zellkonzentration während der Vorbereitung wurde optimiert, um eine Ausgangskonzentration von 2.500 Zellen/Tropfen, geben so dass Sphäroide zu bilden zuverlässig über eine Inkubationszeit von 72 h. Wenn eine unzureichende Anzahl von Zellen verwendet werden, .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4,5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvat, ohne L-Glutamin	VWR	VWRL0148-0500	DMEM, das bereits L-Glutamin enthält, kann auch verwendet werden
100mm Gewebekulturschale, unbehandelt, sterilisiert, nicht pyrogen	VWR	10861-594	Schalen jeder Größe können zum Aufhängen von Tropfenkulturen verwendet werden
Fötales Rinderserum aus USDA-zugelassenen Ländern, hitzeinaktiviert, steril gefiltert, zellkulturgetestet	Sigma-Aldrich	12306C-500ML
L-Glutamin	Fisher Scientific ICN1680149		Nicht erforderlich, wenn DMEM verwendet wird, das bereits L-Glutamin enthält
Penicillin-Streptomycin-Lösung, stabilisiert, steril filtriert, mit 10.000 Einheiten Penicillin und 10 mg Streptomycin/ml	Sigma-Aldrich	P4333-100ML
Humane dermale Fibroblasten, Neugeborene	Thermo Fisher	C0045C	Kann durch einen anderen Zelltyp von Interesse ersetzt werden
21 G x 1 1/2' Nadel	BD	305167	22 G x 1 1/2 Nadeln funktionieren auch
1 mL Spritze	VWR	89174-491	Spritzen beliebiger Volumina können verwendet werden
Zellkultur-Multiwell-Platten, Polystyrol, Greiner Bio-One (individuell verpackt) (48 Wells)	VWR	82051-004
Humanes Fibrinogen - Plasminogen, Von-Willebrand-Faktor und Fibronektin Depleted	Enzyme Research Laboratories	FIB 3	Kann durch Matrixprotein von Interesse ersetzt werden
Human Alpha Thrombin	Enzyme Research Laboratories	HT 1002a	Abhängig vom Matrixprotein von Interesse ist möglicherweise nicht erforderlich
Equipment
BSL2 Zellkulturhaube
Zellkultur-Inkubator
Inverses Mikroskop mit 10-fach Objektiv
Zentrifugen-kompatibel mit 15-ml-Röhrchen